本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2013年5月20日、發(fā)明名稱為“用于治療胃腸炎性疾病的草藥組合物及其制備方法和用途”、申請(qǐng)?zhí)枮?01380026260.X的發(fā)明的分案申請(qǐng)。本申請(qǐng)要求于2012年5月19日提交的序列號(hào)為61/649,287的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于在患有胃腸炎性疾病(gastrointestinalinflammatorydisease)的對(duì)象中治療胃腸炎性疾病的草藥組合物(herbalcomposition)。本發(fā)明還提供了使用藥物有效量的所述草藥組合物來治療胃腸炎性疾病的方法。特別地，本發(fā)明涉及使用藥物有效量的藿香正氣(HUOXIANGZHENGQI，HXZQ)提取物，所述提取物能夠抑制促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)、減弱對(duì)上皮屏障(epithelialbarrier)的破壞、以及調(diào)節(jié)腸功能(gutfunction)。
背景技術(shù)：
：：潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)和克羅恩病(Crohn’sdiesease，CD)是兩種慢性炎性疾病，統(tǒng)稱為炎性腸病(inflammatoryboweldisease，IBD)。據(jù)估計(jì)，有約110萬美國(guó)人患有IBD，而且每年診斷出約3萬新病例(HanauerSB,2006)。IBD的特征在于導(dǎo)致腹瀉和腹部疼痛的慢性炎癥?；加虚L(zhǎng)期結(jié)腸炎的患者發(fā)生結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)升高。IBD的復(fù)發(fā)性病程需要長(zhǎng)期患者護(hù)理，同時(shí)需要積極進(jìn)行醫(yī)藥或手術(shù)干預(yù)以誘導(dǎo)緩解。IBD的病因尚未知，但是認(rèn)為其是由微生物菌群的改變、發(fā)生疾病的遺傳誘因和黏膜免疫響應(yīng)失調(diào)造成的。淋巴細(xì)胞的激活和炎性細(xì)胞因子的過表達(dá)導(dǎo)致慢性腸炎。開發(fā)新治療劑的研究主要集中在特異性阻斷關(guān)鍵Th1細(xì)胞因子之產(chǎn)生的生物試劑上?，F(xiàn)有的用于炎性腸病(IBD)的生物治療劑(其目的在于阻斷關(guān)鍵Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生)為患者提供了一些益處。然而，這些試劑并非普遍適用而且常常在長(zhǎng)期使用后失效。此外，雖然這些抗Th1治療劑為IBD患者提供了一些益處，但是其遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能普遍適用。首先，它們并非對(duì)所有IBD患者都有效。其次，其由于針對(duì)該藥物的中和抗體之產(chǎn)生而存在隨時(shí)間失效的趨勢(shì)。最后，經(jīng)典的Th1細(xì)胞因子在防御胞內(nèi)病原體方面是重要的，因而阻斷這些關(guān)鍵的細(xì)胞因子可能會(huì)使患者處于發(fā)生或重新激活某些感染的較高風(fēng)險(xiǎn)中。幾個(gè)世紀(jì)以來，中草藥治療劑被用于治療胃腸(gastrointestinal，GI)癥狀，但其功效和大部分潛在機(jī)制尚不清楚。傳統(tǒng)的草藥配方通常包含許多不同組分，這些組分以潛在的協(xié)同作用和組分草藥之間的化學(xué)反應(yīng)作用于多個(gè)部位/途徑，從而可使效力最大化。藿香正氣是來源于中國(guó)古代藥學(xué)書籍《太平惠民和劑局方》(FormulariesoftheBureauofPeople’sWelfarePharmacies)的中藥配方，并且傳統(tǒng)地被用于治療中暑及相關(guān)的胃腸疾病。因此，期望研究藿香正氣組合物對(duì)胃腸炎性疾病的作用，尤其是對(duì)先天免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的作用，藿香正氣組合物阻斷/減弱失調(diào)的屏障功能的能力；以及藿香正氣組合物對(duì)調(diào)節(jié)腸平滑肌收縮和上皮分泌的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供草藥組合物用于在患有GI炎性疾病的對(duì)象中治療GI炎性疾病。本發(fā)明還提供了使用藥物有效量的所述草藥組合物來治療GI炎性疾病的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于在對(duì)象中治療GI炎性疾病的草藥組合物，所述組合物包含獲自廣藿香(PogostemonisHerba)、紫蘇葉(PerillaeFolium)、陳皮(CitriReticulataePericarpium)、白術(shù)(AtractylodisMacrocephalaeRhizoma)和白芷(AngelicaeDahuricaeRadix)的提取物。在該實(shí)施方案的一種實(shí)施中，每種草藥組分按重量計(jì)的單位范圍如下：廣藿香占組合物的約18重量％至約48重量％；紫蘇葉占組合物的約6重量％至約16重量％；陳皮占組合物的約12重量％至約32重量％；白術(shù)占組合物的約12重量％至約32重量％，并且白芷占組合物的約6重量％至約16重量％。在該實(shí)施方案的另一種實(shí)施中，每種草藥組分按重量計(jì)的單位范圍如下：廣藿香占組合物的約28重量％至約38重量％；紫蘇葉占組合物的約9重量％至約13重量％；陳皮占組合物的約17重量％至約27重量％；白術(shù)占組合物的約17重量％至約27重量％，并且白芷占組合物的約9重量％至約13重量％。在該實(shí)施方案的另一種實(shí)施中，每種草藥組分按重量計(jì)的單位數(shù)如下：廣藿香占組合物的約33重量％；紫蘇葉占組合物的約11重量％；陳皮占組合物的約22重量％；白術(shù)占組合物的約22重量％，并且白芷占組合物的約11重量％。在該實(shí)施方案的另一種實(shí)施中，草藥組合物是藥物有效量的來自草藥組分的精油提取物，并且所述精油通過對(duì)草藥組分進(jìn)行水蒸氣蒸餾來提取以形成水溶液。本發(fā)明還提供了草藥組合物，其包含有效量的上述組合物及可藥用載體、稀釋劑或賦形劑、或者其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述組合物是丸劑、膠囊劑、顆粒劑、片劑、混懸劑、注射劑、糖漿劑或酊劑。本發(fā)明涉及使用藥物量的草藥組合物來抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)促炎性細(xì)胞因子，減弱IFNγ誘導(dǎo)的上皮屏障破壞，以及調(diào)節(jié)腸功能。這些活性有助于對(duì)抗GI炎性疾病或病癥之制劑的有益作用，所述胃腸疾病或病癥包括炎性腸疾病(潰瘍性疾病和克羅恩病)、腸易激綜合征、乳糜瀉、以及阿片戒斷癥狀(opiatewithdrawalsymptom)，例如腹瀉。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了一種通過向?qū)ο笫┯糜行Я康牟菟幗M合物來治療GI炎性疾病的方法，所述草藥組合物包含來自廣藿香和紫蘇葉、陳皮、白術(shù)和白芷的提取物。