本發(fā)明屬于腫瘤治療藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及前列腺素D2（PGD2）在制備治療胃癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

PGD2是前列腺素的一種，是重要的細(xì)胞信號分子，它的合成主要通過以下的生物過程：細(xì)胞膜上的磷脂酶A 轉(zhuǎn)化成花生四烯酸，后者在環(huán)氧化酶（包括COX-1 和COX-2）的催化下，被分解成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物前列腺素H2，前列腺素H2又被三種不同的酶：前列腺素D合成酶（PGDS），前列腺素E合成酶及前列腺素F合成酶轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的PGD2，PGE2，PGF2。PGDS前列腺素系列的關(guān)鍵酶系,又包括脂質(zhì)運(yùn)載蛋白型PGD 合成酶（L-PTGDS）和造血型PGD合成酶（H-PTGDS）；

研究表明前列腺素具有抑制炎癥，減少胃酸分泌，胃腸平滑肌蠕動等作用，因此目前臨床上的用途主要用于治療哮喘、胃腸潰瘍病、休克、高血壓及心血管疾病。

增殖和遷移是腫瘤細(xì)胞最重要的生物學(xué)特征，某種程度上反應(yīng)了腫瘤的生長速度和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力；PGD2在腫瘤中的作用及機(jī)制極少被研究，雖有零星報(bào)道證明PGD2可能抑制腦部腫瘤增殖，但是PGD2對胃癌細(xì)胞增殖和遷移是否有作用，目前并無報(bào)道。

CRTH2又叫GPR44，是PGD2特異性受體之一，主要表達(dá)于Th2細(xì)胞中，但據(jù)The Human Protein Atlas網(wǎng)站（http://www.proteinatlas.org/）中的信息，此受體亦可以表達(dá)于胃粘膜中，然而其作用并不清楚。本發(fā)明通過基因的敲減實(shí)驗(yàn)首次公開，PGD2對腫瘤細(xì)胞體外擴(kuò)增和遷移的抑制作用依賴于CRTH2受體。

腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展甚至是耐藥的種子細(xì)胞，自我更新能力是腫瘤干細(xì)胞的重要特征，對腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的抑制作用是腫瘤治療研究的熱點(diǎn)，PGD2及相關(guān)的信號傳導(dǎo)是否影響腫瘤干細(xì)胞擴(kuò)增和分化國內(nèi)外仍無公開報(bào)道。已有的研究結(jié)果顯示，PGD2合成限速酶L-PTGDS和受體CRTH2的表達(dá)與胃癌干細(xì)胞標(biāo)記Sall4、Lgr5的表達(dá)呈負(fù)向相關(guān)，證明PGD2/CRTH2信號可能調(diào)控為干細(xì)胞的自我更新。本專利首次公開PGD2對胃癌腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提出PGD2在胃癌治療發(fā)展中的新用途以及PGD2在胃癌抑制藥物方面的新應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種PGD2在制備治療胃癌藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種PGD2在抑制胃癌細(xì)胞擴(kuò)增和遷移的新應(yīng)用。

本發(fā)明通過試驗(yàn)證明，PGD2能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞體外擴(kuò)增和遷移，本發(fā)明首次公開PGD2可以有效的控制胃癌細(xì)胞的生長。

本發(fā)明涉及的PGD2抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移的證明過程還包括抑制PGD2合成的關(guān)鍵酶和受體表達(dá)，反向證明PGD2對胃癌細(xì)胞的作用。通過干擾PGD2合成的關(guān)鍵酶（L-PTGDS），降低內(nèi)源性PGD2的分泌，以及降低受體CRTH2表達(dá)證明內(nèi)源性PGD2對腫瘤細(xì)胞體外擴(kuò)增和遷移的抑制作用。

在一具體實(shí)例中，PGD2能夠抑制胃癌細(xì)胞株HGC-27和SGC-7901的體外擴(kuò)增和遷移能力；

在一具體實(shí)例中，通過小發(fā)卡RNA（shRNA）的敲減胃癌中PGD2合成的限速酶L-PTGDS及PGD2受體分子CRTH2，證明內(nèi)源性PGD2對腫瘤細(xì)胞體外增殖和遷移的抑制作用，并提示這種作用是通過CRTH2信號完成。

