本發(fā)明涉及藏紅花素的藥效作用，特別是對缺血再灌注引起的腦損傷和缺血性腦卒中的藥效保護作用。

背景技術：

腦卒中，又稱腦中風或腦血管意外，主要分為缺血性腦卒中(腦梗塞、腦血栓形成)和出血性腦卒中(腦出血、蛛網膜下腔出血)兩大類。其中，缺血性腦卒中約占全部腦卒中的70％-80％，具有極高的病死率和致殘率，對患者危害極大，往往造成不可逆的腦部損傷，給家庭和社會造成極大的負擔，且呈現(xiàn)年輕化的趨勢。近年來，雖然在腦缺血發(fā)生機理及預防治療方面取得了許多的新成果，但其治療選擇仍非常有限，臨床治療藥物研發(fā)相對滯后。因此尋找新的防治缺血性腦卒中的藥物具有重要的學術價值和臨床意義。

近年研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后有相當部分的血管能夠自然再通或經溶栓治療后血流恢復再通，但隨之而來的是出現(xiàn)再灌注損傷。腦缺血一定時間恢復血液供應后，其功能不但未能恢復，卻出現(xiàn)更加嚴重的腦機能障礙。腦缺血再灌注損傷成為缺血性腦卒中的重要病理機制。

本發(fā)明中的藏紅花素來源于天然藥物藏紅花和梔子，是一種天然存在稀有的水溶性的類胡蘿卜素植物黃色素(圖1)。藥理研究表明藏紅花素具有保護心腦血管、清除自由基、改善記憶和學習能力、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性，又有很高安全性。依達拉奉，是第一個批準用于臨床的自由基清除型腦保護劑，主要用于缺血性腦卒中的急性期伴神經癥狀的治療。我們的研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素在口服給藥時對缺血再灌注腦損傷的保護作用優(yōu)于陽性藥依達拉奉，且明顯優(yōu)于靜注給藥組，有望通過進一步研究和開發(fā)，用于預防和治療臨床缺血再灌注所引起的腦損傷和缺血性腦卒中。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明人通過對sd大鼠建立短暫性大腦中動脈缺血再灌注(mcao)模型，以臨床一線藥物依達拉奉注射液為陽性藥，評價了藏紅花素口服和靜注給藥的腦保護作用。研究發(fā)現(xiàn)灌胃給予藏紅花素能顯著減小mcao所致的腦組織梗死，減輕神經功能障礙，減少腦組織mda含量，提高腦組織總抗氧化能力。同時，代謝組學研究表明灌胃給予藏紅花素后對腦組織內源性物質整體代謝的調節(jié)作用優(yōu)于陽性藥依達拉奉，更趨向于假手術組。提示藏紅花素具有保護缺血再灌注腦損傷的作用，有望經過研究用于臨床缺血性腦卒中治療。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供了藏紅花素在制備缺血性腦損傷藥物中的應用，實驗證明藏紅花素口服給藥具有更好的腦保護作用，為制備治療和預防缺血性腦卒中藥物提供了更多的選擇。

附圖說明

附圖1藏紅花素結構式。

附圖2腦組織梗塞體積和行為評分統(tǒng)計

a：ttc染色觀察腦梗死面積，其中白色為梗死區(qū)域；

b：各組梗死體積百分率統(tǒng)計圖；

c：各組神經行為評分統(tǒng)計圖。其中，sham表示假手術組，model表示模型組，edarav.為陽性藥依達拉奉組，crocin-i.v為藏紅花素靜注給藥組，crocin-i.g為藏紅花素灌胃給藥組，*p＜0.05，**p＜0.01vsmodel。

附圖3腦組織自由基與抗氧化參數(shù)

a：腦組織丙二醛含量；

b：腦組織總抗氧化能力。#p＜0.05，##p＜0.01vssham；*p＜0.05，**p＜0.01vsmodel。

附圖4腦組織代謝組學分析pls-da散點圖。

其中，s為假手術組，m為模型組，e為陽性藥依達拉奉組，v為藏紅花素靜注給藥組，g為藏紅花素灌胃給藥組。

附圖5各組對比分析

a：假手術組和模型組opls-da分析圖；

b：假手術組和模型組s-plot圖；

c：模型組和藏紅花素灌胃給藥組opls-da分析圖；

d：模型組和藏紅花素灌胃給藥組s-plot圖。

其中，s為假手術組，m為模型組，g為藏紅花素灌胃給藥組。

具體實施方式

本發(fā)明通過下面的實施例進行詳細的解釋，但并不意味著本發(fā)明僅限于此。

實施例1藏紅花素對腦梗塞體積和行為學改善作用

采用sd大鼠(50只，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體重240±20g)進行試驗。在標準飼養(yǎng)環(huán)境下(自由飲食與飲水，晝夜交替，各12小時)，適應性飼養(yǎng)一周。隨后，隨機分為5組，即假手術組、模型組、陽性藥組、藏紅花素靜注給藥組和藏紅花素灌胃給藥組。所有大鼠實驗前均禁食12h以上，可自由飲水。

