本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
痛風(fēng)(gouty)，又稱痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis)，是體內(nèi)嘌呤代謝紊亂所致的疾病，表現(xiàn)為血中尿酸過多，易于使尿酸鹽(MSU)在關(guān)節(jié)等組織析出結(jié)晶。痛風(fēng)的急性發(fā)作是由于沉積在關(guān)節(jié)的MSU引起中性粒細胞局部浸潤和炎性反應(yīng)。
西藥在痛風(fēng)急性發(fā)作期選用三種藥：秋水仙堿、非甾體抗炎藥和腎上腺皮質(zhì)激素。秋水仙堿的作用機制是與中性粒細胞的微管蛋白結(jié)合，從而妨礙粒細胞的活動，抑制粒細胞浸潤。非甾體抗炎藥如吲哚美辛，抑制環(huán)氧酶(COX)活性而發(fā)揮抗炎作用，以及選擇性COX2抑制藥。它們雖然消炎止痛作用快，但毒副作用也相當明顯，如秋水仙堿的有效劑量與產(chǎn)生腹瀉等胃腸道癥狀的劑量相近，非甾體抗炎藥在有活動性消化性潰瘍、胃腸道出血情況下絕對禁用，而保泰松用藥短至3周也可致嚴重的粒細胞減少癥或再生障礙性貧血。
從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
本發(fā)明涉及的化合物I是一個2009年發(fā)表(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的化合物，我們對化合物I進行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗抗急性痛風(fēng)活性進行了評價，其具有抗急性痛風(fēng)活性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分數(shù)分別為30％和70％。
本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明用尿酸鈉(MSU)致人血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)損傷的急性痛風(fēng)模型評價顯示，本發(fā)明組合物對MSU致HUVEC損傷具有保護作用，并抑制ICAM-1表達，可用于制備治療急性痛風(fēng)炎癥藥物。本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明組合物在醫(yī)學(xué)中的新用途，具體地說是涉及本發(fā)明組合物在制備治療急性痛風(fēng)藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理研究說明，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是MSU引起中性粒細胞局部浸潤和炎性反應(yīng)，急性痛風(fēng)產(chǎn)生的本質(zhì)是中性粒細胞(PMN)-血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)黏連增強(Terkeltaub R，et al.The murine homolog of the interleukin-8receptorcxcr-2is essential for the occurrence of neutrophilic inflammation in air pouch model of acute urate crystal-induced gouty synovitis.Arthritis Rheum,1998,41(5):900-909.)，HUVEC損傷，其分子生物學(xué)基礎(chǔ)在于PMN與HUVEC表面黏附分子的相互作用(FujiwaraY,et al.Interleukin-8stimulates leukocyte migration across amonolayer of cultured rabbit NF-α,IL-1β,IL-8,and IL-1rain Monosodium Urate Crystal induced rabbit arthritis.Labinvest,19998,78(5):559-569.)，其中細胞間黏附分子-1(ICAM-1)與粘附功能關(guān)系最密切，是急性痛風(fēng)炎癥的重要指標之一(張春，唐怡，劉軍，等.痛風(fēng)靈方對尿酸鈉致大鼠模型關(guān)節(jié)軟組織ICAM-1表達的影響，重慶醫(yī)學(xué)，2002,31(12)：1211-1213.)。
因此，針對急性痛風(fēng)MSU致HUVEC損傷，ICAM-1表達增多的病理特征，本發(fā)明用MSU致HUVEC損傷的體外急性痛風(fēng)模型(楊妍華，尹蓮，王明艷，等.尿酸鈉誘導(dǎo)HUVEC損傷的急性痛風(fēng)模型研究，中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010,28(3)：592-594.)，評價本發(fā)明組合物抗急性痛風(fēng)炎癥活性。MSU致人血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)損傷的急性痛風(fēng)模型評價顯示，本發(fā)明組合物對MSU致HUVEC損傷具有保護作用，并抑制ICAM-1表達。
有益效果
研究結(jié)果表明，用MSU致HUVEC損傷的急性痛風(fēng)模型評價顯示，本發(fā)明組合物可保護MSU致HUVEC損傷，減少細胞凋亡，提高細胞活性，抑制ICAM-1表達，具有抗急性痛風(fēng)炎癥的活性，本發(fā)明組合物可用于制備治療急性痛風(fēng)炎癥藥物。
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
具體實施方式
實施例1化合物Harrisotone A的制備
化合物Harrisotone A(I)的制備方法參照Sheng Yin等人發(fā)表的文獻(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的方法。
實施例2 Harrisotone A的O-溴乙基衍生物(II)的合成
將化合物I(472mg，1.00mmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌3h。3h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然后對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌2次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(602mg，76％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.18(s,2H),4.56(s,2H),3.93(d,J＝16.7Hz,4H),3.79(s,2H),3.62(d,J＝0.9Hz,4H),3.15(s,2H),2.48(s,2H),2.41(d,J＝9.4Hz,4H),2.27(s,1H),1.95(s,1H),1.88–1.80(m,8H),1.77(d,J＝15.5Hz,7H),1.68(s,1H),1.61(s,1H),1.51(s,1H),1.25(d,J＝58.1Hz,1H),1.15–0.75(m,6H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.46(s),198.24(s),195.44(s),190.27(s),135.27(s),120.09(s),115.02(s),84.45(s),76.58(s),74.12(s),63.67(s),62.76(s),60.36(s),50.96(s),45.22(s),39.69(s),36.61(s),34.40(s),32.63(s),30.81(d,J＝8.9Hz),28.77(s),25.30(s),24.09(d,J＝19.2Hz),22.77(s),18.20(s).
HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for C34H50Br3O6:793.1137；found 793.1134.
實施例3 Harrisotone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物(III)的合成
1、Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的合成
將化合物II(396mg，0.5mmol)溶于22mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(690mg，5.0mmol)，碘化鉀(252mg，1.5mmol)和二乙醇胺(1051mg，10mmol)，混合物加熱回流3h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入25mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，收集淡棕色集中洗脫帶即得到Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的棕色固體(324.4mg,75％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.17(s,2H),4.27(s,2H),3.56(d,J＝2.7Hz,4H),3.38(d,J＝83.1Hz,14H),3.08(s,2H),3.04(s,4H),2.76–2.66(m,5H),2.61(s,12H),2.57(s,2H),2.40(s,3H),2.05(s,1H),1.93(s,1H),1.91–1.81(m,8H),1.76(d,J＝15.5Hz,7H),1.68(s,1H),1.61(s,1H),1.51(s,1H),1.28(s,2H),1.18(d,J＝12.0Hz,7H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.46(s),198.23(s),195.44(s),190.26(s),135.27(s),120.08(s),115.02(s),84.44(s),76.58(s),66.89(s),62.74(s),60.37(s),60.13(s),59.31(s),56.85(s),53.89(s),53.08(s),50.95(s),45.22(s),39.68(s),36.61(s),30.80(d,J＝8.9Hz),28.77(s),25.29(s),24.09(d,J＝19.2Hz),22.76(s),18.20(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C46H80N3O12:866.5742；found:866.5737。
Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物
2、Harrisotone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物(III)的合成
合成足夠多的Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物，將Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物(0.433g，0.5mmol)溶于4mL氯仿，逐滴加入氯化亞砜(2.38g，20mmol)，反應(yīng)物加熱回流2h。將反應(yīng)物冷卻至室溫，滴加甲醇分解過量的氯化亞砜，減壓濃縮除去溶劑。產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:0.3，v/v)，得到化合物III的淡黃色固體(302.3mg，62％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.14(s,2H),4.22(s,2H),3.68(d,J＝5.8Hz,12H),3.54(d,J＝5.3Hz,4H),3.06(s,2H),3.05(s,2H),3.03–2.68(m,18H),2.54–2.29(m,4H),2.24–2.05(m,1H),1.94(s,1H),1.90(s,1H),1.81(d,J＝5.0Hz,7H),1.71(d,J＝15.5Hz,7H),1.65(s,1H),1.56(s,1H),1.48(s,1H),1.15(d,J＝12.5Hz,7H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.12(s),197.88(s),195.10(s),189.91(s),134.93(s),119.73(s),114.68(s),84.09(s),76.24(s),66.54(s),62.40(s),60.02(s),59.79(s),55.91(s),53.54(s),52.74(s),50.60(s),44.88(s),39.33(d,J＝0.9Hz),36.27(s),30.45(d,J＝8.9Hz),28.43(s),24.94(s),23.75(d,J＝19.2Hz),22.41(s),17.86(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C46H74Cl6N3O6:976.3679；found:976.3675。
實施例4 Harrisotone A的O-(二(2-甲硫基乙基))乙基衍生物的合成
制備足夠多的化合物III，將化合物III(0.488g，0.5mmol)溶于15mL乙醇，室溫下加入甲硫醇鈉(2.1g，30mmol)，反應(yīng)物加熱回流1h。減壓濃縮除去溶劑，所得產(chǎn)物用硅膠柱層析進行純化(石油醚/丙酮100:0.4，v/v)，得到黃色固體物，即化合物IV(0.350g，67％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.15(s,2H),4.23(s,2H),3.54(d,J＝11.2Hz,4H),3.41(s,2H),3.06(s,2H),3.01–2.51(m,29H),2.37(s,3H),2.26–1.99(m,21H),1.90(s,1H),1.85–1.72(m,8H),1.70(s,6H),1.65(s,1H),1.55(d,J＝13.0Hz,2H),1.48(s,1H),1.41(s,1H),1.14(s,6H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.26(s),198.02(s),195.24(s),190.05(s),135.07(s),119.87(s),114.82(s),84.23(s),76.38(s),66.68(s),62.54(s),60.16(s),59.93(s),53.68(s),52.88(s),52.39(s),50.74(s),45.02(s),39.47(s),36.41(s),32.12(s),30.59(d,J＝8.9Hz),28.57(s),25.08(s),23.89(d,J＝19.2Hz),22.55(s),18.00(s),14.74(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C52H92N3O6S6:1046.5310；found:1046.5303。