本發(fā)明還提供的一種PGD2在抑制胃癌細(xì)胞干性基因表達(dá)和自我更新的新應(yīng)用；

本發(fā)明還通過試驗(yàn)證明，本發(fā)明涉及的PGD2還能夠抑制胃癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的自我更新能力；PGD2能夠下調(diào)干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，并抑制胃癌干細(xì)胞的自我更新能力，具有極佳的臨床應(yīng)用價(jià)值。

在一具體實(shí)例中，外源性PGD2能夠有效地控制HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的成球能力（自我更新能力）和干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，為PGD2體外抑制胃癌生長提供理論依據(jù)；

在一具體實(shí)例中，通過小發(fā)卡RNA（shRNA）的敲減胃癌中PGD2合成的限速酶L-PTGDS及PGD2受體分子CRTH2，證明內(nèi)源性PGD2對能夠有效地控制HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的成球能力（自我更新能力），提示這種作用是通過CRTH2受體完成。

本發(fā)明還提供一種治療胃癌的藥物，所述藥物包含有效成分前列腺素D2。

所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體，為本領(lǐng)域公知常識，在此不做贅述。

本發(fā)明的有益效果：

由上述描述不難發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明涉及的是PGD2的新應(yīng)用和控制胃癌細(xì)胞生長的新方法，與現(xiàn)有PGD2用途相比，具有以下的特點(diǎn)：

（1）外源性PGD2直接處理能夠有效地控制胃癌細(xì)胞株的體外克隆能力（增殖擴(kuò)增能力）和遷移能力，將合成PGD2的限速酶L-PTGDS和PGD2作用受體CRTH2應(yīng)用小發(fā)卡RNA進(jìn)行敲減后，胃癌細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力和遷移能力有明顯的上調(diào)，反向證明內(nèi)源性的PGD2對胃癌細(xì)胞的作用，證明PGD2通過CRTH2受體抑制腫瘤細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)特性，因此本發(fā)明具有重要的臨床意義。

（2）外源性的PGD2刺激能夠有效地控制胃癌細(xì)胞株的干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)和腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力，將合成PGD2的限速酶L-PTGDS和PGD2作用受體CRTH2應(yīng)用小發(fā)卡RNA進(jìn)行敲減后，對胃癌干細(xì)胞的這種抑制作用消失，由此本發(fā)明首次公開PGD2通過CRTH2受體抑制腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性的新作用和控制胃癌進(jìn)展的新機(jī)制，因此本發(fā)明具有重要的臨床意義。

附圖說明

圖1為不同濃度的PGD2對SGC-7901（圖A）和HGC-27（圖B）細(xì)胞增殖的抑制作用（***表示DMSO組與其他各組比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)p值均小于0.001）；

圖2為不同濃度的PGD2對SGC-7901細(xì)胞遷移的抑制作用；A：Transwell檢測細(xì)胞遷移能力100x；B：依據(jù)A圖結(jié)果，計(jì)數(shù)每高倍鏡下細(xì)胞數(shù)量（p<0.001表示DMSO組與其他各組比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)p值均小于0.001）；

圖3為不同濃度的PGD2對HGC-27細(xì)胞遷移的抑制作用；A：Transwell檢測細(xì)胞遷移能力100x；B：依據(jù)A圖結(jié)果，計(jì)數(shù)每高倍鏡下細(xì)胞數(shù)量（p<0.001表示DMSO組與其他各組比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)p值均小于0.001）；

圖4為成球?qū)嶒?yàn)檢測外源性的PGD2抑制HGC-27細(xì)胞自我更新能力（***表示DMSO組與其他各組比較p<0.001）。

圖5為成球?qū)嶒?yàn)檢測外源性的PGD2抑制SGC-7901細(xì)胞自我更新能力（***表示DMSO組與其他各組比較p<0.001）。

圖6為定量PCR檢測外源性的PGD2抑制HGC-27（圖A）和SGC-7901（圖B）細(xì)胞干性標(biāo)記基因mRNA的表達(dá)（*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示DMSO組與其他各組比較p<0.001）。

