本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種中藥的用途，即秦皮素具有抗結(jié)腸癌作用的用途。

背景技術(shù)：

大腸癌(包括結(jié)腸癌和直腸癌)，是臨床上常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。在我國(guó)，近30年來(lái)，結(jié)直腸癌發(fā)病率年均上升3％～4％，結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡例數(shù)分別占到全世界發(fā)病和死亡例數(shù)的18.6％和20.1％，均居第一位。盡管從二十世紀(jì)九十年代中期開(kāi)始，大腸癌的全球發(fā)生率逐年下降，但是自1992年起，大腸癌在50歲以下人群中的發(fā)生率卻在以每年1.8％的比例升高。因此，大腸癌治療仍然是全球腫瘤研究的重要方向。

傳統(tǒng)腫瘤治療方案專注于去除腫瘤部位細(xì)胞。以往的研究中合成了許多作用明確的化學(xué)抗癌藥，但是由于化學(xué)藥品的開(kāi)發(fā)費(fèi)用昂貴，且毒副作用大，往往制約了藥物的進(jìn)一步應(yīng)用。中草藥、植物藥等天然產(chǎn)物中存在著廣泛的生物活性物質(zhì)，其抗腫瘤活性越來(lái)越受醫(yī)藥界重視。并且，隨著中藥藥理學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科研究方法和技術(shù)手段的發(fā)展，中藥抗腫瘤的分子機(jī)制逐漸被揭示。中藥能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞多重耐藥作用等多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。

秦皮素(Fraxetin,FR)是一種天然香豆素類化合物，主要來(lái)源于木犀科大葉白蠟樹(shù)、小葉白蠟樹(shù)的樹(shù)皮，化學(xué)名稱為7,8-二羥基-6-甲氧基香豆素，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。已有研究報(bào)道，秦皮素具有抗菌、抗氧化和抗骨質(zhì)疏松等多種生理活性，目前在臨床上用于治療兒童急性菌痢。

趙婧暉等人發(fā)現(xiàn)，秦皮素能夠通過(guò)抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，簡(jiǎn)稱為EGFR)及其下游的AKT信號(hào)通路抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖及遷移。EGFR是上皮生長(zhǎng)因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體，其作用非常廣泛，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等多種生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用(趙婧暉,謝鯤鵬,隋佳琪,等.秦皮素通過(guò)抑制EGFR及其下游AKT信號(hào)通路抑制MCF-7細(xì)胞增殖及遷移[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2016(1):56-63.)。在許多實(shí)體腫瘤中存在EGFR的高表達(dá)或異常表達(dá)，EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。秦皮素抑制EGFR產(chǎn)生的影響大而廣泛，缺少明確的靶點(diǎn)；其次，由于EGFR在正常細(xì)胞中同樣也有表達(dá)，因此有可能同樣對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生影響，其作用的選擇性不明確。

英國(guó)科學(xué)家Hickman J A首次提出可以將誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作為以后腫瘤治療研究的主要目標(biāo)和手段，隨后誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為篩選抗癌藥物的新靶點(diǎn)和新熱點(diǎn)。(Hickman J A.Apoptosis induced by anticancer drugs[J].Cancer and Metastasis Reviews,1992,11(2):121-139.)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗結(jié)腸癌作用的藥物，該藥物通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，從而達(dá)到具有治療結(jié)腸癌的目的。

相對(duì)于秦皮素通過(guò)抑制EGFR信號(hào)通路發(fā)揮抗乳腺癌作用，本發(fā)明提供的秦皮素抗腫瘤機(jī)制更加具體，靶點(diǎn)更加明確。

