本發(fā)明屬于生物醫(yī)用高分子材料與納米生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤在世界范圍內(nèi)已經(jīng)成為人類面臨的主要?dú)⑹种?，每年?dǎo)致全球大約13％的死亡率。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)統(tǒng)計(jì)，在世界范圍內(nèi)，每年有近100萬(wàn)人被診斷出癌癥，在近十年有超過(guò)8000萬(wàn)人死于癌癥。雖然化療在近些年的抗癌治療中取得了良好的效果，但是由于它治療的過(guò)程中不具有腫瘤靶向性，導(dǎo)致嚴(yán)重的副反應(yīng)，給患者帶來(lái)極大地痛苦。此外，由于許多化療藥物還存在溶解度低，穩(wěn)定性差，生物利用度低，容易引發(fā)多藥耐性等問題，嚴(yán)重限制了抗腫瘤藥物在臨床上的應(yīng)用。所以，研究抗癌藥物合適的給藥載體是十分必要的。

隨著近年材料化學(xué)的進(jìn)步與發(fā)展，越來(lái)越多的人聚焦于納米遞藥系統(tǒng)，包括納米載體，納米粒，脂質(zhì)體，聚合物-藥物共聚體，碳納米管，介孔硅載藥體系等。在這其中，聚合物載體作為一種具有廣闊應(yīng)用前景的新型納米給藥系統(tǒng)，引起了人們的廣泛關(guān)注。

殼寡糖(CSO)，一種低分子量的殼聚糖，在保留了殼聚糖的諸多理化性質(zhì)的條件下水溶性獲得了極大的提高，它是自然界中存在的唯一一種帶有氨基的堿性多糖，具有良好的生物相容性，生物可降解性和低毒性，因此可對(duì)其進(jìn)行疏水改性，來(lái)負(fù)載疏水性的藥物。

許多研究表明透明質(zhì)酸(HA)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，其特異性受體CD44在許多腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，而正常細(xì)胞表面的CD44受體則處于一種非活躍的沉默狀態(tài)，而透明質(zhì)酸與CD44之間的相互作用可介導(dǎo)藥物進(jìn)入細(xì)胞，可作為透明質(zhì)酸作為靶向配體治療惡性腫瘤的基礎(chǔ)。目前針對(duì)透明質(zhì)酸對(duì)藥物的靶向遞送多集中于利用透明質(zhì)酸中的羧基對(duì)載體進(jìn)行化學(xué)修飾或直接對(duì)透明質(zhì)酸進(jìn)行兩親性修飾，但有文獻(xiàn)報(bào)道，過(guò)多利用透明質(zhì)酸中的羧基對(duì)其進(jìn)行改性可能會(huì)影響透明質(zhì)酸對(duì)CD44受體的靶向結(jié)合能力，并且通過(guò)化學(xué)方法進(jìn)行透明質(zhì)酸修飾制備靶向載體，存在工藝復(fù)雜，過(guò)程繁瑣，批次重現(xiàn)差等問題。因此，采用靜電吸附作用結(jié)合透明質(zhì)酸作為靶向配體，可有效減少對(duì)透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)的影響，增加載體對(duì)CD44受體的靶向性，同時(shí)無(wú)需化學(xué)合成，節(jié)省時(shí)間和成本。

傳統(tǒng)腫瘤治療方法中常常會(huì)存在短時(shí)間內(nèi)頻繁用藥，出現(xiàn)血藥濃度高，毒副作用大，治療效果不明顯等問題，刺激響應(yīng)型納米載體由于可提高藥物的生物利用度，選擇性的將藥物濃集于腫瘤組織，經(jīng)腫瘤部位刺激(如溫度、PH、光、磁場(chǎng)、超聲強(qiáng)度、電子脈沖等)而迅速釋藥，因此智能型藥物遞釋系統(tǒng)的設(shè)計(jì)已逐漸成為藥劑學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一?；谀[瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間還原型谷胱甘肽(GSH)濃度的顯著性差異設(shè)計(jì)的還原敏感性遞藥系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)藥物高效安全遞送。

兩親性聚合物除了可以裝載藥物，還可以裝載磁性或者熒光納米粒子作為造影劑用做磁共振成像(MIR)或熒光成像，對(duì)藥物在腫瘤組織或者細(xì)胞中的分布進(jìn)行監(jiān)測(cè)。磁性納米粒子是一種智能型的納米磁性材料，它既具有納米材料所特有的性質(zhì)如粒徑小，比表面積大，又具有磁響應(yīng)性及超順磁性，可以在恒定磁場(chǎng)下聚集和定位。Fe₃O₄具有優(yōu)異的超順磁性能，可以用于體內(nèi)磁共振成像和實(shí)現(xiàn)藥物的磁靶向遞送，已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。