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述草藥組合物在患有GI炎性疾病的對(duì)象中調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，減弱對(duì)上皮屏障的破壞，或者調(diào)節(jié)腸功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述用于治療GI炎性疾病的草藥組合物包含獲自廣藿香、紫蘇葉、陳皮、白術(shù)、白芷、厚樸(MagnoliaeOfficinalisCortex)、半夏(PinelliaeRhizoma)、茯苓(Poria)、甘草(GlycyrrhizaeRadixetRhizoma)、大腹皮(ArecaePericarpium)、桔梗(PlatycodonisRadix)、生姜(ZingiberisRhizomaRecens)和大棗(JujubaeFructus)的提取物。在該實(shí)施方案的一種實(shí)施中，每種草藥組分按重量計(jì)的單位范圍如下：廣藿香占組合物的約10重量％至約20重量％；紫蘇葉占組合物的約2.5重量％至約7.5重量％；陳皮占組合物的約5重量％至約15重量％；白術(shù)占組合物的約5重量％至約15重量％；白芷占組合物的約2.5重量％至約7.5重量％；厚樸占組合物的約5重量％至約15重量％；半夏占組合物的約5重量％至約15重量％；茯苓占組合物的約2.5重量％至約7.5重量％；甘草占組合物的約5重量％至約15重量％；大腹皮占組合物的約2.5重量％至約7.5重量％；桔梗占組合物的約5重量％至約15重量％；生姜占組合物的約0.5重量％至約2.5重量％；并且大棗占組合物的約1.5重量％至約3.5重量％。在該實(shí)施方案的另一種實(shí)施中，每種草藥組分按重量計(jì)的單位范圍如下：廣藿香占組合物的約12.5重量％至約17.5重量％；紫蘇葉占組合物的約4重量％至約6重量％；陳皮占組合物的約7.5重量％至約12.5重量％；白術(shù)占組合物的約7.5重量％至約12.5重量％；白芷占組合物的約4重量％至約6重量％；厚樸占組合物的約7.5重量％至約12.5重量％；半夏占組合物的約7.5重量％至約12.5重量％；茯苓占組合物的約4重量％至約6重量％；甘草占組合物的約7.5重量％至約12.5重量％；大腹皮占組合物的約4重量％至約6重量％；桔梗占組合物的約7.5重量％至約12.5重量％；生姜占組合物的約1重量％至約2重量％；并且大棗占組合物的約2重量％至約3重量％。在該實(shí)施方案的另一種實(shí)施中，每種草藥組分的重量百分比如下：廣藿香占組合物的約15重量％；紫蘇葉占組合物的約5重量％；陳皮占組合物的約10重量％；白術(shù)占組合物的約10重量％；白芷占組合物的約5重量％；厚樸占組合物的約10重量％；半夏占組合物的約10重量％；茯苓占組合物的約5重量％；甘草占組合物的約10重量％；大腹皮占組合物的約5重量％；桔梗占組合物的約10重量％；生姜占組合物的約1.5重量％；并且大棗占組合物的約2.5重量％。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于在患有GI炎性疾病的對(duì)象中治療GI炎性疾病的草藥組合物，該草藥組合物由有效量的至少第一提取物和第二提取物的混合物制成。所述第一提取物包含草藥厚樸的經(jīng)純化醇溶液提取物。所述第二提取物包含與半夏、茯苓、桔梗、甘草、大腹皮、生姜和大棗的經(jīng)純化水溶液提取物組合的在通過對(duì)廣藿香、紫蘇葉、陳皮、白術(shù)和白芷組分進(jìn)行蒸餾除去精油后與半夏、茯苓、桔梗、甘草、大腹皮、生姜和大棗一起煎煮的藥材殘余物。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述第一提取是用60％乙醇將厚樸提取3次，然后過濾獲得濾液，合并濾液并濃縮成澄清的糊狀提取物。在該實(shí)施方案的另一個(gè)方面中，精油提取自對(duì)廣藿香、紫蘇葉、陳皮、白術(shù)和白芷進(jìn)行水蒸氣蒸餾獲得的餾出物。在從餾出物中提取出精油之后留下經(jīng)純化的水溶液。在對(duì)上述草藥組分進(jìn)行水蒸氣蒸餾之后獲得藥材殘余物。在該實(shí)施方案的另一個(gè)方面中，過濾第二提取物，將濾液濃縮至合適的體積，離心，并進(jìn)一步濃縮成澄清的糊狀提取物。在該實(shí)施方案的另一個(gè)方面中，第一提取物和第二提取物的混合物與精油合并。在該實(shí)施方案的另一個(gè)方面中，本發(fā)明還提供了草藥組合物，其包含有效量的上述組合物及其可藥用載體、稀釋劑或賦形劑，或者其組合。在另一個(gè)方面中，上述組合物是丸劑、膠囊劑、顆粒劑、片劑、混懸劑、注射劑、糖漿劑或酊劑。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于在對(duì)象中治療GI炎性疾病的方法，其包括向所述對(duì)象施用有效量的草藥組合物，所述草藥組合物包含來自廣藿香、紫蘇葉、陳皮、白術(shù)、白芷、厚樸、半夏、茯苓、甘草、大腹皮、桔梗、生姜和大棗的提取物。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述GI炎性疾病選自：腸疾病，包括潰瘍性疾病和克羅恩病、腸易激綜合征、乳糜瀉、阿片戒斷癥狀和腹瀉。在該實(shí)施方案的另一個(gè)方面中，所述草藥組合物在患有GI炎性疾病的對(duì)象中調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)、減弱對(duì)上皮屏障的破壞或者調(diào)節(jié)腸功能。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，本發(fā)明的這些特征、優(yōu)點(diǎn)和另一些實(shí)施方案將通過本文件的其余部分而變得明顯。附圖說明為了更充分地理解本發(fā)明的性質(zhì)和期望的目的，可參考結(jié)合附圖的以下詳述。圖1A-E示出用藿香正氣(HXZQ)提取物處理之后，通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)；圖2A-F示出用藿香正氣(HXZQ)精油處理之后，通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)；圖3A-E示出藿香正氣(HXZQ)提取物和精油減弱IFNγ破壞上皮屏障的作用；圖4A-D示出藿香正氣(HXZQ)提取物對(duì)腸平滑肌收縮的作用；圖5A-B示出藿香正氣(HXZQ)提取物減少腸上皮分泌。具體實(shí)施方式通過參考本發(fā)明的以下詳述，可以更容易地理解本發(fā)明。應(yīng)理解，本發(fā)明不限于本文中所述的具體裝置、方法、條件或參數(shù)，并且本文中所用術(shù)語僅用于通過示例描述具體實(shí)施方案的目的，而并不旨在限制所要求保護(hù)的本發(fā)明。此外，說明書及所附權(quán)利要求書中使用的沒有數(shù)量詞修飾的名詞表示一個(gè)/種或更多個(gè)/種，并且提到具體數(shù)值時(shí)包括至少該特定值，上下文明顯另有說明除外。在本文中，范圍可表示為“約”或“大約”一個(gè)特定值和/或至“約”或“大約”另一個(gè)特定值。當(dāng)示出這樣一個(gè)范圍時(shí)，另一個(gè)實(shí)施方案包括一個(gè)特定值和/或至另一個(gè)特定值。類似地，當(dāng)通過使用在前的“約”來將值表示為近似值時(shí)，應(yīng)理解，該特定值形成另一個(gè)實(shí)施方案。在該文件中給出了本發(fā)明所公開主題之一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)。在研究了本文件所提供信息之后，對(duì)該文件中所述實(shí)施方案及其他實(shí)施方案的修改將對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言顯而易見。