交叉引用

本申請要求提交于2010年8月24日的美國臨時申請?zhí)?1/376,654的權(quán)益，該臨時申請通過引用整體并入本文。

發(fā)明背景

在美國，心血管疾病是死亡的主要原因。心血管疾病最常見的病因是當(dāng)冠狀動脈堵塞時發(fā)生的心肌梗死(MI)。大約37％的MI患者將在一年內(nèi)死于心力衰竭，且在幸存的患者中，2/3的患者不能完全康復(fù)。MI導(dǎo)致心肌細(xì)胞的死亡和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解，而后是疤痕沉積。最終發(fā)生心力衰竭，并且心臟擴(kuò)張，導(dǎo)致泵送效率降低。由于心臟中的心臟祖細(xì)胞非常少，因此心臟組織不能再生。目前對心力衰竭的治療嚴(yán)重依賴于侵入性外科手術(shù)，而對受損心臟組織的修復(fù)來說作用不大。

目前對于預(yù)防心肌梗死(MI)后心力衰竭的努力已集中于細(xì)胞移植以替換壞死的心肌細(xì)胞，防止不利的左心室(LV)重構(gòu)，并再生或修復(fù)心臟組織。然而，在沒有合適的基質(zhì)的情況下，心肌細(xì)胞在體外的生長以及在體內(nèi)的存活并不理想。心臟修復(fù)、心律不齊治療以及細(xì)胞培養(yǎng)都需要凝膠或溶液形式的心臟細(xì)胞外基質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，一種組合物包含孔隙大小約為30-40微米的材料，其中所述材料可通過內(nèi)徑為25G或更小的導(dǎo)管注射。

在一些情況下，該材料包含：來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)；和水。在一些情況下，該材料進(jìn)一步包含鹽水溶液。

在一些情況下，該組合物在遞送至體內(nèi)組織后的30分鐘內(nèi)呈凝膠形式。在一些情況下，該材料進(jìn)一步包含至少一種消化酶。在一些情況下，所述至少一種消化酶裂解基質(zhì)，使得組合物在高于20、25、30或35℃時膠凝。在一些情況下，所述至少一種消化酶裂解基質(zhì)，使得組合物在少于30、20、10、5或1分鐘內(nèi)膠凝。在一些情況下，所述至少一種消化酶是胃蛋白酶。

該材料可來源于心室組織，進(jìn)一步地，該材料可來源于左心室組織。在一些情況下，該材料進(jìn)一步包含生長因子、合成聚合物、自然衍生的聚合物或其組合。在一些情況下，該材料進(jìn)一步包含纖維素。在一些情況下，該材料包含纖維蛋白膠。

在一些情況下，該材料包含促進(jìn)內(nèi)源性心肌細(xì)胞和心臟細(xì)胞存活的因子、防止內(nèi)源性心肌細(xì)胞和心臟細(xì)胞凋亡的因子、促進(jìn)新血管形成的因子、促進(jìn)細(xì)胞浸潤的因子、改變免疫應(yīng)答的因子、改變炎癥應(yīng)答的因子或其組合。

另一方面，一種組合物包含：來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)；生物相容性金屬；和水。在一些情況下，該金屬是金屬纖維。在一些情況下，該金屬是金屬顆粒。

再一方面，公開了一種組合物，其包含：來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)；藻酸鹽；和水。

一方面，一種組合物包含：來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)，其中所述基質(zhì)包含分子量低于300kDa、低于200kDa、低于100kDa、低于50kDa或低于20kDa的材料。一方面，一種組合物包含：來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)，其中所述基質(zhì)包含分子量低于300kDa、低于200kDa、低于100kDa、低于50kDa或低于20kDa的非水性材料。一方面，一種組合物包含：來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)，其中所述基質(zhì)包含分子量處于上限為300kDa、200kDa、100kDa、50kDa或20kDa且下限為0.5kDa、1kDa、2kDa、5kDa、10kDa或20kDa的范圍內(nèi)的材料。