目前利用兩親性聚合物形成膠束遞送藥物已有眾多報(bào)道，通過(guò)將超順磁性納米粒摻雜于兩親性聚合物中構(gòu)建磁性納米載體用于磁靶向或磁共振成像的案例也有相關(guān)報(bào)道，但是尚未發(fā)現(xiàn)將還原響應(yīng)特性、磁靶向、配體靶向多重特性集一身的靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明首次基于殼寡糖設(shè)計(jì)合成還原響應(yīng)型兩親性聚合物包裹超順磁性Fe₃O₄，同時(shí)利用靜電吸附作用附著透明質(zhì)酸作靶向配體，構(gòu)建靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體，該載體具良好的生物相容性，是疏水性抗腫瘤藥物的理想載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體及其制備方法。

本發(fā)明所述的是靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體，它具典型的核殼結(jié)構(gòu)。以超順磁性Fe₃O₄納米粒為內(nèi)核，包裹在具還原響應(yīng)性的兩親性聚合物內(nèi)部；所述的具還原響應(yīng)性的兩親性聚合物是由疏水基團(tuán)與親水性聚合物通過(guò)含還原敏感鍵的Linker連接而成；所述兩親性聚合物構(gòu)成所述納米載體的殼結(jié)構(gòu)，殼表面通過(guò)靜電吸附作用附著靶向配體。

所述的具還原響應(yīng)性的兩親性聚合物是由疏水基團(tuán)與親水性聚合物通過(guò)含還原敏感鍵的Linker連接而成；進(jìn)一步地，所述的親水性聚合物為殼寡糖，其分子量為1000～10000Da；進(jìn)一步地，所述殼寡糖分子量為5000Da。

所述的具還原響應(yīng)性的兩親性聚合物是由疏水基團(tuán)與殼寡糖通過(guò)含還原敏感鍵的Linker連接而成；進(jìn)一步地，所述含還原敏感鍵的Linker為二硫代二丙酸，Linker中所含還原敏感鍵為二硫鍵；所述疏水基團(tuán)選自膽固醇、維生素E、C₈～C₁₆脂肪醇；

所述的具還原響應(yīng)性的兩親性聚合物合成過(guò)程中，鍵合有含還原敏感鍵Linker的疏水基團(tuán)與殼寡糖中氨基摩爾投料比為5％～100％。

所述靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體，靶向配體為透明質(zhì)酸，并且通過(guò)靜電吸附作用與聚合物殼結(jié)構(gòu)相連，透明質(zhì)酸分子量為3500～250000Da；進(jìn)一步地，透明質(zhì)酸分子量為14600Da；

所述的靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體具超順磁性，為球形結(jié)構(gòu)，粒徑大小為50～250nm，磁性納米粒子具有超順磁性，粒徑為5～18nm。

當(dāng)殼寡糖分子量取5000Da，鍵合有含還原敏感鍵Linker的疏水基團(tuán)為十六醇時(shí)，隨著投料比的改變，納米粒的平均粒徑(d_n)和臨界膠束濃度(CMC)，多分散系數(shù)(PDI)也發(fā)生改變。結(jié)果見表1。

表1

從表中可以看出，鍵合有含還原敏感鍵Linker的十六醇投料比越大，載體臨界膠束濃度越小，粒徑越小，當(dāng)投料比為30％時(shí)載體粒徑分布相對(duì)比較均一，PDI較小，透射電鏡下外觀呈球形，如圖7，因此本發(fā)明中鍵合有含還原敏感鍵Linker的十六醇投料比優(yōu)選為30％。

透明質(zhì)酸的投量會(huì)嚴(yán)重影響載藥體系的粒徑和穩(wěn)定性，參照Int.J.Biol.Macromol.2015，72：1391-1401，通過(guò)考察HA加入量對(duì)載體溶液在450nm處的吸光度的影響，可以反映所形成的納米粒的多少與粒徑的大小。如圖1可以看出當(dāng)HA與還原響應(yīng)性兩親性聚合物投料比在1/20～8/20時(shí)，所形成的納米粒在48h內(nèi)比較穩(wěn)定，并且隨著HA投量的增加，溶液在450nm處的吸光度逐漸增大，這表明所形成的納米粒數(shù)目逐漸增多，載體粒徑逐漸變大，當(dāng)將所得納米粒溶液過(guò)0.22μm微孔濾膜后，投料比為4/20～8/20的納米粒溶液，納米粒大部分被截留，因此在本發(fā)明中HA的投料比優(yōu)選為3/20。

該納米載體具有超順磁性和腫瘤細(xì)胞多重靶向性，可同時(shí)用于體內(nèi)的磁共振成像和靶向遞送疏水性抗腫瘤藥物。

本發(fā)明所構(gòu)建的靶向配體修飾的還原響應(yīng)性磁性納米載體，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1)具多重腫瘤靶向能力，提高抗腫瘤效率，降低對(duì)正常組織器官的毒副作用。