本文件中提供的信息并且特別是所述示例性實(shí)施方案的具體細(xì)節(jié)主要出于便于清楚理解的目的提供，而不應(yīng)理解為限制。雖然認(rèn)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將很好地理解以下術(shù)語，但仍提供了如下定義以幫助解釋本申請(qǐng)中所公開的主題。除非另有說明，否則本文中使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明公開的主題所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義。雖然現(xiàn)在將對(duì)代表性方法、裝置和材料進(jìn)行描述，但是與本文中所述的那些相似或等同的許多方法、裝置和材料均可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明所公開的主題。遵循長(zhǎng)久以來的專利法慣例，當(dāng)在本申請(qǐng)(包括權(quán)利要求書)中使用無數(shù)量詞修飾的名詞時(shí)指“一或更多”。因此，在提及“聚合物”時(shí)，包括多種這樣的聚合物，以此類推。除非另有說明，否則在本說明書和權(quán)利要求書中使用的所有表示成分、性質(zhì)(例如反應(yīng)條件)等的量的數(shù)值都應(yīng)理解為在所有的實(shí)例中由術(shù)語“約”修飾。因此，除非示出矛盾，否則本說明書和權(quán)利要求書中給出的數(shù)值參數(shù)均為可根據(jù)期望通過本發(fā)明所公開的主題獲得的性質(zhì)而變化的近似值。如本文中使用的，當(dāng)提及質(zhì)量、重量、時(shí)間、體積、濃度或百分比的值或量時(shí)，術(shù)語“約”意在包括給定量的如下變化：在一些實(shí)施方案中為±20％，在一些實(shí)施方案中為±15％，在一些實(shí)施方案中為±10％，在一些實(shí)施方案中為±5％，在一些實(shí)施方案中為±2.5％，在一些實(shí)施方案中為±2％，在一些實(shí)施方案中為±1％，在一些實(shí)施方案中為±0.5％，以及在一些實(shí)施方案中為±0.1％，這些變化適于進(jìn)行所公開的方法。還應(yīng)理解，本文中公開了許多數(shù)值，并且在本文中公開的每個(gè)數(shù)值除其本身外也公開為“約”該具體數(shù)值。例如，如果公開了數(shù)值“10”，則也公開了“約10”。還應(yīng)理解，還公開了兩個(gè)具體單位之間的每個(gè)單位。例如，如果公開了10和15，則也公開了11、12、13和14。本文中使用的術(shù)語“治療”包括但不限于抑制組織損傷的進(jìn)程、阻止組織產(chǎn)生損傷的發(fā)生、降低對(duì)組織損傷的嚴(yán)重程度、改善或緩解與組織損傷相關(guān)的癥狀以及修復(fù)、再生和/或引起組織損傷或與組織損傷相關(guān)的一個(gè)或更多個(gè)癥狀消退。本文中使用的術(shù)語“有效量”指足以治療如本文所限定之疾病量(例如，減弱對(duì)GI系統(tǒng)中上皮屏障的破壞)的組合物(例如，包含本發(fā)明所公開主題之草藥組分的草藥組合物)。本發(fā)明所公開主題組合物的實(shí)際量可以改變以施用有效獲得特定對(duì)象之期望響應(yīng)的組合物量和/或施用于特定疾病。所選量將取決于多種因素，包括組合物的活性、制劑、施用途徑、與其他藥物或治療劑的組合、所治療病癥的嚴(yán)重程度以及接受治療之對(duì)象的身體狀況和此前的用藥史。確定和調(diào)整治療有效量以及評(píng)價(jià)何時(shí)及如何做出這些調(diào)整對(duì)于醫(yī)藥領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是已知的。本發(fā)明組合物可包含“治療有效量”的本發(fā)明藥物部分。本文中所用術(shù)語“治療有效量”意指在良好醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)，化合物或組合物(例如，HUXIANGHUANGQI提取物或精油)足以顯著誘導(dǎo)待調(diào)節(jié)或治療病癥的積極改善但足夠低以避免副作用(如果存在的話，以合理的益處/風(fēng)險(xiǎn)比)的量。所述化合物或組合物的治療有效量將根據(jù)如下因素而不同：所治療的具體病癥、終端使用者的年齡和身體狀況、所治療/預(yù)防之病癥的嚴(yán)重程度、治療的持續(xù)時(shí)間、并行治療的性質(zhì)、所使用的具體化合物或組合物、所使用的具體可藥用載體等因素。本文中使用的所有百分比均為按重量計(jì)，另有說明除外。本文中所述的藥物組合物可以本身施用于哺乳動(dòng)物對(duì)象，或者以其與其他活性成分(如在聯(lián)合治療中)或合適的載體或賦形劑混合之藥物組合物的形式施用。用于配制和施用本申請(qǐng)所述制劑的技術(shù)可見于“Remington'sPharmaceuticalSciences,"MackPublishingCo.,Easton,Pa.,第18版,1990”中。合適的施用途徑可例如包括經(jīng)口、經(jīng)直腸、透黏膜或腸施用。就本文中所公開主題而言，優(yōu)選的對(duì)象是脊椎動(dòng)物對(duì)象。優(yōu)選的脊椎動(dòng)物對(duì)象是溫血脊椎動(dòng)物；優(yōu)選的溫血脊椎動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物最優(yōu)選為人。本文中使用的術(shù)語“對(duì)象”包括人和動(dòng)物兩種對(duì)象。因此，根據(jù)本發(fā)明所公開主題提供了獸醫(yī)治療用途。因此，本發(fā)明所公開主題用于診斷哺乳動(dòng)物例如人，以及因?yàn)l臨滅絕而重要的那些哺乳動(dòng)物，例如東北虎(Siberiantiger)；具有經(jīng)濟(jì)重要性的動(dòng)物，例如在農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)的用于人消耗的動(dòng)物；和/或?qū)θ擞猩鐣?huì)重要性的動(dòng)物，例如作為寵物飼養(yǎng)的或者動(dòng)物園中的動(dòng)物。這樣的動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于：食肉動(dòng)物，例如貓和狗；豬(swine)，包括家豬(pig)、肉豬(hog)和野豬；反芻動(dòng)物和/或有蹄類動(dòng)物，例如牛、公牛(oxen)、綿羊、長(zhǎng)頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝；以及馬。還提供了對(duì)鳥的治療，包括治療瀕臨滅絕和/或飼養(yǎng)在動(dòng)物園中的那些種類的鳥，以及禽類，更特別地，家養(yǎng)禽類(domesticatedfowl)，即家禽(poultry)，例如火雞、雞、鴨、鵝、珍珠雞(guineafowl)等，因?yàn)樗鼈円矊?duì)人有經(jīng)濟(jì)重要性。因此，還提供了對(duì)家畜的治療，所述家畜包括但不限于：豬、反芻動(dòng)物、有蹄類動(dòng)物、馬(包括競(jìng)賽用馬)、家禽等。除非另有說明，否則本發(fā)明所公開主題之實(shí)施可采用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA及免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)都在本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的范圍內(nèi)。