圖7為Western Blot檢測外源性的PGD2抑制HGC-27細(xì)胞（圖A）和SGC-7901細(xì)胞（圖B）Sall4、Nanog、Oct4蛋白表達(dá)。

圖8為HGC-27和SGC-7901中敲減L-PTGDS及CRTH2的表達(dá)；A：定量PCR檢測HGC-27細(xì)胞中L-PTGDS及CRTH2的表達(dá)；B：定量PCR檢測SGC-7901細(xì)胞中L-PTGDS及CRTH2的表達(dá)；C：ELISA檢測HGC-27細(xì)胞敲減L-PTGDS及CRTH2后，上清中PGD2因子的含量（***表示shGFP組與其他各組比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)p值均小于0.001）。

圖9為克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測L-PTGDS及CRTH2敲減對HGC-27增殖的影響；A：克隆形成的大體照片；B：對A圖中克隆的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)數(shù)每高倍鏡視野中克隆個數(shù)（***表示shGFP組與其他各組比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)p值均小于0.001）

圖10為克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測L-PTGDS及CRTH2敲減對SGC-7901增殖的影響；A：克隆形成的大體照片；B：對A圖中克隆的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)數(shù)每高倍鏡視野中克隆個數(shù)（***表示shGFP組與其他各組比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)p值均小于0.001）；

圖11為Transwell實(shí)驗(yàn)檢測L-PTGDS及CRTH2敲減對HGC-27細(xì)胞遷移的影響；A：Transwell膜下方穿過細(xì)胞的照片100x；B：對A圖中遷過細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)數(shù)每高倍鏡視野中克隆個數(shù)（***表示shGFP組與其他各組比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)p值均小于0.001）；

圖12為Transwell實(shí)驗(yàn)檢測L-PTGDS及CRTH2敲減對HGC-27細(xì)胞遷移的影響；A：Transwell膜下方穿過細(xì)胞的照片100x；B：對A圖中遷過細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)數(shù)每高倍鏡視野中克隆個數(shù)（***表示shGFP組與其他各組比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)p值均小于0.001）。

圖13為成球?qū)嶒?yàn)檢測L-PTGDS和CRTH2敲減后HGC-27細(xì)胞自我更新能力（***表示shGFP組與其他各組比較p<0.001）。

圖14為定量PCR檢測L-PTGDS和CRTH2敲減后HGC-27細(xì)胞（圖A）和SGC-7901細(xì)胞（圖B）干性標(biāo)記基因mRNA的表達(dá)（*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示DMSO組與其他各組比較p<0.001）。

圖15為Western Blot檢測L-PTGDS和CRTH2敲減后HGC-27和SGC-7901細(xì)胞Sall4、Nanog、Oct4蛋白表達(dá)。

圖16為成球?qū)嶒?yàn)檢測外源性的PGD2對L-PTGDS和CRTH2敲減后HGC-27細(xì)胞自我更新能力的影響（**表示p<0.01；***表示DMSO組與其他各組比較p<0.001）。

具體實(shí)施實(shí)例

以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明更好的闡述，以便與對本發(fā)明更好的理解。

實(shí)施例所使用的主要材料和來源分別如下：

細(xì)胞培養(yǎng)試劑：1640 DMEM（Gibco公司產(chǎn)品）、胎牛血清（Gibco公司產(chǎn)品）、胰蛋白酶（Sigma公司產(chǎn)品）、二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma公司)、無血清培養(yǎng)基（上海依科賽公司）、human EGF因子（Gibco公司）、human FGF因子（Gibco公司）、B27（Gibco公司）、RNA提取試劑盒（上海英駿公司）、細(xì)胞蛋白提取試劑盒（碧云天公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾維贊公司）、Western Blot相關(guān)試劑（碧云天公司）；結(jié)晶紫（上海碧云天試劑有限公司）。