2)通過(guò)靜電吸附附著靶向配體，無(wú)需化學(xué)反應(yīng)，節(jié)約時(shí)間和成本，增強(qiáng)載體腫瘤靶向性。

3)能快速響應(yīng)腫瘤高GSH微環(huán)境，使藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)快速釋放，增強(qiáng)腫瘤抑制作用。

本發(fā)明的另一目的旨在提供一種制備前述納米載體的方法，包括以下步驟：

1.疏水性超順磁性Fe₃O₄納米粒子的合成：參照文獻(xiàn)J.Am.Chem.Soc.2004，126：273-279所述的高溫?zé)峤夥ê铣?～18nm、高度單分散、粒徑均一、具超順磁性的Fe₃O₄納米粒子，其形貌如圖2，磁滯回線如圖3。

2.鍵合有含還原敏感鍵Linker的疏水基團(tuán)的合成：將3，3’-二硫代二丙酸(1.50g，7.13mmol)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，1.618g，7.84mmol)溶于20ml無(wú)水有機(jī)溶劑中，氬氣保護(hù)下冰浴攪拌30min，將疏水基團(tuán)(7.13mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，87mg，0.713mmol)加入其中，繼續(xù)在冰浴下攪拌反應(yīng)1h，之后將其轉(zhuǎn)移到室溫條件下繼續(xù)攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完全后加入等體積的乙酸乙酯終止反應(yīng)，過(guò)濾除去二環(huán)己脲，濾液加入少量水后用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮，于混合溶劑中重結(jié)晶，即得鍵合有含還原敏感鍵Linker的疏水基團(tuán)。

合成路線詳解如下：

3.鍵合有含還原敏感鍵Linker的疏水基團(tuán)改性殼寡糖：取殼寡糖1g溶于2ml超純水中后，加入20ml二甲基亞砜對(duì)其進(jìn)行稀釋，65℃下預(yù)熱30min，按照殼寡糖氨基含量的0.05～1倍摩爾當(dāng)量稱取2)中合成的鍵合有還原敏感鍵Linker的疏水基團(tuán)，加入相當(dāng)于鍵合有還原敏感鍵Linker的疏水基團(tuán)1.5倍摩爾當(dāng)量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，溶于適量的二甲基亞砜中，65℃下活化30min，將其逐滴加入已預(yù)熱好的殼寡糖溶液中，65℃下反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后將溶液逐滴加入到10倍體積的丙酮中，11000r/min離心3min，收集沉淀，用少量水復(fù)溶后，逐滴加入丙酮中，離心收集沉淀，重復(fù)上述操作三次，最后將所得紅棕色沉淀溶于適量水中，裝入透析袋中(MWCO 1000Da)透析24h，冷凍干燥，得具還原響應(yīng)性的兩親性聚合物。該兩親性材料具良好的水溶性，在水溶液中可自組裝形成納米載體。

合成路線詳解如下：

4.還原響應(yīng)性兩親性聚合物對(duì)Fe₃O₄納米粒子的裝載：將Fe₃O₄納米粒溶解于氯仿或二氯甲烷或正己烷中，20mg兩親性聚合物溶解于10ml超純水中，通過(guò)超聲乳化-溶劑揮發(fā)法將Fe₃O₄納米粒包封于載體內(nèi)部；Fe₃O₄納米粒與兩親性聚合物的重量比為5％～50％，在有機(jī)溶劑揮發(fā)的過(guò)程中，F(xiàn)e₃O₄納米粒子自發(fā)被負(fù)載于兩親性聚合物內(nèi)部。

5.靶向配體修飾還原響應(yīng)型磁性載藥納米載體：將0.1～2mg/ml的透明質(zhì)酸溶液逐滴緩慢滴加于還原響應(yīng)型磁性載藥納米載體中(其中含兩親性材料的濃度為0.5～2mg/ml)，室溫?cái)嚢?0min，將載體溶液依次通過(guò)0.45μm，0.22μm濾膜，通過(guò)冷凍干燥即得靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體。

本發(fā)明所發(fā)明納米載體可用于疏水性抗腫瘤藥物的運(yùn)載，故本發(fā)明還提供一種負(fù)載疏水性抗腫瘤藥物的方法，其制備過(guò)程包括以下步驟：

1.還原響應(yīng)性兩親性聚合物對(duì)Fe₃O₄納米粒子和藥物的裝載：該過(guò)程通過(guò)一步法將Fe₃O₄納米粒子和藥物同時(shí)裝載或分兩步將二者中一種先裝載后再將另外一種裝載。采用一步法時(shí)裝載方法選用超聲乳化-溶劑揮發(fā)法或透析法，溶劑選自四氫呋喃、二氯甲烷、氯仿、正己烷、二甲亞砜、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、水；采用兩步法時(shí)，裝載Fe₃O₄選用超聲乳化-溶劑揮發(fā)法，裝載藥物選擇透析法或超聲乳化-溶劑揮發(fā)法，溶劑選自四氫呋喃、二氯甲烷、氯仿、正己烷、二甲亞砜、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、水。