這些技術(shù)已在文獻(xiàn)中獲得詳細(xì)解釋。參見例如，MolecularCloningALaboratoryManual(1989),第2版,Sambrook編輯；Fritsch和Maniatis編輯,ColdSpringHarborLaboratoryPress,第16和17章；美國(guó)專利No.4,683,195；DNACloning,第I和II期,Glover編輯,1985；OligonucleotideSynthesis,M.J.Gait編輯,1984；NucleicAcidHybridization,D.Hames&S.J.Higgins編輯,1984；TranscriptionandTranslation,B.D.Hames&S.J.Higgins編輯,1984；CultureOfAnimalCells,R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,1987；ImmobilizedCellsAndEnzymes,IRLPress,1986；Perbal(1984),APracticalGuideToMolecularCloning；參閱如下文獻(xiàn)中的方法：Enzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells,J.H.Miller和M.P.Calos編輯,ColdSpringHarborLaboratory,1987；MethodsInEnzymology,第154和155期,Wu等編輯,AcademicPressInc.,N.Y.；ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker編輯,AcademicPress,London,1987；HandbookOfExperimentalImmunology,第I-IV期,D.M.Weir和C.C.Blackwell編輯,1986。術(shù)語“GI炎性疾病”指以由促炎性細(xì)胞因子循環(huán)水平升高引起的以炎癥為特征的胃腸道疾病或病癥。免疫細(xì)胞(包括T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞)是這些促炎性細(xì)胞因子的主要產(chǎn)生者。GI炎性疾病包括腸疾病(潰瘍性疾病和克羅恩病)、腸易激綜合征、乳糜瀉、阿片戒斷癥狀以及腹瀉。本文中使用的術(shù)語“精油”或“揮發(fā)油”指從具有親水性這一一般性傾向的草藥和植物提取的任何濃縮的揮發(fā)性芳族化合物。本文中的術(shù)語“煎煮”指將草藥和水加熱至高溫，一般在100℃±5℃，并將該加熱的內(nèi)容物保持在90℃至100℃之溫度的過程。本發(fā)明涉及使用藥物量的草藥組合物藿香正氣(HXZQ)提取物，該提取物能夠抑制LPS-刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)促炎性細(xì)胞因子、減弱IFNγ誘導(dǎo)的對(duì)上皮屏障的破壞以及調(diào)節(jié)腸功能。這些活性有助于藥物制劑中的該藿香正氣提取物治療GI炎性疾病或病癥的有益作用，所述GI炎性疾病或病癥包括炎性腸疾病(潰瘍性疾病和克羅恩病)、腸易激綜合癥、乳糜瀉和阿片戒斷癥狀。草藥組合物藿香正氣(HXZQ)是來源于中國(guó)古代藥學(xué)書籍《太平惠民和劑局方》的中藥配方，并且傳統(tǒng)地被用于治療GI病癥。然而，所聲明的有益效果主要是軼事(anecdotal)，并未經(jīng)過科學(xué)數(shù)據(jù)證實(shí)。因此，本發(fā)明的目的是研究：(i)HXZQ提取物和精油對(duì)由用炎性介質(zhì)刺激的先天免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響；(ii)在單層T84細(xì)胞中，HXZQ提取物和精油阻斷/減弱失調(diào)的屏障功能的能力；(iii)HXZQ提取物和精油對(duì)調(diào)節(jié)腸平滑肌收縮和上皮分泌的作用。在一個(gè)方面中，所述制劑包含有效量的藿香正氣提取物和精油以及生理上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，或者其組合。術(shù)語“藥物組合物”或“藥物制劑”指藿香正氣提取物和精油與其他化學(xué)組分(例如稀釋劑或載體)的混合物。藥物組合物便于將藥物制劑施用于對(duì)象。術(shù)語“載體”定義便于將藿香正氣提取物和精油并入細(xì)胞或組織中的化合物。例如，二甲亞砜(DMSO)是常用的載體。術(shù)語“稀釋劑”定義在水中稀釋將溶解藿香正氣提取物和/或精油的化合物。在本領(lǐng)域中使用溶解于緩沖液中的鹽作為稀釋劑。術(shù)語“生理上可接受”定義不消除藿香正氣提取物和精油的生物活性和特性的載體或稀釋劑。本文中使用的術(shù)語“可藥用”意指所述載體、稀釋劑、賦形劑和/或鹽必須與制劑的其他成分相容，并且對(duì)其接受者無害。本文中使用的術(shù)語“可藥用載體”意指任何類型無毒的惰性的固體、半固體、稀釋劑、包封材料或制劑助劑?？捎米骺伤幱幂d體之物質(zhì)的一些實(shí)例是糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；麥芽；明膠；滑石；以及其他無毒的相容性潤(rùn)滑劑，例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、矯味劑和芳香劑、防腐劑以及抗氧化劑也可以根據(jù)配制者的判斷存在于所述組合物中。對(duì)于經(jīng)口施用，可容易地通過將藿香正氣提取物和精油與本領(lǐng)域中公知的可藥用載體組合來進(jìn)行配制。這樣的載體使得可以將藿香正氣提取物配制成片劑、丸劑、糖衣劑、膠囊劑、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、漿液劑、混懸劑等，以供待治療患者經(jīng)口攝入。用于經(jīng)口使用的藿香正氣提取物和精油的藥物制劑可通過以下步驟來獲得：混合一種或更多種固體賦形劑，任選地研磨所得混合物，加工顆?；旌衔?，添加合適的佐劑(如果期望的話)，以獲得片劑或糖衣丸芯。特別地，合適的賦形劑是填充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖；纖維素制備物，例如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果期望的話，可以添加崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或海藻酸鹽例如海藻酸鈉。劑量和濃度可以根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉如何根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的劑量和注射方式。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于在對(duì)象中治療GI炎性疾病的草藥組合物，其包含獲自廣藿香、紫蘇葉、陳皮、白術(shù)和白芷的提取物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了通過向?qū)ο笫┯糜行Я康牟菟幗M合物來治療GI炎性疾病的方法，所述草藥組合物包含來自廣藿香和紫蘇葉、陳皮、白術(shù)和白芷的提取物。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述草藥組合物在患有GI炎性疾病的對(duì)象中調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)、減弱對(duì)上皮屏障的破壞、或調(diào)節(jié)腸功能。