動物模型的建立：10％水合氯醛(1ml/300g)腹腔注射麻醉動物后，參照改良的zealonga線栓法建立大腦中動脈阻塞模型。假手術組不插入線栓，其余操作同模型組。

實驗設計和分組如下：假手術組和模型組(再灌注時給予等量生理鹽水)、陽性藥組(復方依達拉奉注射液，先聲藥業(yè)，再灌注時給予3mg/kg)、藏紅花素靜注給藥組(再灌注時給予1mg/kg)、藏紅花素灌胃給藥組(缺血后給予58.6mg/kg，并于實驗前預給藥3天)，每組6只。大鼠腦缺血2h，再灌注22h后，參考zea-longa的5分制評分標準進行神經行為學評分(具體如下：0分：行為正常；1分：對側前肢不能完全伸展；2分：向左側轉圈；3分：向左側傾倒及不能站立；4分：不能行走，意識不清)，隨后用水合氯醛麻醉，生理鹽水心臟灌流后取腦組織，沿冠狀面切成厚度基本相同的6片，2％ttc(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，sigma)于37℃避光染色15min，用掃描儀掃描并使用imageproplus6.0圖像分析軟件統(tǒng)計梗死體積。實驗過程中剔除死亡及沒有明顯行為學變化的大鼠。

對大鼠腦梗塞體積和行為的影響：結果表明，假手術組腦組織未見梗塞，模型組經腦水腫矯正后梗塞體積百分率為45.6±13.1％。與模型組比較，陽性對照組可顯著縮小腦組織梗塞體積，藏紅花素靜注給藥組也可明顯縮小腦組織梗塞體積，但個體差異較大。藏紅花素灌胃給藥組與模型組比較，腦梗塞體積顯著降低(p＜0.01)(圖2a和2b)。行為學評分結果顯示，假手術組大鼠均無異常癥狀，行為評分為0；模型組動物出現(xiàn)對側前肢不能完全伸展，向對側轉圈或向對側傾倒等運動功能障礙，其行為學評分為2.3±0.5分。陽性藥組與模型組相比可顯著降低行為學評分(p＝0.015)，藏紅花素靜注給藥組與模型組相比無顯著差異(p＝0.122)，藏紅花素灌胃給藥組與模型組相比行為學評分顯著改善(p＝0.001)(圖2c)。結果顯示藏紅花素灌胃給藥對缺血再灌注腦損傷的保護作用優(yōu)于陽性藥依達拉奉，且明顯優(yōu)于靜注給藥組。

實施例2藏紅花素對腦組織丙二醛含量和總抗氧化能力的影響

實驗動物及模型的建立和分組同實施例1，大鼠腦缺血2h，再灌注22h后，水合氯醛麻醉，生理鹽水心臟灌流后取腦組織，按質量與體積比加入9倍的pbs制成10％的腦勻漿液，按試劑盒說明檢測腦組織丙二醛(mda)含量和總抗氧化能力(試劑盒購自碧云天生物技術有限公司)。

mda檢測結果表明，模型組mda含量與假手術組相比有明顯差異(p＝0.025)。與模型組相比，陽性藥組可顯著降低mda水平(p＝0.029)，藏紅花素靜注給藥組無顯著差異(p＝0.070)，藏紅花素灌胃給藥組mda水平顯著降低(p＝0.007)(圖3a)?？偪寡趸芰z測結果表明，模型組總抗氧化能力與假手術組相比明顯降低(p＝0.001)。與模型組相比，陽性藥組可顯著提高總抗氧化水平(p＝0.018)，藏紅花素靜注給藥組無顯著差異(p＝0.163)，藏紅花素灌胃給藥組總抗氧化水平顯著提高(p＝0.016)(圖3b)。結果顯示藏紅花素灌胃給藥后可發(fā)揮與陽性藥依達拉奉相似的作用，降低腦組織脂質過氧化水平，并提高總抗氧化能力，而藏紅花素靜注給藥后并無此作用。