倒置顯微鏡、生物顯微鏡、超凈工作臺、臺式離心機(jī)；

PGD2純品（美國Sigma公司）、24（6）孔培養(yǎng)板（Corning公司）、Transwell遷移板（Corning公司）；敲減L-PTGDS及CRTH2的shRNA慢病毒（簡稱：shL-PTGDS及shCRTH2）及對照病毒（shGFP）（賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司）、定量PCR mix（南京諾維贊生物科技有限公司）、定量PCR排管（Biorad公司）。

胃癌細(xì)胞株HGC-27、SGC-7901購自中科院上海細(xì)胞所。

實(shí)施例1：外源性的PGD2抑制胃癌細(xì)胞株SGC7901和HGC-27的體外擴(kuò)增和遷移

（1） PGD2純品的稀釋：由美國Sigma公司購得PGD2因子（1mg裝），加入100μL的二甲亞砜（DMSO）試劑進(jìn)行溶解，稀釋成濃度為100ng/μL的母液，再用空白1640DMEM培養(yǎng)液將母液按1:1000的比例稀釋為100pg/μL的營養(yǎng)液（后續(xù)步驟所提提到的應(yīng)用液均為此濃度）；

（2） 外源性PGD2對腫瘤細(xì)胞體外增殖影響：將HGC-27和SGC-7901細(xì)胞種在24孔板中，細(xì)胞密度為5000/孔，同時加入不同量的PGD2應(yīng)用液進(jìn)行刺激，使細(xì)胞接觸的終濃度為：50pg/mL, 500pg/mL 和5ng/mL，DMSO為對照。在不同濃度PGD2作用24h，48h，72h后計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果顯示，從24h開始，與陰性對照DMSO相比，PGD2抑制HGC-27和SGC-7901細(xì)胞數(shù)量的增加，并且這種抑制作用與PGD2作用濃度呈依賴關(guān)系，濃度越高抑制越明顯，如圖1，圖中***表示DMSO組與其他各組比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)p值均小于0.001。

（3）外源性PGD2對腫瘤細(xì)胞體外遷移作用的影響：將HGC-27和SGC-7901細(xì)胞種在6板中，細(xì)胞密度為100000/孔，待細(xì)胞完全貼壁后加入不同量的PGD2應(yīng)用液進(jìn)行刺激，使細(xì)胞接觸的終濃度為：50pg/mL, 500pg/mL和5ng/mL，DMSO為對照。PGD2刺激48h后，通過胰酶消化各孔細(xì)胞后計(jì)數(shù)，將不同濃度PGD2作用后的細(xì)胞以100000種在Transwell小室中（用無血清的1640DMEM稀釋），Transwell孔的下室加500μL含有10%胎牛血清的1640DMEM培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h，取出Transwell板通過4%多聚甲醛進(jìn)行固定后應(yīng)用結(jié)晶紫進(jìn)行染色，通過棉簽將培養(yǎng)小室膜上方細(xì)胞擦凈，計(jì)數(shù)膜下方細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果顯示，與陰性對照DMSO相比，PGD2顯著得抑制HGC-27和SGC-7901遷移能力，并且這種抑制作用與PGD2作用濃度呈依賴關(guān)系，濃度越高對HGC-27和SGC-7901遷移抑制作用越明顯（圖2，圖3）。

實(shí)施例2：外源性的PGD2抑制胃癌細(xì)胞自我更新能力和相關(guān)基因表達(dá)

PGD2純品的稀釋同實(shí)施例1。

（1） 外源性PGD2對腫瘤細(xì)胞成球能力（自我更新能力）的抑制作用：首先配置干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（配方為：20ng/mL EGF、10ng/mL FGF、1:50 B27因子），將HGC-27和SGC-7901細(xì)胞種在6孔板中，培養(yǎng)條件為無血清干細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞密度為5000/孔，同時加入不同量的PGD2應(yīng)用液進(jìn)行刺激，使細(xì)胞接觸的終濃度為：50pg/mL、 500pg/mL 和5ng/mL，DMSO為對照，培養(yǎng)7天后，40倍顯微鏡下觀察成球個數(shù)（直徑大于70μm即為為一個球），200倍下觀察成球大小，結(jié)果顯示，與陰性對照DMSO相比，外源性的PGD2顯著地抑制了HGC-27和SGC-7901細(xì)胞成球的數(shù)量和球體的大小，并且這種抑制作用與PGD2作用濃度呈依賴關(guān)系，濃度越高抑制越明顯（圖4，圖5），這一結(jié)果就表明PGD2抑制胃癌干細(xì)胞的自我更新能力；