特別地，本發(fā)明涉及使用藥物量的草藥組合物來抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)促炎性細(xì)胞因子、減弱IFNγ誘導(dǎo)的對(duì)上皮屏障的破壞、以及調(diào)節(jié)腸功能。這些活性有助于該制劑對(duì)抗GI炎性疾病或病癥的有益作用，所述GI炎性疾病或病癥包括炎性腸疾病(潰瘍性疾病和克羅恩病)、腸易激綜合癥、乳糜瀉和阿片戒斷癥狀，例如腹瀉。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述每種草藥組分在組合物中可如下：廣藿香為約18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％至約48％w/w、w/v或v/v；紫蘇葉為約6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％至約16％w/w、w/v或v/v；陳皮為約12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％和32％w/w、w/v或v/v；白術(shù)為約12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％和32％w/w、w/v或v/v，并且白芷為約6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％至約16％w/w、w/v或v/v。在一個(gè)實(shí)施方案中，如表1所示，每種草藥組分按重量計(jì)的單位數(shù)如下：廣藿香占組合物的約33重量％；紫蘇葉占組合物的約11重量％、陳皮占組合物的約22重量％、白術(shù)占組合物的約22重量％，并且白芷占組合物的約11重量％。表1No.名稱量(g)重量％1廣藿香326.8332紫蘇葉108.9113陳皮217.9224白術(shù)217.9225白芷108.911總計(jì)980.4100在另一個(gè)實(shí)施方案中，草藥組合物是藥物有效量的來自草藥組分的精油提取物，并且所述精油通過對(duì)草藥組分進(jìn)行水蒸氣蒸餾來提取以形成水溶液。本發(fā)明還提供了草藥組合物，其包含有效量的上述組合物及其可藥用載體、稀釋劑或賦形劑或者其組合。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，上述組合物是丸劑、膠囊劑、顆粒劑、片劑、混懸劑、注射劑、糖漿劑或酊劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述用于治療GI炎性疾病的草藥組合物包含獲自廣藿香、紫蘇葉、陳皮、白術(shù)、白芷、厚樸、半夏、茯苓、甘草、大腹皮、桔梗、生姜和大棗的提取物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述每種草藥組分在組合物中可如下：廣藿香為約10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％至約20％w/w、w/v或v/v；紫蘇葉為約2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％至約7.5％w/w、w/v或v/v；陳皮為約5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％至約15％w/w、w/v或v/v；白術(shù)為約5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％至約15％w/w、w/v或v/v；白芷為約2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％至約7.5％w/w、w/v或v/v；厚樸為約5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％至約15％w/w、w/v或v/v；半夏為約5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％至約15％w/w、w/v或v/v；茯苓為約2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％至約7.5％w/w、w/v或v/v；甘草為約5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％至約15％w/w、w/v或v/v；大腹皮為約2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％至約7.5％w/w、w/v或v/v；桔梗為約5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％至約15％w/w、w/v或v/v；生姜為約0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％至約2.5％w/w、w/v或v/v；并且大棗為約1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％至約3.5％w/w、w/v或v/v。在該實(shí)施方案的另一種實(shí)施中，如表2所示，每種草藥組分的按重量計(jì)百分比如下：廣藿香占組合物的約15重量％；紫蘇葉占組合物的約5重量％；陳皮占組合物的約10重量％；白術(shù)占組合物的約10重量％；白芷占組合物的約5重量％；厚樸占組合物的約10重量％；半夏占組合物的約10重量％；茯苓占組合物的約5重量％；甘草占組合物的約10重量％；大腹皮占組合物的約5重量％；桔梗占組合物的約10重量％；生姜占組合物的約1.5重量％；并且大棗占組合物的約2.5重量％。表2No.名稱量(g)重量％1廣藿香326.8152紫蘇葉108.953陳皮217.9104白術(shù)217.9105白芷108.956厚樸217.9107半夏217.9108茯苓108.959甘草217.91010大腹皮108.9511桔梗217.91012生姜32.71.513大棗54.52.5總計(jì)2157100在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于在對(duì)象中治療GI炎性疾病的方法，其包括向所述對(duì)象施用有效量的草藥組合物，所述草藥組合物包含來自廣藿香、紫蘇葉、陳皮、白術(shù)、白芷、厚樸、半夏、茯苓、甘草、大腹皮、桔梗、生姜和大棗的提取物。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述GI炎性疾病選自：腸疾病，包括潰瘍性疾病和克羅恩病、腸易激綜合征、乳糜瀉、阿片戒斷癥狀和腹瀉。所述草藥組合物在患有GI炎性疾病的對(duì)象中調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)、減弱對(duì)上皮屏障的破壞、或者調(diào)節(jié)腸功能。本發(fā)明的這些和其他方面、特征和優(yōu)點(diǎn)將通過參照本文的詳述來理解，并且將通過特別是在所附權(quán)利要求書中指出的多種要素及組合而實(shí)現(xiàn)。應(yīng)理解，本發(fā)明的前述總體描述和下文的詳細(xì)描述是本發(fā)明的示例性和解釋性的優(yōu)選實(shí)施方案，而非對(duì)本發(fā)明作出限制，如所要求保護(hù)的那樣。下文的一些實(shí)施例是預(yù)示性的，盡管在實(shí)施例中提及并包含有數(shù)值、結(jié)果和/或數(shù)據(jù)。此外，以下實(shí)施例可包括代表在與本發(fā)明相關(guān)的開發(fā)和實(shí)驗(yàn)過程中的多個(gè)時(shí)間收集的數(shù)據(jù)之?dāng)?shù)據(jù)匯編。