2.靶向配體修飾還原響應(yīng)性磁性載藥納米復(fù)合物：將0.1～2mg/ml的透明質(zhì)酸溶液逐滴緩慢滴加于1所得溶液(其中含兩親性材料的濃度為0.5～2mg/ml)，室溫?cái)嚢?0min，將載體溶液依次通過(guò)0.45μm，0.22μm濾膜，通過(guò)冷凍干燥即得靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載藥復(fù)合物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的技術(shù)方案具以下優(yōu)點(diǎn)：

1)可同時(shí)負(fù)載Fe₃O₄納米粒子和疏水性抗腫瘤藥物，結(jié)合靶向配體主動(dòng)靶向作用，超順磁性磁納米的磁靶向作用和載體腫瘤微環(huán)境還原響應(yīng)特性，使該載體更具腫瘤細(xì)胞靶向性，到達(dá)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部后，能快速響應(yīng)腫瘤細(xì)胞高GSH，迅速將抗腫瘤藥物釋放，具較強(qiáng)的抗腫瘤效率，能有效降低毒副作用。

2)該納米載體具超順磁性，可同時(shí)用于體內(nèi)磁共振成像和藥物的靶向遞送。

3)靶向配體通過(guò)靜電吸附作用附著于載體表面，制備方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便。

4)所用材料具有良好的生物相容性。

附圖說(shuō)明

圖1：透明質(zhì)酸的加入量對(duì)納米載體在450nm處的吸光度的影響；

圖2：實(shí)施例1中通過(guò)高溫?zé)峤夥ê铣傻母叨葐畏稚ⅰ⒘捷^均一約為8nm的Fe₃O₄的TEM圖；

圖3：實(shí)施例1中通過(guò)高溫?zé)峤夥ê铣傻腇e₃O₄在300K下的磁滯回線；

圖4：實(shí)施例2中Hex-SS-COOH的¹H-NMR圖譜；

圖5：實(shí)施例2中殼寡糖(CSO)的¹H-NMR圖譜；

圖6：實(shí)施例2中CSO-SS-Hex的¹H-NMR圖譜；

圖7：實(shí)施例2中還原響應(yīng)性兩親性材料的TEM圖；

圖8：實(shí)施例2中還原響應(yīng)性兩親性材料的粒徑分布圖；

圖9：實(shí)施例2中還原響應(yīng)性兩親性材料在10mM GSH條件下粒徑的動(dòng)態(tài)變化圖；

圖10：實(shí)施例5中透明質(zhì)酸修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體(HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄)的TEM圖；

圖11：實(shí)施例5中透明質(zhì)酸修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體(HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄)的動(dòng)態(tài)光散射柱狀分布圖；

圖12：實(shí)施例5中透明質(zhì)酸修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體(HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄)在300K下的磁滯回線；

圖13：實(shí)施例5中透明質(zhì)酸修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體磁響應(yīng)性，a為加磁鐵吸附前載體溶液的狀態(tài)，b為加磁鐵吸附1h后載體溶液的狀態(tài)，c為將b輕搖后載體溶液的狀態(tài)；

圖14：實(shí)施例5中透明質(zhì)酸修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體(HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄)的細(xì)胞毒性；

圖15：實(shí)施例5中A549細(xì)胞對(duì)透明質(zhì)酸修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體(HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄)攝取的定量分析；

圖16：實(shí)施例5中A549細(xì)胞對(duì)未經(jīng)透明質(zhì)酸修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體(CSO-SS-Hex/Fe₃O₄)攝取的定量分析；

圖17：實(shí)施例8中透明質(zhì)酸修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載藥復(fù)合物(HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄/PTX)在不同環(huán)境下的藥物釋放曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下具體實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但下述僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.疏水性超順磁性Fe₃O₄納米粒的合成

實(shí)施例1：

參照文獻(xiàn)J.Am.Chem.Soc.2004，126，273-279，稱取乙酰丙酮鐵(0.7063g，2mmol)，1，2-十二烷二醇(2.0234g，10mmol)，油酸(l.6948g，6mmol)，油胺(1.605g，6mmol)，二苯醚(20mL)在氬氣流110℃下攪拌1h以除去水和氧氣，將溫度上升至200℃(每分鐘升高8℃)，在此溫度下反應(yīng)2h，停止通氮?dú)?，溫度加熱?65℃，回流反應(yīng)30min，等反應(yīng)液冷卻至室溫后，將反應(yīng)液倒入40ml乙醇中沉淀，11000r/min*30min，用無(wú)水乙醇洗滌三次之后，將其分散到25ml的氯仿中保存。