（2）外源性PGD2抑制胃癌干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)：將HGC-27和SGC-7901細(xì)胞種在6孔板中（2塊），培養(yǎng)條件為無血清干細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞密度為500000/孔，同時加入不同量的PGD2應(yīng)用液進(jìn)行刺激，使細(xì)胞接觸的終濃度為：50pg/mL, 500pg/mL 和5ng/mL，DMSO為對照，培養(yǎng)48h后，取一塊6孔板進(jìn)行RNA提取工作（按照RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行），逆轉(zhuǎn)錄后檢測PGD2對Sall4、Oct4、Nanog、Lgr5、Sox2、CD44干性基因的mRNA表達(dá)情況的影響，結(jié)果顯示外源性的PGD2顯著地抑制了HGC-27和SGC-7901細(xì)胞Sall4、Oct4、Nanog、Lgr5、Sox2、CD44干性基因的mRNA，并且這種抑制作用與PGD2作用濃度呈依賴關(guān)系，濃度越高抑制越明顯（圖6）；取同樣：50pg/mL, 500pg/mL 和5ng/mL PGD2刺激的另一塊6孔板進(jìn)行蛋白提取（按照蛋白提取試劑盒說明書），通過Western Blot檢測外源性的PGD2對HGC-27和SGC-7901細(xì)胞Sall4、Oct4、Nanog的蛋白水平表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，外源性的PGD2顯著地抑制了HGC-27和SGC-7901細(xì)胞all4、Oct4、Nanog的蛋白的表達(dá)，并且這種抑制作用與PGD2作用濃度呈依賴關(guān)系，濃度越高抑制越明顯（圖7）。

表1 引物序列如下

實(shí)施例3：通過小發(fā)卡RNA（shRNA）敲減胃癌中PGD2合成的限速酶L-PTGDS及PGD2受體分子CRTH2，證明內(nèi)源性PGD2對腫瘤細(xì)胞體外增殖和遷移的抑制作用，并提示這種作用是通過CRTH2信號完成。

對實(shí)施例3中涉及的關(guān)鍵分子進(jìn)行介紹：L-PTGDS是PGD2合成的關(guān)鍵酶，換言之，L-PTGDS表達(dá)量影響細(xì)胞自身分泌PGD2的量，敲減L-PTGDS的表達(dá)可以有效地的減少PGD2的分泌；而CRTH2是PGD2結(jié)合重要受體，主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，是PGD2向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號重要分子，敲減CRTH2可以阻斷PGD2對靶細(xì)胞的功能。

對本發(fā)明實(shí)施例3具體實(shí)施步驟描述如下：

（1）敲減L-PTGDS及CRTH2細(xì)胞株的構(gòu)建：通過南京諾維贊公司構(gòu)建shL-PTGDS及shCRTH2的慢病毒，依據(jù)公司提供的轉(zhuǎn)染步驟對HGC-27和SGC-7901細(xì)胞中L-PTGDS和CRTH2的表達(dá)進(jìn)行敲減，以shGFP為敲減的陰性對照，依據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染的說明書操作步驟獲得了shGFP，shL-PTGDS及shCRTH2的穩(wěn)定細(xì)胞株；

（2）HGC-27及SGC-7901細(xì)胞中L-PTGDS和CRTH2敲減效果的檢測：獲得shGFP，shL-PTGDS及shCRTH2細(xì)胞株后，通過定量PCR分析敲減的效果，結(jié)果顯示shL-PTGDS轉(zhuǎn)染HGC-27和SGC-7901細(xì)胞中L-PTGDS表達(dá)減低，shCRTH2轉(zhuǎn)染組CRTH2敲減成功（圖8A， 8B），重要的是，HGC-27細(xì)胞中敲減L-PTGDS后自分泌的PGD2分泌量減少（圖8C）；