另一方面，一種組合物包含：凍干的來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)；和糖胺聚糖，其中所述組合物以至少5、10或15μg/mg凍干基質(zhì)的量包含糖胺聚糖。在一些情況下，該組合物以約15至25μg/mg凍干基質(zhì)的量包含糖胺聚糖。

再一方面，公開了一種組織培養(yǎng)裝置，其包含：含有來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)的組合物；和基底。該基底可以是組織培養(yǎng)板。該基質(zhì)可以呈模具(mold)的形狀。在一些情況下，將基質(zhì)模塑為基底的形狀。示例性的形狀可以是諸如支架或?qū)Ч艿纳镝t(yī)學(xué)產(chǎn)品的形狀。其他形狀可包括那些配置為在體內(nèi)適合于心臟的形狀?；卓梢允抢w維素。在一些情況下，纖維素呈用于植入受試者體內(nèi)的形狀。在一些情況下，該裝置進(jìn)一步包含組織培養(yǎng)基。在一些情況下，所述形狀是組織培養(yǎng)形狀，例如，但不限于，皿、小瓶、培養(yǎng)皿、板、孔和多孔板(multiwall plate)。

一方面，本文描述了制備組合物的方法，該方法包括：對心臟組織進(jìn)行脫細(xì)胞化；將脫細(xì)胞化的心臟組織凍干；消化所述凍干的組織；凍干所述消化的組織；將消化的組織在低于25℃、低于0℃、低于-20℃或低于-70℃的溫度下儲存長達(dá)6個月；以及通過將凍干的消化的組織與液體合并來制備組合物。

另一方面，一種修復(fù)心臟組織的方法包括將包含來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)的組合物注射到或植入受試者體內(nèi)。在一些情況下，在心肌梗死后1個月之內(nèi)注射或植入所述組合物。在一些情況下，在心肌梗死后兩周之內(nèi)注射或植入所述組合物。在一些情況下，所述組合物在注射或植入后的3個月內(nèi)降解。在一些情況下，所述組合物在注射或植入后的1個月內(nèi)降解。在一些情況下，所述組合物的注射或植入修復(fù)先天性缺陷。在一些情況下，所述組合物的注射或植入修復(fù)所述受試者遭受的心臟組織損傷。該損傷可以是心肌梗死。

具體而言，本發(fā)明涉及：

1.一種組合物，其包含孔隙大小約為30至40微米的材料，其中所述材料可通過內(nèi)徑為25G或更小的導(dǎo)管注射。

2.段1的組合物，其中所述材料包含：來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)；和水。

3.段2的組合物，其中所述材料進(jìn)一步包含鹽水溶液。

4.段2的組合物，其中所述材料進(jìn)一步包含至少一種消化酶。

5.段4的組合物，其中所述至少一種消化酶裂解所述基質(zhì)，使得所述組合物在高于20、25、30或35℃時膠凝。

6.段4的組合物，其中所述至少一種消化酶裂解所述基質(zhì)，使得所述組合物在小于30、20、10、5或1分鐘內(nèi)膠凝。

7.段4的組合物，其中所述至少一種消化酶是胃蛋白酶。

8.段2的組合物，其中所述材料來源于心室組織。

9.段2的組合物，其中所述材料來源于左心室組織。

10.段2的組合物，其中所述材料進(jìn)一步包含生長因子。

11.段2的組合物，其中所述材料進(jìn)一步包含合成聚合物。

12.段2的組合物，其中所述材料進(jìn)一步包含自然衍生的聚合物。

13.段2的組合物，其中所述材料進(jìn)一步包含纖維素。

14.段2的組合物，其中所述材料包含纖維蛋白膠。

15.段1的組合物，其中所述組合物在遞送到體內(nèi)組織后的30分鐘內(nèi)呈凝膠形式。

16.段1的組合物，其中所述材料包含促進(jìn)內(nèi)源性心肌細(xì)胞和心臟細(xì)胞存活的因子。

17.段1的組合物，其中所述材料包含防止內(nèi)源性心肌細(xì)胞和心臟細(xì)胞凋亡的因子。

18.段1的組合物，其中所述材料包含促進(jìn)新血管形成的因子。

19.段1的組合物，其中所述材料包含促進(jìn)細(xì)胞浸潤的因子。

20.段1的組合物，其中所述材料包含改變免疫應(yīng)答的因子。

21.段1的組合物，其中所述材料包含改變炎癥應(yīng)答的因子。

22.一種組合物，其包含：(a)來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)；(b)生物相容性金屬；和(c)水。