實(shí)施例1.藿香正氣(HXZQ)精油在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過以下步驟來加工精油：為了制備草藥配方的處方，對(duì)粗品藥材廣藿香、白術(shù)(炒制的)、陳皮、紫蘇葉和白芷進(jìn)行稱重，將這些粗品藥材放入揮發(fā)油的提取容器中，添加少量水將其潤(rùn)濕之后，再添加水浸沒這些藥材，通過水蒸氣蒸餾8小時(shí)來加熱和提取揮發(fā)油，將餾出物置于分液漏斗中，靜置，然后分離上層的揮發(fā)油與其余的餾出物。另外，向潔凈的剩余揮發(fā)油中添加95％乙醇。最后，密封保存該揮發(fā)油混合物。也將藥材殘余物保存。在該優(yōu)選實(shí)施方案中，一個(gè)草藥配方的處方(總重量和每種草藥組分的重量如表1所示)可產(chǎn)生約1ml揮發(fā)油。揮發(fā)油的提取率為1.0％。實(shí)施例2HXZQ提取物在本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)以下步驟來制備草藥配方的提取物：將厚樸置于多功能提取容器中，用60％乙醇提取三次(第一次用6體積的乙醇，第二次和第三次用4體積的乙醇)，每次1小時(shí)，過濾，合并濾液，通過減壓從濾液回收醇，從而產(chǎn)生澄清的糊狀提取物I。在該優(yōu)選實(shí)施方案中，接著取提取揮發(fā)性油之后的廣藿香、紫蘇葉、陳皮、白術(shù)和白芷的藥材殘余物，并將這些藥材殘余物與半夏(制)、桔梗、茯苓、甘草、大腹皮、生姜和大棗合并到多功能提取容器中，添加水提取兩次：第一次在添加8體積水之后提取2小時(shí)；第二次在添加6體積水之后提取1小時(shí)；過濾；合并濾液和作為提取揮發(fā)油后之殘留物的餾出物；減壓并濃縮至相對(duì)密度為1.12(80℃)，從而產(chǎn)生澄清的糊狀提取物，離心獲得澄清的糊狀提取物II。下一步驟是繼續(xù)濃縮澄清的糊狀提取物I和II至相對(duì)密度為1.35(80℃)，在真空中干燥，研磨，以產(chǎn)生提取物，然后密封保存。在該優(yōu)選實(shí)施方案中，一個(gè)草藥配方(總重量和每種草藥組分的重量如表2所示)可由乙醇和水產(chǎn)生1ml揮發(fā)油和約0.54kg合并的提取物，提取物中揮發(fā)油所占的比例為約0.185％。實(shí)施例3.HXZQ軟膠囊劑通過獲取13種藥材來制備具有優(yōu)越特性的藿香正氣組合物：廣藿香、紫蘇葉、白芷、白術(shù)(炒制的)、陳皮、半夏(制)、厚樸(姜制)、茯苓、桔梗、甘草、大腹皮、生姜和大棗。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用60％乙醇提取厚樸3次并過濾。合并濾液并濃縮成糊狀提取物I。通過水蒸氣蒸餾來提取廣藿香、紫蘇葉、陳皮、白術(shù)和白芷的揮發(fā)油以獲得水溶液。蒸餾之后過濾水溶液，將濾液收集在另一容器中。將濾出的藥材殘余物與半夏、茯苓、桔梗、甘草、大腹皮、生姜和大棗一起在水中煎煮兩次。將煎煮物與上述水溶液合并。過濾，濃縮濾液至合適的體積，離心并進(jìn)一步將上清液濃縮成糊狀提取物II。合并糊狀提取物I和II并濃縮成黏稠的提取物(或者在真空中干燥)。研磨該干提取物并篩分成細(xì)粉末。在該優(yōu)選實(shí)施方案中，向藿香正氣提取物中添加揮發(fā)油、精制大豆油、蜂蠟和聚山梨醇酯80，在膠體磨中研磨該制劑，然后壓縮成軟膠囊。實(shí)施例4.傳統(tǒng)的中草藥配方藿香正氣的抗炎活性及腸功能調(diào)節(jié)活性GI炎性疾病或病癥的特征通常在于促炎性細(xì)胞因子的循環(huán)水平升高，并且巨噬細(xì)胞是這些促炎性細(xì)胞因子的主要產(chǎn)生者。為了確定藿香正氣提取物是否具有抗炎活性，在存在或不存在藿香正氣制劑的條件下用LPS處理骨髓來源的巨噬細(xì)胞。材料和方法利用來源于小鼠骨髓的巨噬細(xì)胞(BMDM)來研究藿香正氣制劑的抗炎活性。采用qPCR來測(cè)量細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)。在TRASNWELL板上培養(yǎng)T84細(xì)胞。這些細(xì)胞形成充分分化的單層，用于在第一實(shí)例中研究藿香正氣制劑對(duì)上皮屏障功能的影響，以及在第二實(shí)例中研究藿香正氣制劑加精油對(duì)上皮屏障功能的影響。此外，將腸平滑肌條置于器官浴中，并將黏膜置于尤斯室中以確定藿香正氣制劑調(diào)節(jié)平滑肌收縮以及上皮分泌的作用。在該實(shí)驗(yàn)中，將空腸段縱向懸于器官浴中。在存在或不存在藿香正氣制劑的條件下確定響應(yīng)于乙酰膽堿(最常見的膽堿能神經(jīng)遞質(zhì))、5-HT或模擬神經(jīng)刺激之電場(chǎng)刺激的平滑肌收縮。對(duì)平滑肌自發(fā)性收縮的幅度進(jìn)行測(cè)量。小鼠。C57BL/6小鼠購(gòu)自TheJacksonLaboratories(BarHarbor,ME)。所有實(shí)驗(yàn)均根據(jù)InstituteofLaboratoryAnimalResources,NationalResearchCouncil,HealthandHumanServicesPublication的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南(國(guó)立衛(wèi)生研究院85-23,1996年修訂)中給出的原則進(jìn)行。HXZQ提取物和精油的制備參見實(shí)施例1至3。此外，對(duì)于體外研究，使用Detoxi-Gel內(nèi)毒素去除凝膠(ThermoScientific,Rockford,IL)來加工草藥提取物或精油以除去可能的污染性LPS。骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDM)和細(xì)胞培養(yǎng)物的制備。通過將來自脛骨和股骨的骨髓沖(flush)入含10％FBS的HyCloneMEMα培養(yǎng)基(Thermo)中來從小鼠獲取非貼壁骨髓單核細(xì)胞。在37℃和5％CO2下，在HyCloneMEMα培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞過夜，以耗盡貼壁的基質(zhì)細(xì)胞。收集非貼壁單核細(xì)胞，用紅細(xì)胞裂解緩沖液處理以除去紅細(xì)胞。然后在20ng/ml重組小鼠M-CSF(R&DSystems,Minneapolis,MN)的存在下培養(yǎng)這些細(xì)胞7天，以產(chǎn)生完全分化的巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)基隔天更換一次。將巨噬細(xì)胞平鋪于6孔板中，并在存在或不存在炎性介質(zhì)LPS、IFN或這二者的條件下處理HXZQ的草藥提取物或精油，一式3份。24小時(shí)后，將細(xì)胞收集在Trizol中用于分離RNA，同時(shí)收集不含細(xì)胞的上清液用于通過LuminexAssay測(cè)定細(xì)胞因子釋放。基于初步實(shí)驗(yàn)，我們選擇出了對(duì)于個(gè)體實(shí)驗(yàn)最合適的LPS濃度，如下：對(duì)于BMDM的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)而言為1ng/ml，對(duì)于BMDM的細(xì)胞因子釋放而言為10ng/ml。器官浴中的體外平滑肌收縮。按照此前所述來測(cè)量體外平滑肌收縮(Zhao等，2003)。確定平滑肌對(duì)乙酰膽堿、膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)和模擬神經(jīng)刺激之電場(chǎng)刺激(EFS)的響應(yīng)以及自發(fā)性收縮幅度。