本發(fā)明保護(hù)的是秦皮素在制備治療疫病結(jié)腸癌的藥物中的應(yīng)用。

秦皮素(標(biāo)準(zhǔn)品，純度98％)購(gòu)于江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所，為淡黃色片狀結(jié)晶。本發(fā)明中，將DMSO作為秦皮素的溶劑，配制2mg/mL的溶液，并將其保存于-20℃環(huán)境中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，利用RPMI-1640培養(yǎng)基將原溶液稀釋到不同濃度(終濃度分別為3.75、7.5、10、15、20、30、40、60、80、120μM)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本發(fā)明中，首先利用MTT法檢測(cè)了秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制活性，并計(jì)算得到其對(duì)HCT116的IC50值為40μM，確定了秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞具有良好的抑制活性；同時(shí)，利用顯微鏡拍照技術(shù)，觀察了給藥后細(xì)胞形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)秦皮素在15μM時(shí)即對(duì)細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響，具體表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，邊緣不清晰，貼壁細(xì)胞數(shù)明顯減少。為了檢測(cè)秦皮素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用是否具有時(shí)間以及劑量依賴性，發(fā)明人利用不同濃度(20、40、80μM)的秦皮素分別作用不同時(shí)間(24、48、72h)，觀察細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的抑制作用具有明顯的時(shí)間和劑量依賴性，即相同時(shí)間條件下，秦皮素劑量越高抑制效果越好；相同劑量條件下，秦皮素作用時(shí)間越長(zhǎng)抑制效果越好。在充分確定了秦皮素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用后，發(fā)明人又對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。具體為，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了不同劑量秦皮素對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。流式結(jié)果圖顯示，秦皮素能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且具有劑量依賴性，即秦皮素劑量越高，凋亡細(xì)胞比例越高。由此，確定了秦皮素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制，即通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。最后，為了確定秦皮素是否對(duì)正常細(xì)胞具有毒性，發(fā)明人利用小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加入不同濃度秦皮素(0、3.75、7.5、15、30、60μM)觀察小鼠脾細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，秦皮素在60μM范圍內(nèi)，對(duì)正常小鼠的脾細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性，即證明秦皮素對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性很小。由此說(shuō)明，秦皮素的作用具有選擇性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞的毒性極小。

本發(fā)明公開(kāi)秦皮素主要應(yīng)用于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體為秦皮素具有明顯的抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，可用來(lái)作為/制備抗結(jié)腸癌藥物。

本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，秦皮素主要通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮其抗結(jié)腸癌的作用。細(xì)胞凋亡在多種正常生理過(guò)程中可起到調(diào)節(jié)作用，若此功能出現(xiàn)異?；蛉笔t可導(dǎo)致一系列病理情況發(fā)生。腫瘤細(xì)胞的特征之一就是缺乏這種程序性的死亡過(guò)程。

結(jié)腸癌是胃腸道中常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率占胃腸道腫瘤的第3位，死亡率僅次于肺癌和肝癌，占我國(guó)惡性腫瘤第三位。目前常用的治療手段為放療和化療，其中五氟尿嘧啶為最主要的化療藥物。近幾年，免疫治療也作為一種治療手段進(jìn)入人們視野，其中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作為一種免疫治療手段備受關(guān)注。本發(fā)明中提供的秦皮素即通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮其抗結(jié)腸癌的作用。

針對(duì)趙婧暉等人的研究，即秦皮素通過(guò)抑制EGFR及其下游的AKT信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗乳腺癌的作用，鑒于EGFR作用的廣泛性，該研究中所述秦皮素的作用靶標(biāo)并不明確且并未探討秦皮素對(duì)于正常細(xì)胞的作用。因此，相對(duì)于秦皮素通過(guò)抑制EGFR信號(hào)通路發(fā)揮抗乳腺癌作用，本發(fā)明提供的秦皮素抗腫瘤機(jī)制更加具體，靶點(diǎn)更加明確，即通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，且該發(fā)明提供了秦皮素在發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的同時(shí)，對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性極小。

有益效果：所述秦皮素抗人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的效果明顯，其量效關(guān)系顯著；在低劑量15μM時(shí)即對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響；對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的抑制作用具有明顯的時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，可以通過(guò)加大劑量和延長(zhǎng)作用時(shí)間更好地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡作用明顯，在40μM時(shí)，凋亡細(xì)胞比例達(dá)到20％；在60μM以內(nèi)，對(duì)原代小鼠脾細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性，即本發(fā)明的秦皮素對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性極小，在殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞的殺傷不明顯，說(shuō)明其作用具有選擇性。

附圖說(shuō)明

圖1是秦皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖2是秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制作用

圖3是秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞形態(tài)的影響

圖4是秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞抑制作用的量效和時(shí)效關(guān)系

圖5是秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡的影響

圖6是秦皮素對(duì)原代小鼠脾細(xì)胞的毒性

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1：秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制作用

胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞(上述細(xì)胞使用含有10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng))，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁴個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液100μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。置于37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入用培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的秦皮素10μL/孔(終濃度分別為7.5、15、30、60、120μM)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置含RPMI-1640全培養(yǎng)基對(duì)照和未給予藥物作用的空白對(duì)照。37℃、5％CO₂培養(yǎng)48h后，每孔加入5mg/mL的MTT 15μL，置于37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心，小心吸去上清，每孔加入150μL DMSO，輕輕振蕩使甲臜完全溶解，在490nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)吸光值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

結(jié)果見(jiàn)圖2，圖2表明，在120μM濃度范圍內(nèi)秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞有明顯的抑制作用，且量效關(guān)系明顯，即藥物濃度越高，抑制效果越好。根據(jù)圖2數(shù)據(jù)計(jì)算得到秦皮素對(duì)HCT116細(xì)胞的IC50值為40μM，該數(shù)值較低，說(shuō)明秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌HCT116的抑制作用明顯。

實(shí)施例2：秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞體外形態(tài)學(xué)變化影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，用含有10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁴個(gè)/mL，均勻鋪至96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液100μL，置于37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞貼壁后，加入用培養(yǎng)基稀釋的不同濃度秦皮素10μL/孔(終濃度分別為0、3.75、7.5、15、30、60、120μM)，培養(yǎng)液調(diào)零，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照。

按照上述方法，結(jié)果如附圖3所示，秦皮素在15μM之后即對(duì)細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生明顯的變化。具體表現(xiàn)為：細(xì)胞皺縮，邊緣不清晰，貼壁細(xì)胞數(shù)明顯減少。

實(shí)施例3：秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞體外生長(zhǎng)抑制的時(shí)間和劑量依賴關(guān)系

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，用含有10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁴個(gè)/mL，于96孔培養(yǎng)板中加入細(xì)胞懸液100μL，并加入用培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的秦皮素10μL/孔(終濃度分別為0、10、20、40μM)，培養(yǎng)液調(diào)零，37℃、5％CO₂培養(yǎng)不同時(shí)間(24h、48h、72h)，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入5mg/mL的MTT 15μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心，小心吸去上清，每孔加入150μL DMSO，輕輕振蕩以使甲臜完全溶解，在490nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)吸光值，計(jì)算細(xì)胞活率。

結(jié)果如圖4所示，表明秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的抑制作用具有明顯的時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。隨著時(shí)間增加，相同劑量下秦皮素對(duì)HCT116細(xì)胞的抑制作用加強(qiáng)。在相同時(shí)間下，隨著劑量增加，秦皮素對(duì)HCT116細(xì)胞的殺傷作用明顯增強(qiáng)。

實(shí)施例4：秦皮素對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，用含有10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁴個(gè)/mL，均勻鋪至6孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液2mL，并加入用培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的秦皮素20μL/孔(終濃度分別為0、10、20、40μM)，培養(yǎng)液調(diào)零，37℃、5％CO₂培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去上清，用不含EDTA的胰酶消化，300g，4℃離心5min收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次均在300g，4℃離心5min。收集5×10⁵細(xì)胞。加入100μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI staining solution，輕輕混勻，避光，室溫反應(yīng)10min。加入400μL 1×Binding Buffer，混勻，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算凋亡細(xì)胞比例。

結(jié)果如圖5所示，圖5表明秦皮素體外對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞殺傷作主要是通過(guò)誘導(dǎo)其凋亡。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，秦皮素在10μM之后，誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡作用明顯，且具有明顯的劑量依賴關(guān)系，即藥物濃度越高，凋亡細(xì)胞越多。

實(shí)施例5：秦皮素對(duì)原代小鼠脾細(xì)胞的影響

取ICR雄性小鼠一只，頸部脫臼處死，無(wú)菌制備脾淋巴細(xì)胞懸液，用含有10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，置細(xì)胞瓶中培養(yǎng)過(guò)夜，于24h后，取上層懸浮細(xì)胞，離心后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁶個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL細(xì)胞懸液，然后加入各濃度梯度藥物(終濃度分別為0、3.75、7.5、15、30、60μM)，置于37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。48h后每孔加入5mg/mL的MTT 15μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心棄上清，每孔加入150μL DMSO，酶標(biāo)儀490nm處測(cè)吸光值。

結(jié)果見(jiàn)圖6，圖6表明低濃度(60μM以內(nèi))秦皮素對(duì)原代小鼠脾細(xì)胞無(wú)明顯毒性，即低濃度秦皮素對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的殺傷很小。