通過(guò)透射電鏡(TEM)對(duì)其進(jìn)行形貌觀察，結(jié)果如圖2，粒子形態(tài)近球形，粒徑在10nm以下。

通過(guò)振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)對(duì)它的磁性能進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3，磁滯回線表明，合成的磁納米粒飽和磁化強(qiáng)度為39.58emu/g，幾乎沒有剩磁和矯頑力，驗(yàn)證了合成的Fe₃O₄納米粒具有很好的超順磁性行為。

2.還原響應(yīng)性兩親性聚合物的制備

實(shí)施例2：鍵合有含還原敏感鍵Linker的十六醇改性殼寡糖的制備(CSO-SS-Hex)

1)鍵合有含還原敏感鍵Linker的疏水基團(tuán)的合成：

將3，3’-二硫代二丙酸(1.50g，7.13mmol)和DCC(1.618g，7.84mmol)溶于20ml無(wú)水DMF中，氬氣保護(hù)下冰浴攪拌30min，將十六醇(1.729g，7.13mmol)和DMAP(87mg，0.713mmol)加入其中，繼續(xù)在冰浴下攪拌反應(yīng)1h，之后將其轉(zhuǎn)移到室溫條件下攪拌反應(yīng)2h，加入等體積的乙酸乙酯終止反應(yīng)，過(guò)濾除去二環(huán)己脲，濾液加入少量水后乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮，于20ml甲醇/乙酸乙酯＝1/1的混合溶劑中重結(jié)晶即得產(chǎn)物Hex-SS-COOH。其¹H-NMR譜圖如圖4。

2)疏水改性殼寡糖的合成：

取分子量為5000Da的殼寡糖1g溶于2ml超純水中后，加入20ml DMSO對(duì)其進(jìn)行稀釋，65℃下預(yù)熱半小時(shí)，按照殼寡糖氨基含量的0.3倍當(dāng)量稱取上述合成的含還原敏感連接臂的疏水基團(tuán)，加入1.5倍當(dāng)量的EDCI，NHS，溶于適量的DMSO中，65℃下活化30min，將其逐滴加入已預(yù)熱好的殼寡糖溶液中，65℃下反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后將溶液逐滴加入到10倍體積的丙酮中，11000r/min離心3min，收集沉淀，用少量水復(fù)溶后，逐滴加入丙酮中，離心收集沉淀，重復(fù)上述操作三次，最后將所得紅棕色沉淀溶于適量水中，裝入透析袋中(MWCO 1000Da)透析24h，冷凍干燥，得CSO-SS-Hex。

Hex-SS-COOH ¹H-NMR圖譜如圖4，圖譜中δ＝1.25的峰歸屬22個(gè)亞甲基H信號(hào)，δ＝0.874的峰歸屬為端甲基H信號(hào)，殼寡糖(CSO)¹H-NMR圖譜如圖5，圖譜中δ＝1.99的峰歸屬為-NHCOCH₃的H的特征峰，CSO-SS-Hex ¹H-NMR譜圖如圖6，圖譜中同時(shí)出現(xiàn)了上述兩種物質(zhì)的特征峰，說(shuō)明Hex-SS-COOH成功鍵合到了殼寡糖的骨架上。

通過(guò)透射電鏡對(duì)其形貌進(jìn)行考察，結(jié)果如圖7，載體外觀呈球形，形態(tài)完整，具核殼結(jié)構(gòu)。

通過(guò)馬爾文粒度儀對(duì)其粒徑分布進(jìn)行考察，結(jié)果如圖8，粒徑比透射電鏡所測(cè)稍大，可能與透射電鏡測(cè)定是在粒子干燥情況下測(cè)定有關(guān)。

本發(fā)明采用將一定量的CSO-SS-Hex加入到10mM還原性谷胱甘肽溶液中，模擬載體在腫瘤組織中還原響應(yīng)特點(diǎn)，間隔一段時(shí)間對(duì)其粒徑分布進(jìn)行考察，結(jié)果如圖9，隨時(shí)間推移，載體粒徑分布逐漸變大，出現(xiàn)大于1000nm的粒子，表明該載體能快速響應(yīng)高谷胱甘肽環(huán)境。

實(shí)施例3：鍵合有含還原敏感鍵Linker的膽固醇改性殼寡糖的制備(CSO-SS-Chol)

1)鍵合有含還原敏感鍵Linker的疏水基團(tuán)的合成：

將3，3’-二硫代二丙酸(1.50g，7.13mmol)和DCC(1.618g，7.84mmol)溶于20ml無(wú)水THF中，氬氣保護(hù)下冰浴攪拌30min，將膽固醇(2.756g，7.13mmol)和DMAP(87mg，0.713mmol)加入其中，繼續(xù)在冰浴下攪拌反應(yīng)1h，之后將其轉(zhuǎn)移到室溫條件下攪拌反應(yīng)12h，過(guò)濾除去二環(huán)己脲，減壓濃縮，于20ml乙酸乙酯/正己烷＝1/1的混合溶劑中重結(jié)晶即得產(chǎn)物Chol-SS-COOH。