23.段22的組合物，其中所述金屬是金屬纖維。

24.段22的組合物，其中所述金屬是金屬顆粒。

25.一種組合物，其包含：(a)來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)；(b)藻酸鹽；和(c)水。

26.一種組合物，其包含：來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)，其中所述基質(zhì)包含分子量小于300kDa、小于200kDa、小于100kDa、小于50kDa或小于20kDa的材料。

27.一種組合物，其包含：凍干的來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)；和糖胺聚糖，其中所述組合物以至少5、10或15μg/mg凍干基質(zhì)的量包含糖胺聚糖。

28.段27的組合物，其中所述組合物以約15至25μg/mg凍干基質(zhì)的量包含糖胺聚糖。

29.一種組織培養(yǎng)裝置，其包括：包含來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)的組合物；和基底。

30.段29的裝置，其中所述基底是組織培養(yǎng)板。

31.段29的裝置，其中所述基質(zhì)呈模具的形狀。

32.段29的裝置，其中將所述基質(zhì)模塑成所述基底的形狀。

33.段29的裝置，其中所述基底是纖維素。

34.段33的裝置，其中所述纖維素呈用于植入受試者體內(nèi)的形狀。

35.段29的裝置，進(jìn)一步包括組織培養(yǎng)基。

36.一種制備組合物的方法，該方法包括：

a.對心臟組織進(jìn)行脫細(xì)胞化；

b.凍干所述脫細(xì)胞化的心臟組織；

c.消化所述凍干的組織；

d.凍干所述消化的組織；

e.將所述消化的組織在低于25℃、低于0℃、低于-20℃或低于-70℃的溫度下儲存長達(dá)6個月；和

f.通過將凍干的消化組織與液體合并來制備組合物。

37.一種修復(fù)心臟組織的方法，包括將包含來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)的組合物注射到或植入受試者體內(nèi)。

38.段37的方法，其中在心肌梗死后一個月之內(nèi)注射或植入所述組合物。

39.段37的方法，其中在心肌梗死后兩周之內(nèi)注射或植入所述組合物。

40.段37的方法，其中所述組合物在注射或植入后的3個月內(nèi)降解。

41.段37的方法，其中所述組合物在注射或植入后的1個月內(nèi)降解。

42.段37的方法，其中所述組合物的注射或植入修復(fù)先天性缺陷。

43.段37的方法，其中所述組合物的注射或植入修復(fù)所述受試者所遭受的心臟組織損傷。

44.段43的方法，其中所述損傷是心肌梗死。

45.段1的組合物，其中在注射到或植入受試者后，所述組合物在3個月內(nèi)降解。

46.段1的組合物，其中在注射到或植入受試者后，所述組合物在1個月內(nèi)降解。

援引并入

本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請均通過引用而以相同的程度整體并入本文，猶如特別地和單獨(dú)地指出每個單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾埦ㄟ^引用而并入。

附圖說明

本發(fā)明的許多特征在隨附的權(quán)利要求中具體闡述。通過參考以下對在其中利用到本發(fā)明的許多原理的說明性實(shí)施方式加以闡述的詳細(xì)描述和附圖，將會獲得對本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)的更好的理解，在附圖中：