表2.CRTH2和L-PTGDS的PCR擴(kuò)增的引物序列如下：

（3）降低內(nèi)源性PGD2分泌和阻斷其受體后胃癌細(xì)胞株增殖能力的檢測：本發(fā)明通過克隆形成實(shí)驗(yàn)分析了shL-PTGDS（通過shRNA干擾L-PTGDS表達(dá)的腫瘤細(xì)胞）及shCRTH2細(xì)胞（通過shRNA干擾CRTH2表達(dá)的腫瘤細(xì)胞）的增殖能力，將1000個細(xì)胞種于6孔板中，二氧化碳培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)7天后對其結(jié)晶紫的染色，觀察其形成克隆的大小和多少，結(jié)果顯示，L-PTGDS和CRTH2敲減后HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的體外擴(kuò)增速度明顯的高于對照細(xì)胞（shGFP）（圖9 和圖10），此結(jié)果表明內(nèi)源性PGD2對胃癌細(xì)胞增殖具有抑制作用。

（4）降低內(nèi)源性PGD2分泌和阻斷其受體后胃癌細(xì)胞株遷移能力的檢測：本發(fā)明通過Transwell實(shí)驗(yàn)分析了shL-PTGDS及shCRTH2細(xì)胞的遷移能力，將100000個待檢細(xì)胞懸浮于200微升的無血清的DMEM中并將其種于Transwell小室的上方，小室下方加入500微升的有血清的培養(yǎng)基，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中12h后，將小室取出，通過結(jié)晶紫染色觀察遷移至小室下方細(xì)胞的多少，結(jié)果顯示，L-PTGDS和CRTH2敲減后HGC-27和SGC-7901細(xì)胞遷移速度明顯的高于shGFP對照細(xì)胞（圖11 和圖12），此結(jié)果提示內(nèi)源性PGD2對抑制HGC-27和SGC-7901細(xì)胞遷移作用。

實(shí)施例4：通過小發(fā)卡RNA（shRNA）敲減胃癌中PGD2合成的限速酶L-PTGDS及PGD2受體分子CRTH2，證明內(nèi)源性PGD2對腫瘤細(xì)胞自我更新和基因表達(dá)的抑制作用。

敲減L-PTGDS及CRTH2細(xì)胞株的構(gòu)建及敲減效果監(jiān)測同實(shí)施例3。

（1）降低內(nèi)源性PGD2分泌和阻斷其受體后胃癌細(xì)胞株成球能力的檢測：本發(fā)明通過成球?qū)嶒?yàn)分析了shL-PTGDS及shCRTH2細(xì)胞的自我更新能力，結(jié)果顯示，L-PTGDS和CRTH2敲減后HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的成球能力明顯的高于對照細(xì)胞（shGFP）（圖13），此結(jié)果表明內(nèi)源性PGD2對胃癌細(xì)胞成球能力明顯地抑制作用。

（2）降低內(nèi)源性PGD2分泌和阻斷其受體對胃癌細(xì)胞株干性基因表達(dá)的影響：本發(fā)明通過定量PCR實(shí)驗(yàn)分析了shL-PTGDS及shCRTH2細(xì)胞的Sall4、Oct4、Nanog、Lgr5、Sox2、CD44干性基因的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，L-PTGDS和CRTH2敲減后HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的Sall4、Oct4、Nanog、Lgr5、Sox2、CD44干性基因明顯的高于對照細(xì)胞（shGFP）（圖14）；Western Blot檢測Sall4、Nanog、Oct4蛋白水平的檢測也顯示了同樣的結(jié)果（圖15）。

（3）為了進(jìn)一步證明PGD2對胃癌干細(xì)胞的作用，將外源性的PGD2（5ng/mL）刺激shGFP、shL-PTGDS、shCRTH2細(xì)胞，結(jié)果顯示，5ng/ml的PGD2抑制了shGFP和shL-PTGDS細(xì)胞的成球能力，而對shCRTH2細(xì)胞無明顯地作用（圖 16），這一結(jié)果表明外源性PGD2回補(bǔ)了了shL-PTGDS敲減引起的PGD2的缺失，而PGD2這種作用是通過CRTH2完成的。