實施例3藏紅花素給藥后腦組織代謝組學分析

實驗動物及模型的建立和分組同實施例1，大鼠腦缺血2h，再灌注22h后，水合氯醛麻醉，生理鹽水心臟灌流后取腦組織，稱取腦組織20mg加入含有內標1，2-¹³c2-肉寇酸的80％甲醇溶液(2.5μg/ml)800μl勻漿，4℃冰箱靜置1h，20000×g、4℃離心10min。取上清液200μl于gc進樣瓶中，減壓揮干，再加入甲氧胺呲啶溶液(10mg/ml)30μl，渦旋振蕩3min，室溫靜置16h進行肟化。然后加入衍生化試劑mstfa(含1％tmcs)30μl，渦旋振蕩3min，室溫靜置1h進行硅烷化，最后再加入外標甲基肉寇酸酯庚烷溶液(15μg/ml)30μl，混勻后采用氣相色譜-質譜聯(lián)用(shimadzugc/msqp2010ultra/se，kyoto，日本)對腦組織內源性分子進行測定(方法參照jiyea，etal，analchem.2005，77，8086-8094)，采用simca-p13.0(umetrics，瑞典)對5組多變量數(shù)據進行偏最小二乘法-判別分析(pls-da)分析。對假手術組和模型組、模型組和藏紅花素灌胃給藥組分別進行正交-偏最小二乘法判別分析(opls-da)，采用t檢驗對鑒定出的化合物進行統(tǒng)計檢驗(p＜0.05，有顯著性差異)，確定組間有明顯差異的化合物。

對大鼠缺血2h再灌注22h后腦組織代謝組學數(shù)據進行pls-da分析顯示：模型組與假手術組有明顯差異，從空間位置看，陽性藥組位于模型組與假手術組之間，提示陽性藥依達拉奉對缺血再灌注造成的腦損傷有保護作用。此外，藏紅花素灌胃給藥組更靠近假手術組，而藏紅花素靜注給藥組更靠近模型組，提示藏紅花素灌胃給藥后對腦組織內源性小分子物質的調節(jié)作用優(yōu)于依達拉奉，而藏紅花素靜注給藥后的這種調節(jié)作用較弱(圖4)。

采用opls-da結合s-plot方法分析和鑒定缺血再灌注模型和藏紅花素灌胃給藥后對腦組織中分子的影響(圖5)。造模及灌胃給予藏紅花素對腦組織部分物質均產生顯著影響(表1)。模型組腦組織中tca中間產物(α-酮戊二酸和延胡索酸)水平降低，丙酮酸含量明顯下降，且乳酸水平升高，提示缺血再灌注后由于線粒體損傷導致有氧呼吸減弱，無氧呼吸加強生成了大量乳酸。此外，葡萄糖，葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸和核糖-5-磷酸水平都明顯上升，提示磷酸戊糖通路增強。支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)和酪氨酸、色氨酸、蘇氨酸等氨基酸水平明顯上升，且3-羥基異丁酸含量上升，提示由氨基酸能量動員和糖異生加強。脂肪酸(亞油酸、油酸、棕櫚酸)含量上升，同時3-羥基丁酸含量上升，提示腦組織在缺血之后攝取酮體供能加強。此外，n-乙酰天冬氨酸作為神經元損傷程度的指標，在模型組含量顯著下降，與模型組腦組織出現(xiàn)大面積梗死相一致。多元醇通路活性增強，山梨醇和果糖堆積，造成細胞水腫，并干擾肌醇代謝，導致肌醇攝取減少。

灌胃給予藏紅花素，對腦組織tca循環(huán)物質，氨基酸及脂肪酸代謝等產生明顯調節(jié)作用，且n-乙酰天冬氨酸水平與模型組相比明顯上升，與灌胃給藥后顯著改善腦組織梗死相一致。

表1差異化合物列表

說明：↑↑↑，表示含量上升，p＜0.001；↑↑，表示含量上升，p＜0.01；↑，表示含量上升，p＜0.05；↓↓↓，表示含量下降，p＜0.001；↓↓，表示含量下降，p＜0.01；↓，表示含量下降，p＜0.05；0.8表示肌醇含量變化倍數(shù)(模型組與假手術組相比)，但無顯著性差異。