實施例5組合物抗急性痛風(fēng)炎癥實驗
1、溶液配制
5g尿酸加1000ml蒸餾水煮沸，加5％NaOH溶液調(diào)PH 7.4，攪拌，冷卻析晶制成尿酸鈉結(jié)晶(MSU)。將制好的MSU 10mg高壓滅菌，加不含血清的DMEM培養(yǎng)液10ml，研磨配成1mg/ml的DMEM溶液。實驗時，此溶液再加DMEM培養(yǎng)液配成不同濃度DMEM的MSU溶液。
組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的30mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的70mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。
組合物、化合物III或者化合物IV 2.5mg，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，DMSO終濃度<0.02％，再加無血清的DMEM培養(yǎng)液，配制成濃度25ug/ml。
2、血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)
人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVEC株由南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供，細胞經(jīng)支原體檢測，無支原體污染，細胞經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化，含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中和，離心(1000r/min×6min)，去上清液，加含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，移入細胞培養(yǎng)瓶中，放37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。
3、對MSU刺激HUVEC活力的影響
HUVEC在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待生長至70％～80％融合時，以0.25％胰蛋白酶消化、離心，10％小牛血清DMEM培養(yǎng)液洗滌3次，用10％小牛血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)成4×104/ml細胞懸液，植入96孔板(每孔200ul)，培養(yǎng)24小時后輕吸出原培養(yǎng)液，進行以下實驗，每組各8孔，具體分組及加液如下：對照組(200ul DMEM培養(yǎng)液)、模型組(100ug/ml MSU溶液)、干預(yù)組(100ug/ml MSU溶液+25ug/ml的組合物或者化合物)，加液后繼續(xù)放37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，收集上清液，剩余的HUVEC用于測定細胞活性，每孔再加5mg/ml MTT液20ul，繼續(xù)放37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后，棄MTT液，加入二甲基亞砜200ul溶解，震蕩，于酶標儀讀取吸光度值，波長490nm。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理，細胞活力(％)＝實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100％，結(jié)果見表1。
與對照組相比，模型組細胞活力顯著減小(P<0.05)，組合物干預(yù)后細胞活力顯著提高(P<0.05)，并強于對照組，而化合物III和化合物IV無此活性。
表1組合物對MSU刺激的血管內(nèi)皮細胞活力的影響
注：與模型組相比，*P<0.05；與對照組相比，△P<0.05
4對ICAM-1表達影響
將處于對數(shù)生長期的HUVEC用0.25％的胰蛋白酶消化，輕輕吹打，制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×109/L，接種于細胞培養(yǎng)瓶中。待細胞長滿后(約24h)，棄去上清液，分為下列組：對照組、模型組(100ug/ml MSU溶液)、干預(yù)組(100ug/ml MSU溶液+25ug/ml組合物或者化合物)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，PBS收集細胞，離心去上清，加入CD54單克隆抗體，30min后，PBS洗滌，重懸細胞，應(yīng)用流式細胞儀檢測其陽性細胞百分率(n＝10000)，重復(fù)3次，結(jié)果見表2。
表2組合物對MSU刺激的血管內(nèi)皮細胞ICAM-1表達的影響
注：與模型組相比，*P<0.05；與對照組相比，△P<0.05
結(jié)果顯示，空白組HUVEC幾乎無ICAM-1表達，模型組ICAM-1的表達最高，與模型組相比，組合物對ICAM-1的表達有顯著的抑制作用，而化合物III和化合物IV無顯著的抑制作用。
結(jié)論：用MSU致HUVEC損傷的急性痛風(fēng)模型評價顯示，組合物可保護MSU致HUVEC損傷，減少細胞凋亡，提高細胞活性，抑制ICAM-1表達，具有抗急性痛風(fēng)炎癥的活性，組合物可用于制備治療急性痛風(fēng)炎癥藥物。而化合物III和化合物IV不能保護MSU致HUVEC損傷，不能減少細胞凋亡，不能提高細胞活性，不能抑制ICAM-1表達，不具有抗急性痛風(fēng)炎癥的活性，不能用于制備治療急性痛風(fēng)炎癥藥物。
實施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。
實施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。