本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的慢性病，目前在全球死亡原因中排名第四，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2020年，COPD將在全球疾病發(fā)病中排名第五，死亡原因中排名第三。
COPD是一種不完全可逆的氣流受限特征的疾病，與肺部對(duì)有害氣體或有毒顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，其慢性炎癥反應(yīng)遍及氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管。參與COPD的細(xì)胞有中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞被激活后釋放多種炎性介質(zhì)，如白三烯B4(LTB4)、白細(xì)胞介素8(IL-8)、RANTES、Eotaxin、腫瘤壞死因子α(TNFα)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)等，參與肺實(shí)質(zhì)破壞、肺血管等炎癥反應(yīng)。病理變化特征表現(xiàn)為肺泡腔炎性細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)浸潤(rùn)、小支氣管和細(xì)支氣管周?chē)钚匝仔约?xì)胞浸潤(rùn)，肺組織邊緣肺泡腔擴(kuò)張、破壞，肺泡壁變寬，其上皮細(xì)胞腫脹、變圓、部分脫落。COPD與慢性支氣管炎和肺氣腫密切相關(guān)，但定義上有所不同，支氣管哮喘與特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)有關(guān)，其氣流受限具可逆性(與慢性氣管炎合并時(shí)會(huì)出現(xiàn)氣流受限不完全可逆)?，F(xiàn)在尚無(wú)藥物能遏制COPD病情的進(jìn)行性發(fā)展，其藥物治療的研究進(jìn)展相當(dāng)緩慢，目前臨床常常將治療哮喘的藥物用于治療COPD，由于COPD的發(fā)病機(jī)制不同于哮喘，難以取得滿意的療效。
從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價(jià)值。
本發(fā)明涉及的化合物I是一個(gè)2009年發(fā)表(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的化合物，我們對(duì)化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個(gè)新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對(duì)該組合物抗慢性阻塞性肺病活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其具有抗慢性阻塞性肺病活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為5％和95％。
本發(fā)明公開(kāi)的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
長(zhǎng)期吸煙是最常見(jiàn)的人類COPD致病因素，我們實(shí)驗(yàn)室用香煙誘導(dǎo)模擬小鼠COPD模型，擬研究本發(fā)明組合物對(duì)香煙誘導(dǎo)的小鼠COPD的緩解作用。
本發(fā)明目的在于提供本發(fā)明組合物在制備抗COPD疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明組合物在劑量10mg/kg下灌胃給藥，對(duì)香煙誘導(dǎo)的COPD小鼠BALF中炎性細(xì)胞因子TNFα的生成有抑制作用；對(duì)趨化因子RANTES的分泌有抑制作用；對(duì)BALF中的炎性細(xì)胞的募集有抑制作用。
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 化合物Harrisotone A的制備
化合物Harrisotone A(I)的制備方法參照Sheng Yin等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的方法。
實(shí)施例2 Harrisotone A的O-溴乙基衍生物(II)的合成
將化合物I(472mg，1.00mmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液。混合物在35攝氏度攪拌3h。3h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后對(duì)有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌2次，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(602mg，76％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.18(s,2H),4.56(s,2H),3.93(d,J＝16.7Hz,4H),3.79(s,2H),3.62(d,J＝0.9Hz,4H),3.15(s,2H),2.48(s,2H),2.41(d,J＝9.4Hz,4H),2.27(s,1H),1.95(s,1H),1.88–1.80(m,8H),1.77(d,J＝15.5Hz,7H),1.68(s,1H),1.61(s,1H),1.51(s,1H),1.25(d,J＝58.1Hz,1H),1.15–0.75(m,6H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.46(s),198.24(s),195.44(s),190.27(s),135.27(s),120.09(s),115.02(s),84.45(s),76.58(s),74.12(s),63.67(s),62.76(s),60.36(s),50.96(s),45.22(s),39.69(s),36.61(s),34.40(s),32.63(s),30.81(d,J＝8.9Hz),28.77(s),25.30(s),24.09(d,J＝19.2Hz),22.77(s),18.20(s).
HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for C34H50Br3O6:793.1137；found 793.1134.
實(shí)施例3 Harrisotone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物(III)的合成
1、Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的合成
將化合物II(396mg，0.5mmol)溶于22mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無(wú)水碳酸鉀(690mg，5.0mmol)，碘化鉀(252mg，1.5mmol)和二乙醇胺(1051mg，10mmol)，混合物加熱回流3h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入25mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，收集淡棕色集中洗脫帶即得到Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的棕色固體(324.4mg,75％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.17(s,2H),4.27(s,2H),3.56(d,J＝2.7Hz,4H),3.38(d,J＝83.1Hz,14H),3.08(s,2H),3.04(s,4H),2.76–2.66(m,5H),2.61(s,12H),2.57(s,2H),2.40(s,3H),2.05(s,1H),1.93(s,1H),1.91–1.81(m,8H),1.76(d,J＝15.5Hz,7H),1.68(s,1H),1.61(s,1H),1.51(s,1H),1.28(s,2H),1.18(d,J＝12.0Hz,7H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.46(s),198.23(s),195.44(s),190.26(s),135.27(s),120.08(s),115.02(s),84.44(s),76.58(s),66.89(s),62.74(s),60.37(s),60.13(s),59.31(s),56.85(s),53.89(s),53.08(s),50.95(s),45.22(s),39.68(s),36.61(s),30.80(d,J＝8.9Hz),28.77(s),25.29(s),24.09(d,J＝19.2Hz),22.76(s),18.20(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C46H80N3O12:866.5742；found:866.5737。
2、Harrisotone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物(III)的合成
合成足夠多的Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物，將Harrisotone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物(0.433g，0.5mmol)溶于4mL氯仿，逐滴加入氯化亞砜(2.38g，20mmol)，反應(yīng)物加熱回流2h。將反應(yīng)物冷卻至室溫，滴加甲醇分解過(guò)量的氯化亞砜，減壓濃縮除去溶劑。產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:0.3，v/v)，得到化合物III的淡黃色固體(302.3mg，62％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.14(s,2H),4.22(s,2H),3.68(d,J＝5.8Hz,12H),3.54(d,J＝5.3Hz,4H),3.06(s,2H),3.05(s,2H),3.03–2.68(m,18H),2.54–2.29(m,4H),2.24–2.05(m,1H),1.94(s,1H),1.90(s,1H),1.81(d,J＝5.0Hz,7H),1.71(d,J＝15.5Hz,7H),1.65(s,1H),1.56(s,1H),1.48(s,1H),1.15(d,J＝12.5Hz,7H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.12(s),197.88(s),195.10(s),189.91(s),134.93(s),119.73(s),114.68(s),84.09(s),76.24(s),66.54(s),62.40(s),60.02(s),59.79(s),55.91(s),53.54(s),52.74(s),50.60(s),44.88(s),39.33(d,J＝0.9Hz),36.27(s),30.45(d,J＝8.9Hz),28.43(s),24.94(s),23.75(d,J＝19.2Hz),22.41(s),17.86(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C46H74Cl6N3O6:976.3679；found:976.3675。