張力被表示為單位橫截面積的張力(Zhao等，2001)。尤斯室(Ussingchamber)中的體外上皮細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)。按照先前所述(Shea-Donohue等，2001)，將小腸的無肌肉段置于尤斯室中。測(cè)定短路電流(short-circuitcurrent，Isc)響應(yīng)于向漿膜側(cè)添加乙酰膽堿或向黏膜側(cè)添加葡萄糖的濃度依賴性變化。對(duì)個(gè)體動(dòng)物所有組織段對(duì)乙酰膽堿或葡萄糖的響應(yīng)作平均，以獲得每只動(dòng)物的平均響應(yīng)?？缟掀る娮?trans-epithelialelectricalresistance，TEER)的Microsnap孔測(cè)定。在含有5％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)T84細(xì)胞(CCL-248,ATCC)(一種人結(jié)腸上皮細(xì)胞系)。在具有12mm插入物的12孔transwell板(Costar3460,CorningIncorporated)上接種每孔5×105個(gè)細(xì)胞，在37℃和5％CO2下孵育。在孔的底部(基底外側(cè))添加1.5ml培養(yǎng)基，頂室(頂側(cè))添加0.5ml培養(yǎng)基。細(xì)胞在培養(yǎng)10至14天后匯合極化為上皮單層。然后，在存在或不存在IFN-γ(添加到基底外側(cè)，一種公知的上皮屏障破壞劑)的條件下，用添加到頂側(cè)和基底外側(cè)的HXZQ的草藥提取物或精油處理該單層。在處理前每日監(jiān)測(cè)TEER，然后在處理后24小時(shí)、48小時(shí)再次監(jiān)測(cè)。RNA提取、cDNA合成和實(shí)時(shí)定量PCR。按照先前所述(Zhao等，2010)，從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA。采用第一鏈cDNA合酶試劑盒(MBIFermentas,Hanover,MD)，用六聚體隨機(jī)引物將RNA樣品(2mg)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。如所述，用iCycler檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad,Hercules,CA)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)。在相對(duì)于18SrRNA作歸一化之后，靶基因mRNA表達(dá)的倍數(shù)變化相對(duì)于各載劑組小鼠。qPCR的引物由BeaconDesigner7.0(PremierBiosoftInternational,PaloAlto,CA)設(shè)計(jì)并且由Sigma或馬里蘭大學(xué)的生物聚合物實(shí)驗(yàn)室(Baltimore,MD)合成。數(shù)據(jù)分析。使用單因素方差分析通過Newman-Keuls測(cè)試進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來對(duì)響應(yīng)和基因表達(dá)進(jìn)行比較。合適的載劑對(duì)照、時(shí)間對(duì)照和年齡匹配對(duì)照也包括在整個(gè)研究中。結(jié)果和討論HXZQ提取物或精油強(qiáng)烈地抑制巨噬細(xì)胞中表達(dá)/產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子作為腸免疫的主要成員之一，巨噬細(xì)胞組成性地存在于腸固有層(ZhaoA.等,2008；WeberB等,2009；PlattAM等,2008)。在正常條件下，腸巨噬細(xì)胞缺乏對(duì)炎性刺激的響應(yīng)或者該響應(yīng)降低。在疾病發(fā)病期間，由于循環(huán)單核細(xì)胞的募集，固有層中巨噬細(xì)胞的數(shù)目提高。募集的這些巨噬細(xì)胞釋放大量的促炎性細(xì)胞因子，例如IL-1β、L-12、TNFα和IFNγ，這些細(xì)胞因子在炎癥的發(fā)生和發(fā)展二者中都是重要的(WeberB等，2009)。最后，巨噬細(xì)胞可通過釋放IL-12和IFNγ影響Th1/Th17炎性效應(yīng)細(xì)胞的分化和擴(kuò)增(WeberB等,2009；McKeernanDP等,2009)。鑒于IBD以促炎性細(xì)胞因子循環(huán)水平升高為特征并且巨噬細(xì)胞是這些促炎性細(xì)胞因子的主要產(chǎn)生者這一事實(shí)，雖然許多中草藥都具有抗炎特性(YangZ等,2012)，我們?nèi)詻Q定確定HXZQ是否可以抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子。我們對(duì)一般被認(rèn)為是純成熟巨噬細(xì)胞群并常常用作評(píng)估抗炎性活性之有價(jià)值細(xì)胞模型(ZhangX等,2001)的骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDM)進(jìn)行了研究。對(duì)三種不同濃度的HXZQ提取物進(jìn)行了測(cè)試：所測(cè)試的三種不同濃度的HXZQ(10、50和100μg/ml)均強(qiáng)烈地抑制LPS刺激的若干主要促炎性細(xì)胞因子上調(diào)，包括IL-12p40、IFNγ、IL-1β、IL-6和TNFα(圖1A-E)。進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn)以確定來自HXZQ之精油的作用。與提取物類似，濃度為1、5和20μl/ml的精油顯著抑制LPS(10ng/ml)刺激的IL-12p40、IFNγ、IL-1β、IL-6和TNFα上調(diào)(圖2A-E)。一個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，低至0.2μl/ml的油可抑制所有受試細(xì)胞因子的上調(diào)(圖2F)。這些數(shù)據(jù)支持HXZQ草藥配方具有強(qiáng)抗炎特性。HXZQ或精油減弱/阻斷IFNγ誘導(dǎo)的上皮屏障功能障礙?？刂颇c通透性對(duì)于宿主防御而言是重要的，這是因?yàn)?，提高的通透性促使大量管腔?nèi)的細(xì)菌、抗原或其他病原體產(chǎn)生的分子通過黏膜屏障，這誘發(fā)免疫激活(TurnerJR等,2009)。黏膜表面的上皮細(xì)胞形成單層屏障，其限制病原體或產(chǎn)物暴露給下層免疫細(xì)胞，因此，維持完整的黏膜屏障正如可提供證據(jù)證明的那樣是免疫穩(wěn)態(tài)中最重要的因素之一。事實(shí)上，在患有IBD的患者中觀察到了腸上皮細(xì)胞屏障功能障礙。既然已經(jīng)確定了HXZQ在巨噬細(xì)胞中的抗炎活性，我們接下來就對(duì)HXZQ是否能夠影響上皮屏障功能進(jìn)行了確定。我們對(duì)T84細(xì)胞(一種人結(jié)腸上皮細(xì)胞系)進(jìn)行了培養(yǎng)，然后在IFNγ(一種公知的上皮屏障破壞劑)的存在下用HXZQ提取物或精油對(duì)其進(jìn)行處理。測(cè)量跨上皮電阻(TEER)作為通透性指標(biāo)。與先前的報(bào)道一致，在處理24小時(shí)和48小時(shí)后，IFNγ有效降低T84單層的TEER，表明通透性提高(圖3)。濃度為50μg/ml的HXZQ的存在沒有作用，但500μg/ml阻止了該IFNγ誘導(dǎo)的TEER降低，表明維持了正常屏障功能(圖3A&B)。