2)疏水改性殼寡糖的合成：

取分子量為5000Da的殼寡糖1g溶于2ml超純水中后，加入20ml DMSO對(duì)其進(jìn)行稀釋，65℃下預(yù)熱半小時(shí)，按照殼寡糖氨基含量的0.3倍當(dāng)量稱取上述合成的含還原敏感連接臂的疏水基團(tuán)，加入1.5倍當(dāng)量的EDCI，NHS，溶于適量的DMSO中，65℃下活化30min，將其逐滴加入已預(yù)熱好的殼寡糖溶液中，65℃下反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后將溶液逐滴加入到10倍體積的丙酮中，11000r/min離心3min，收集沉淀，用少量水復(fù)溶后，逐滴加入丙酮中，離心收集沉淀，重復(fù)上述操作三次，最后將所得紅棕色沉淀溶于適量水中，裝入透析袋中(MWCO 1000Da)透析24h，冷凍干燥，得CSO-SS-Chol。

實(shí)施例4：鍵合有含還原敏感鍵Linker的維生素E改性殼寡糖的制備(CSO-SS-VE)

1)鍵合有含還原敏感鍵Linker的疏水基團(tuán)的合成：

將3，3’-二硫代二丙酸(1.50g，7.13mmol)和DCC(1.618g，7.84mmol)溶于20ml無(wú)水CH₂Cl₂中，氬氣保護(hù)下冰浴攪拌30min，將維生素E(3.071g，7.13mmol)和DMAP(87mg，0.713mmol)加入其中，繼續(xù)在冰浴下攪拌反應(yīng)1h，之后將其轉(zhuǎn)移到室溫條件下攪拌反應(yīng)12h，過(guò)濾除去二環(huán)己脲，減壓濃縮，于20ml乙酸乙酯/正己烷＝1/1的混合溶劑中重結(jié)晶即得產(chǎn)物VE-SS-COOH。

2)疏水改性殼寡糖的合成：

取分子量為5000Da的殼寡糖1g溶于2ml超純水中后，加入20ml DMSO對(duì)其進(jìn)行稀釋，65℃下預(yù)熱半小時(shí)，按照殼寡糖氨基含量的0.3倍當(dāng)量稱取上述合成的含還原敏感連接臂的疏水基團(tuán)，加入1.5倍當(dāng)量的EDCI，NHS，溶于適量的DMSO中，65℃下活化30min，將其逐滴加入已預(yù)熱好的殼寡糖溶液中，65℃下反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后將溶液逐滴加入到10倍體積的丙酮中，11000r/min離心3min，收集沉淀，用少量水復(fù)溶后，逐滴加入丙酮中，離心收集沉淀，重復(fù)上述操作三次，最后將所得紅棕色沉淀溶于適量水中，裝入透析袋中(MWCO：1000Da)透析24h，冷凍干燥，得CSO-SS-VE。

3.配體修飾的的還原響應(yīng)兩親性聚合物對(duì)Fe₃O₄納米粒子裝載

實(shí)施例5：

稱取具還原響應(yīng)性的兩親性聚合物(CSO-SS-Hex)20mg溶于10ml超純水中，吸取1ml Fe₃O₄溶液(約10mg)，在劇烈攪拌條件下將其注入兩親性聚合物溶液中，細(xì)胞破碎儀(振幅30％，工作2s，停3s)超聲乳化3min，室溫下敞口攪拌使氯仿自然揮發(fā)，待氯仿?lián)]盡后，在劇烈攪拌下，以極緩慢的速度逐滴將3ml 1mg/ml的透明質(zhì)酸(分子量為14600Da)溶液加入其中，攪拌30min后，將溶液以4000r/min離心10min，棄去沉淀，收集上清液，上清液過(guò)0.45μm微孔濾膜，收集濾液，凍干即為配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體。

為了更好的說(shuō)明本方法制備的透明質(zhì)酸修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載藥載體的性能，根據(jù)以下測(cè)試方法進(jìn)行性能測(cè)定，包括形貌表征、粒徑分布測(cè)定、磁性能考察。

本發(fā)明通過(guò)透射電鏡(TEM)對(duì)制備的透明質(zhì)酸修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載藥載體形貌進(jìn)行表征，制備的載藥載體外觀呈球形，形貌均一，結(jié)果如圖10。