圖1圖示了遞送本發(fā)明的組合物的示例性方法。

圖2圖示了本文所述的方法和組合物的各種實(shí)施方式。

圖3展示了通過將本發(fā)明的組合物注射到大鼠心臟內(nèi)而獲得的數(shù)據(jù)。

圖4圖示了如本文所述的組合物的制備方法的一些示例性步驟。

具體實(shí)施方式

最近所研究的方法利用將健康細(xì)胞注射到左心室(LV)梗死壁，以試圖再生和修復(fù)心肌，但是研究表明注入的細(xì)胞的存活較差。細(xì)胞(包括成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和分化細(xì)胞如心肌細(xì)胞)一般在涂覆有一種或幾種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白質(zhì)的表面或支架上培養(yǎng)。然而，在體內(nèi)，這些細(xì)胞存在于高度復(fù)雜的細(xì)胞外環(huán)境中；更加近似地模擬這種天然環(huán)境的ECM可能有利于所培養(yǎng)的細(xì)胞的存活以及在體外和體內(nèi)的功能/成熟。

目前正在研究將一些自然衍生的材料，包括纖維蛋白、膠原蛋白、藻酸鹽、基質(zhì)膠(matrigel)和明膠，注射到心肌內(nèi)。這些材料中無一提供顯著量的心臟細(xì)胞外基質(zhì)的天然成分。對于心律不齊的治療而言，目前的非消融形式包括藻酸鹽、纖維蛋白和細(xì)胞的注射。用于心肌細(xì)胞、干細(xì)胞以及其他心臟相關(guān)細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)的現(xiàn)有基質(zhì)包括膠原蛋白、層粘連蛋白、SureCoat(Cellutron，膠原蛋白和層粘連蛋白的混合物)、基質(zhì)膠和明膠。

需要開發(fā)針對晚期心力衰竭的新療法。目前，常見的療法是心臟移植、左心室(LV)輔助裝置和/或現(xiàn)有的藥物治療方案。這些治療不能充分地防止心肌梗死(MI)后的不利的LV重構(gòu)。針對心肌梗死和心力衰竭的治療，已經(jīng)開發(fā)了細(xì)胞心肌成形術(shù)或細(xì)胞移植；然而，最近無細(xì)胞生物材料已在提供相似的功能益處而不產(chǎn)生與細(xì)胞遞送相關(guān)的并發(fā)癥方面展示出極大的前景。用于心臟治療的生物材料產(chǎn)品是有限的，因?yàn)闃O少數(shù)是特別針對心肌而制備的。目前正在研究的用于注入心肌內(nèi)的材料包括但不限于纖維蛋白、膠原蛋白、藻酸鹽、基質(zhì)膠和明膠。

在一些情況下，如本文所述的組合物包含心臟ECM的基本上所有成分。在一些情況下，該組合物以類似于體內(nèi)所見的比例包含心臟ECM的基本上所有成分。ECM蛋白質(zhì)、糖蛋白和蛋白聚糖可包括但不限于：I、III、IV、V和VI型膠原蛋白、彈性蛋白、纖維蛋白原、腔蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、纖蛋白和/或?qū)诱尺B蛋白。在一些情況下，如本文所述的組合物以類似于體內(nèi)所見的比例包含心臟ECM的所有成分的90％、80％、70％、60％、50％或更多。在一些情況下，使用了ECM模擬物。例如，可通過組合天然存在的或人工產(chǎn)生的ECM的獨(dú)立成分，以使得獨(dú)立成分的比例模擬在天然存在的ECM中發(fā)現(xiàn)的比例，而生產(chǎn)人工ECM。

ECM包括間質(zhì)基質(zhì)和基膜材料。在一些情況下，包含ECM的組合物由纖維狀蛋白質(zhì)和糖胺聚糖(GAG)的互鎖網(wǎng)組成。GAG是糖類聚合物，且通常附著于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)上以形成蛋白聚糖?？砂诒景l(fā)明的組合物中的示例性ECM纖維包括但不限于，串珠蛋白聚糖、聚集蛋白和所有類型的膠原蛋白，所述膠原蛋白類型包括：纖維狀(I、II、III、V、XI型)；斷續(xù)三股螺旋(facit)(IX、XII、XIV型)；短鏈(VIII、X型)；基膜(IV型)；以及其他(VI、VII、XIII型)。