實(shí)施例4 Harrisotone A的O-(二(2-甲硫基乙基))乙基衍生物的合成
制備足夠多的化合物III，將化合物III(0.488g，0.5mmol)溶于15mL乙醇，室溫下加入甲硫醇鈉(2.1g，30mmol)，反應(yīng)物加熱回流1h。減壓濃縮除去溶劑，所得產(chǎn)物用硅膠柱層析進(jìn)行純化(石油醚/丙酮100:0.4，v/v)，得到黃色固體物，即化合物IV(0.350g，67％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.15(s,2H),4.23(s,2H),3.54(d,J＝11.2Hz,4H),3.41(s,2H),3.06(s,2H),3.01–2.51(m,29H),2.37(s,3H),2.26–1.99(m,21H),1.90(s,1H),1.85–1.72(m,8H),1.70(s,6H),1.65(s,1H),1.55(d,J＝13.0Hz,2H),1.48(s,1H),1.41(s,1H),1.14(s,6H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.26(s),198.02(s),195.24(s),190.05(s),135.07(s),119.87(s),114.82(s),84.23(s),76.38(s),66.68(s),62.54(s),60.16(s),59.93(s),53.68(s),52.88(s),52.39(s),50.74(s),45.02(s),39.47(s),36.41(s),32.12(s),30.59(d,J＝8.9Hz),28.57(s),25.08(s),23.89(d,J＝19.2Hz),22.55(s),18.00(s),14.74(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C52H92N3O6S6:1046.5310；found:1046.5303。
實(shí)施例5 組合物抗慢性阻塞性肺病實(shí)驗(yàn)
方法：SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，18-20g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、藥物處理組(組合物、化合物III和化合物IV 10mg/kg，灌胃給藥)，每組10只。將小鼠置于4L容器內(nèi)，每日煙熏(南京牌香煙—紅殼，焦油含量小于16mg)，一周五次，連續(xù)四周，每日煙熏前1小時(shí)灌胃給藥，小鼠在末次煙熏后1小時(shí)，以苯巴比妥鈉麻醉，用0.6mL預(yù)冷的PBS緩沖液(pH7.0)肺部灌流，沖洗3次，吸出支氣管肺泡灌洗液(BALF)，250×g離心10min，上清用于分析TNFα、RANTES的含量。細(xì)胞用PBS緩沖液重懸，計(jì)數(shù)，細(xì)胞涂片后用瑞氏-吉姆薩染色，分析BALF中炎性細(xì)胞的變化。
組合物的制備：將研磨之后過(guò)200目網(wǎng)的5mg化合物III的粉末和研磨之后過(guò)200目網(wǎng)的95mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時(shí)用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。
實(shí)驗(yàn)例1 組合物對(duì)COPD小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥介質(zhì)生成抑制作用
(1)組合物對(duì)COPD小鼠BALF中TNFα生成抑制作用
前炎性細(xì)胞因子TNFα是COPD的發(fā)病過(guò)程中的啟動(dòng)因子。COPD患者的TNFα水平高于正常人，培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞與香煙的煙霧接觸可分泌TNFα。TNFα可促使中性粒細(xì)胞脫顆粒，誘導(dǎo)起到粘膜細(xì)胞增生和高分泌，增加上皮細(xì)胞IL-8生成，增加巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶生成，促進(jìn)氣道高反應(yīng)性。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诳疾旖M合物對(duì)COPD小鼠BALF中TNFα生成的影響，結(jié)果見(jiàn)表1.