通過(guò)馬爾文粒度儀對(duì)其粒徑分布進(jìn)行考察，所測(cè)粒徑大小與透射電鏡結(jié)果相一致，結(jié)果如圖11。

利用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)對(duì)其磁性能進(jìn)行考察，所得磁滯回線如圖12，飽和磁強(qiáng)度為8.53emu/g，幾乎觀測(cè)不到矯頑力和剩磁，故表現(xiàn)出超順磁性行為，可滿足生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用。

本發(fā)明利用永磁鐵對(duì)所制備的靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體的磁響應(yīng)行為進(jìn)行更加直觀的考察。準(zhǔn)確配制1mg/ml的靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體水溶液，將其置于10ml的西林瓶中，在西林瓶一側(cè)放一磁鐵，觀測(cè)載體的磁響應(yīng)行為，結(jié)果如圖13，所制備的靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體具良好的磁響應(yīng)性，放置磁鐵前載體溶液呈均一的溶液狀態(tài)(圖13a)，在溶液一側(cè)放置磁鐵后可快速在磁體附近富集(圖13b)，輕搖后立即重新分散為均一狀態(tài)，無(wú)沉淀析出(圖13c)。

本發(fā)明制備的靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)其生物相容性進(jìn)行考察。精密稱取一定量的靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體，加入適量的PBS緩沖液(PH＝7.4)，超聲配制成2mg/ml的載體懸液，實(shí)驗(yàn)前，在無(wú)菌的條件下，用新鮮的DMEM不完全培養(yǎng)基將載體懸液分別稀釋為400μg/ml，200μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，1μg/ml。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的的A549或SMMC-7721細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞后，以5*10^3個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，每孔加入100μl含10％胎牛血清的的DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)置三個(gè)平行孔。孵育24h待細(xì)胞貼壁80％后，用移液槍吸棄上清液，更換為100μl DMEM培養(yǎng)基或者含不同濃度樣品的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48h，取出96孔板，避光條件下加入10μl 5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)避光孵育2h，使用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度值，記錄結(jié)果，按照下述公式計(jì)算細(xì)胞的存活率：

其結(jié)果如圖14，本發(fā)明制備的靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體即使在400μg/ml的高濃度下，對(duì)人非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞(A549)和人肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)共孵育48h，仍保持有70％以上田胞存活率，表明本發(fā)明制備的靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體具有較低的細(xì)胞毒性，具有較好的生物相容性。

為說(shuō)明本發(fā)明制備的靶向配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體中靶向配體的修飾有助于腫瘤細(xì)胞對(duì)該載體的攝取，本發(fā)明以未經(jīng)靶向配體修飾的載體為對(duì)照組，通過(guò)FITC對(duì)載體進(jìn)行熒光標(biāo)記，以A549為模型細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄和CSO-SS-Hex/Fe₃O₄細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度結(jié)果分別如圖15和圖16，結(jié)果表明，經(jīng)共孵育后，胞內(nèi)載體的熒光強(qiáng)度呈時(shí)間依賴性，同一時(shí)間點(diǎn)時(shí)，靶向配體修飾的載體組胞內(nèi)熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，說(shuō)明靶向配體的加入能有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)載體的攝入。

實(shí)施例6：

稱取具還原響應(yīng)性的的兩親性聚合物(CSO-SS-Chol)20mg溶于10ml超純水中，吸取1ml Fe₃O₄溶液(約10mg)，在劇烈攪拌條件下將其注入兩親性聚合物溶液中，細(xì)胞破碎儀(振幅30％，工作2s，停3s)超聲乳化3min，室溫下敞口攪拌使氯仿自然揮發(fā)，待氯仿?lián)]盡后，在劇烈攪拌下，以極緩慢的速度逐滴將3ml 1mg/ml的透明質(zhì)酸(分子量為14600Da)溶液加入其中，攪拌30min后，將溶液以4000r/min離心10min，棄去沉淀，收集上清液，上清液過(guò)0.45μm微孔濾膜，收集濾液，凍干即為配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體。

實(shí)施例7：

稱取具還原響應(yīng)性的的兩親性聚合物(CSO-SS-VE)20mg溶于10ml超純水中，吸取1ml Fe₃O₄溶液(約10mg)，在劇烈攪拌條件下將其注入兩親性聚合物溶液中，細(xì)胞破碎儀(振幅30％，工作2s，停3s)超聲乳化3min，室溫下敞口攪拌使氯仿自然揮發(fā)，待氯仿?lián)]盡后，在劇烈攪拌下，以極緩慢的速度逐滴將3ml 1mg/ml的透明質(zhì)酸(分子量為14600Da)溶液加入其中，攪拌30min后，將溶液以4000r/min離心10min，棄去沉淀，收集上清液，上清液過(guò)0.45μm微孔濾膜，收集濾液，凍干即為配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體。