在24小時(shí)時(shí)，濃度為0.1μl/ml和0.2μl/ml的精油完全阻斷了IFNγ誘導(dǎo)的T84單層上皮破壞，但在處理后48小時(shí)失去該效果(圖3D&E)。HXZQ提取物對(duì)上皮屏障功能障礙的該減弱作用通過測(cè)量級(jí)聯(lián)藍(lán)色葡聚糖之流入的實(shí)驗(yàn)獲得了進(jìn)一步驗(yàn)證，在該實(shí)驗(yàn)中，500μg/ml的提取物降低了由IFNγ誘導(dǎo)的葡聚糖流入(圖3C)。值得注意的是，提取物和精油二者對(duì)基線TEER均無任何影響(數(shù)據(jù)未示出)。HXZQ提取物抑制平滑肌收縮和腸上皮分泌。GI炎性疾病與導(dǎo)致諸如腹部疼痛、腹瀉或便秘之癥狀的腸功能異常相關(guān)。我們對(duì)HXZQ提取物是否調(diào)節(jié)腸功能進(jìn)行了研究。如所示出的，腸響應(yīng)于乙酰膽堿(圖4A)、電場(chǎng)刺激(EFS，圖4B)的平滑肌收縮和腸條自發(fā)性收縮(圖4D)受到0.1mg/mlHXZQ提取物的顯著抑制，并且進(jìn)一步被1mg/ml的HXZQ提取物抑制或消除。在洗去提取物之后，大多數(shù)降低的響應(yīng)可部分或完全恢復(fù)(數(shù)據(jù)未示出)。最后，平滑肌對(duì)5-HT的響應(yīng)被0.1mg/mlHXZQ提取物消除(圖4C)。腸上皮的主要生理作用是吸收營(yíng)養(yǎng)物或離子、分泌流體和維持黏膜屏障功能，因此，也對(duì)HXZQ調(diào)節(jié)腸上皮分泌的作用進(jìn)行了研究。0.1mg/ml的HXZQ顯著抑制響應(yīng)于乙酰膽堿的氯離子分泌，并且在1mg/ml的條件下消除該分泌響應(yīng)(圖5A)。5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)二者中的重要神經(jīng)激素遞質(zhì)(GershonMD等，1991)。腸是最大的5-HT來源(5-HT大多數(shù)來自腸嗜鉻(enterochromaffin，EC)細(xì)胞)，并且包含大量參與腸黏膜和平滑肌功能之生理調(diào)節(jié)的5-HT受體亞型(GershonMD1991；GershonMD2004；GershonMD2003)。5-HT還在維持黏膜穩(wěn)態(tài)中起到重要作用。在許多腸疾病(包括IBS、IBD和乳糜瀉)中披露了EC細(xì)胞數(shù)和5-HT含量的變化(Beaurepaire等，2009；SpillerR.2008)。不出所料，0.1mg/ml的HXZQ提取物消除了腸上皮分泌對(duì)5-HT的響應(yīng)(圖5B)。這些數(shù)據(jù)表明，HXZQ能夠調(diào)節(jié)腸功能?？傊撗芯勘砻?，HXZQ具有強(qiáng)抗炎活性和腸功能調(diào)節(jié)活性。該草藥提取物不僅抑制免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，而且阻斷炎性介質(zhì)誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞屏障破壞。此外，HXZQ能夠調(diào)節(jié)腸平滑肌和上皮功能。因此，HXZQ可以是對(duì)抗Th1占優(yōu)勢(shì)之腸疾病(例如IBD)的潛在治療劑。參考文獻(xiàn)列表1.HanauerSB.Inflammatoryboweldisease：epidemiology，pathogenesis，andtherapeuticopportunities.InflammBowelDis2006；12Suppl1：S3-S9.2.ZhaoA，McDermottJ，UrbanJF，Jr.，GauseW，MaddenKB，YeungKA，MorrisSC，F(xiàn)inkelmanFD，Shea-DonohueT.DependenceofIL-4，IL-13，andnematode-inducedalterationsinmurinesmallintestinalsmoothmusclecontractilityonStat6andentericnerves.JImmunol2003；171：948-954.3.ZhaoA，BossoneC，Pineiro-CarreroV，Shea-DonohueT.Colitis-inducedalterationsinadrenergiccontrolofcircularsmoothmuscleinvitroinrats8.JPharmacolExpTher2001；299：768-774.4.Shea-DonohueT，SullivanC，F(xiàn)inkelmanFD，MaddenKB，MorrisSC，GoldhillJ，Pineiro-CarreroV，UrbanJF，Jr.TheroleofIL-4inHeligmosomoidespolygyrus-inducedalterationsinmurineintestinalepithelialcellfunction.JImmunol2001；167：2234-2239.5.ZhaoA，UrbanJF，SunR，StiltzJ，MorimotoM，NotariL，MaddenKB，YangZ，GrinchukV，RamalingamTR，WynnTA，Shea-DonohueT.CriticalRoleofIL-25inNematodeInfection-InducedAlterationsinIntestinalFunction.JImmunol2010；185：6921-6929.6.ZhaoA，UrbanJrJF，AnthonyRM，SunR，StiltzJ，vanRooijenN，WynnTA，GauseWC，Shea-DonohueT.Th2Cytokine-lnducedAlterationsinIntestinalSmoothMuscleFunctionDependonAlternativelyActivatedMacrophages.Gastroenterology2008；135：217-225.7.WeberB，SaurerL，MuellerC.Intestinalmacrophages：differentiationandinvolvementinintestinalimmunopathologies.SeminarsinImmunopathology2009；31：171-184.8.PlattAM，MowatAM.Mucosalmacrophagesandtheregulationofimmuneresponsesintheintestine.ImmunologyLetters2008；119：22-31.9.McKernanDP，NolanA，BrintEK，O′MahonySM，HylandNP，CryanJF，DinanTG.Toll-LikeReceptormRNAExpressionIsSelectivelyIncreasedintheColonicMucosaofTwoAnimalModelsRelevanttoIrritableBowelSyndrome.PLoSONE2009；4：e8226.10.YangZ，GrinchukV，IpSP，CheCT，F(xiàn)ongHH，LaoL，WuJC，SungJJ，BermanB，Shea-DonohueT，ZhaoA.Anti-InflammatoryActivitiesofaChineseHerbalFormulaIBS-20InVitroandInVivo.EvidBasedComplementAlternatMed2012；2012：491496.11.ZhangX，GoncalvesR，MosserDM.TheIsolationandCharacterizationofMurineMacroph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