表1 組合物對(duì)COPD小鼠BALF中TNFα生成的影響
注：*P<0.05，與模型對(duì)照組相比；#P<0.05，與正常對(duì)照組相比。n＝10。
結(jié)果：組合物在10mg/kg下對(duì)COPD模型小鼠灌胃給藥，可顯著降低小鼠BALF中TNFα的生成，而化合物III和化合物IV無(wú)此作用。
(2)組合物對(duì)COPD小鼠BALF中RANTES分泌抑制作用
炎癥細(xì)胞的遷移受到趨化因子的調(diào)節(jié)，各種結(jié)構(gòu)細(xì)胞核炎性細(xì)胞均可分泌這些小分子蛋白，COPD發(fā)病過(guò)程中RANTES分泌增加，趨化單核/巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，嗜酸性細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诳疾旖M合物對(duì)COPD小鼠BALF中RANTES分泌的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 組合物對(duì)COPD小鼠BALF中RANTES分泌的影響
注：*P<0.05，與模型對(duì)照組相比；#P<0.01，與正常對(duì)照組相比。n＝10。
結(jié)果：組合物在10mg/kg下對(duì)COPD模型小鼠灌胃給藥，可降低小鼠BALF中RANTES的分泌，而化合物III和化合物IV無(wú)此作用。
實(shí)驗(yàn)例2組合物對(duì)COPD小鼠BALF中炎性細(xì)胞募集的抑制作用
(1)組合物對(duì)COPD小鼠BALF中中性粒細(xì)胞募集的抑制作用
中性粒細(xì)胞在COPD發(fā)病中具有重要作用，它可以釋放兩種絲氨酸蛋白酶，彈性蛋白酶和半胱氨酰蛋白酶-3，誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生人類肺氣腫樣的病理變化。中性粒細(xì)胞生命短暫，它循環(huán)招募到氣道以及穿越間隙腔的過(guò)程十分迅速。病理研究證明有些COPD患者支氣管組織內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目增加與氣流阻塞的程度有關(guān)。吸煙的COPD患者氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目增加，特別是那些伴有慢性支氣管炎的患者。影響COPD患者肺內(nèi)中性粒細(xì)胞募集的主要因素為IL-8趨化活性增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诳疾旖M合物對(duì)COPD小鼠BALF中中性粒細(xì)胞募集的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 組合物對(duì)COPD小鼠BALF中中性粒細(xì)胞募集的影響
注：*P<0.05；#P<0.01，與正常對(duì)照組相比。n＝10。
結(jié)果：組合物在10mg/kg下對(duì)COPD模型小鼠灌胃給藥，可降低小鼠BALF中中性粒細(xì)胞的募集，而化合物III和化合物IV無(wú)此作用。
(2)組合物對(duì)COPD小鼠BALF中巨噬細(xì)胞募集的抑制作用
吸煙者和COPD患者肺內(nèi)巨噬細(xì)胞較正常人群水平增加，多聚集在肺泡、細(xì)支氣管和小氣道。肺泡壁巨噬細(xì)胞數(shù)目和輕中度肺氣腫以及COPD患者的小氣道疾病程度呈正相關(guān)。組織病變和損傷部位可見(jiàn)到COPD緩慢進(jìn)展和慢性病變與巨噬細(xì)胞長(zhǎng)期增加平行。巨噬細(xì)胞可能通過(guò)釋放基質(zhì)金屬蛋白酶導(dǎo)致彈性組織降解能力異常增高，誘發(fā)肺氣腫的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诳疾旖M合物對(duì)COPD小鼠BALF中巨噬細(xì)胞募集的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 組合物對(duì)COPD小鼠BALF中巨噬細(xì)胞募集的影響
注：*P<0.05，與模型對(duì)照組相比；#P<0.01，與正常對(duì)照組相比。n＝10。
結(jié)果：組合物在10mg/kg下對(duì)COPD模型小鼠灌胃給藥，可顯著降低小鼠BALF中巨噬細(xì)胞的募集，而化合物III和化合物IV無(wú)此顯著作用。
結(jié)論：組合物在10mg/kg下灌胃給藥，對(duì)香煙誘導(dǎo)的小鼠慢性阻塞性肺病過(guò)程中的炎性介質(zhì)的生成和趨化因子的分泌有顯著抑制作用，對(duì)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)有顯著的抑制，對(duì)慢性阻塞性肺病有顯著的治療作用。而化合物III和化合物IV在10mg/kg下灌胃給藥，對(duì)香煙誘導(dǎo)的小鼠慢性阻塞性肺病過(guò)程中的炎性介質(zhì)的生成和趨化因子的分泌無(wú)顯著抑制作用，對(duì)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)無(wú)顯著抑制，對(duì)慢性阻塞性肺病無(wú)任何治療作用。
實(shí)施例6 本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
實(shí)施例7 本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。