4.配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載體對(duì)疏水性抗腫瘤藥物的裝載

實(shí)施例8：

稱取具還原響應(yīng)性的的兩親性聚合物(CSO-SS-Hex)20mg溶于10ml超純水中，吸取1ml Fe₃O₄溶液(約10mg)，在劇烈攪拌條件下將其注入兩親性聚合物溶液中，細(xì)胞破碎儀(振幅30％，工作2s，停3s)超聲乳化3min，室溫下敞口攪拌使氯仿自然揮發(fā)，待氯仿?lián)]盡后，精密稱取10.0mg紫杉醇，溶于1ml無(wú)水乙醇中，配制成10mg/ml的紫杉醇乙醇溶液，將其以極緩慢的速度逐漸滴加到上述磁性納米載體溶液中，攪拌30min后，冰浴超聲(振幅30％，工作2s，停3s，15min)，超聲完畢，在劇烈攪拌下，以極緩慢的速度逐滴將3ml 1mg/ml的透明質(zhì)酸(分子量為14600Da)溶液加入其中，攪拌30min后，將其轉(zhuǎn)移到透析袋(MWCO：1000Da)中透析過(guò)夜，待透析結(jié)束，將透析袋中溶液全部轉(zhuǎn)移至燒杯中，以4000r/min離心10min，棄去沉淀，收集上清液，上清液過(guò)0.45μm微孔濾膜，收集濾液，凍干即為配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載藥復(fù)合物。

本發(fā)明采用將一定量的透明質(zhì)酸修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載藥復(fù)合物置于3500Da透析袋中，并將其放入含有不同濃度還原性谷胱甘肽(GSH)的緩沖液中，模擬載體在不同生理環(huán)境下的藥物釋放行為，間隔一定時(shí)間取出一定量的透析液，利用高效液相色譜計(jì)算不同時(shí)間藥物的累計(jì)釋放量，結(jié)果如圖17所示，該載體具明顯的還原響應(yīng)性，在高濃度的還原條件下可使藥物短時(shí)間內(nèi)大量釋放，而在非還原條件下，藥物可以被很好地保護(hù)，不會(huì)使其過(guò)早的釋放和泄露。

實(shí)施例9：

稱取具還原響應(yīng)性的的兩親性聚合物(CSO-SS-Chol)20mg溶于10ml超純水中，吸取1ml Fe₃O₄溶液(約10mg)，在劇烈攪拌條件下將其注入兩親性聚合物溶液中，細(xì)胞破碎儀(振幅30％，工作2s，停3s)超聲乳化3min，室溫下敞口攪拌使氯仿自然揮發(fā)，待氯仿?lián)]盡后，精密稱取10.0mg紫杉醇，溶于1ml無(wú)水乙醇中，配制成10mg/ml的紫杉醇乙醇溶液，將其以極緩慢的速度逐漸滴加到上述磁性納米載體溶液中，攪拌30min后，冰浴超聲(振幅30％，工作2s，停3s，15min)，超聲完畢，在劇烈攪拌下，以極緩慢的速度逐滴將3ml 1mg/ml的透明質(zhì)酸(分子量為14600Da)溶液加入其中，攪拌30min后，將其轉(zhuǎn)移到透析袋(MWCO：1000)中透析過(guò)夜，待透析結(jié)束，將透析袋中溶液全部轉(zhuǎn)移至燒杯中，以4000r/min離心10min，棄去沉淀，收集上清液，上清液過(guò)0.45μm微孔濾膜，收集濾液，凍干即為配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載藥復(fù)合物。

實(shí)施例10：

稱取具還原響應(yīng)性的兩親性聚合物(CSO-SS-VE)20mg溶于10ml超純水中，吸取1mlFe₃O₄溶液(約10mg)，在劇烈攪拌條件下將其注入兩親性聚合物溶液中，細(xì)胞破碎儀(振幅30％，工作2s，停3s)超聲乳化3min，室溫下敞口攪拌使氯仿自然揮發(fā)，待氯仿?lián)]盡后，精密稱取10.0mg紫杉醇，溶于1ml無(wú)水乙醇中，配制成10mg/ml的紫杉醇乙醇溶液，將其以極緩慢的速度逐漸滴加到上述磁性納米載體溶液中，攪拌30min后，冰浴超聲(振幅30％，工作2s，停3s，15min)，超聲完畢，在劇烈攪拌下，以極緩慢的速度逐滴將3ml 1mg/ml的透明質(zhì)酸(分子量為14600Da)溶液加入其中，攪拌30min后，將其轉(zhuǎn)移到透析袋(MWCO：1000)中透析過(guò)夜，待透析結(jié)束，將透析袋中溶液全部轉(zhuǎn)移至燒杯中，以4000r/min離心10min，棄去沉淀，收集上清液，上清液過(guò)0.45μm微孔濾膜，收集濾液，凍干即為配體修飾的還原響應(yīng)型磁性納米載藥復(fù)合物。