本文描述了用于注射到心臟組織內(nèi)的包含心臟ECM的組合物。在本文所述的一些情況下，提供了來源于天然心臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的組合物的可注射凝膠形式。還可單獨(dú)使用該凝膠以將細(xì)胞募集至受損組織中或作為藥物遞送載體。凝膠也可用于支持受損組織或改變機(jī)械性能。本發(fā)明的另一用途是作為非破壞性傳導(dǎo)阻滯以治療心律不齊。在一些情況下，如本文所述的心臟或心ECM材料來源于心肌組織。在一些情況下，組合物來源于心室組織。在一些情況下，組合物來源于左心室組織。在一些情況下，組合物可來源于左心室和右心室組織。在一些情況下，組合物可來源于可無創(chuàng)獲得的自體心包組織。在其他情況下，如本文所述的心臟或心ECM材料來源于心包組織。

組合物可用于將細(xì)胞遞送至心肌梗死后的梗死壁。

在一些情況下，本發(fā)明的組合物模擬細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，例如，可能已被梗死損傷的ECM。該組合物可提供促進(jìn)修復(fù)的、復(fù)雜的、心肌特異性的ECM信號(cue)。本文的組合物被配置用于經(jīng)由導(dǎo)管技術(shù)遞送。

天然心臟ECM可比傳統(tǒng)的細(xì)胞涂層具有更多的成分，并因此當(dāng)與膠原蛋白和層粘連蛋白相比時可展示更復(fù)雜的ECM成分的混合物。在一些情況下，在此制備為基質(zhì)的組合物可模擬天然心臟ECM。在此制備的組合物可提高心肌細(xì)胞的存活率或生長速率。在此制備的組合物可用于接種細(xì)胞培養(yǎng)物，如心肌細(xì)胞培養(yǎng)物。在一些情況下，接種至本發(fā)明組合物上的培養(yǎng)物開始搏動。在一些情況下，接種至本發(fā)明組合物上的細(xì)胞比培養(yǎng)在單獨(dú)的膠原蛋白上的細(xì)胞持續(xù)搏動得更久。例如，接種至本發(fā)明組合物上的細(xì)胞可持續(xù)搏動長于10、14、20、25、30、35、40、45、60、70、80、90或100天。

在一些情況下，生長在本發(fā)明組合物上的細(xì)胞具有增加的輔肌動蛋白、連接蛋白43或泛-鈣黏著蛋白的量。生長在本發(fā)明組合物上的細(xì)胞與生長在膠原蛋白上的細(xì)胞相比可具有增強(qiáng)的生存能力。此外，與生長在膠原蛋白上的細(xì)胞對膠原蛋白的附著相比，生長在本發(fā)明組合物上的細(xì)胞可具有增強(qiáng)的對組合物的附著。

在一些情況下，本文提供的組合物在脫細(xì)胞化后包含多種ECM蛋白質(zhì)。ECM蛋白質(zhì)、糖蛋白和蛋白聚糖可包括但不限于：I、III、IV、V和VI型膠原蛋白、彈性蛋白、纖維蛋白原、腔蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、纖蛋白或?qū)诱尺B蛋白。因此，脫細(xì)胞化的心肌ECM可包含蛋白質(zhì)和蛋白聚糖的復(fù)雜組合。

在一些情況下，本發(fā)明的組合物以可注射的形式提供?？上摷?xì)胞化的基質(zhì)粉末以溶解或以其他方式將產(chǎn)物合并至液體中。在一些情況下，合并的產(chǎn)物包含糖胺聚糖(GAG)。例如，組合物可具有至少1、2、3、4、5、8、10、15、20、25、30、40、50μg/mg凍干基質(zhì)或更高的糖胺聚糖(GAG)含量。

在一些情況下，本發(fā)明的組合物包含心肌特異性的ECM成分。在一種情況下，組合物是來源于天然心肌ECM的可注射水凝膠。在一些情況下，組合物基本上不包含任何細(xì)胞抗原。在一些情況下，組合物在受試者體內(nèi)不產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在一些情況下，在免疫抑制治療之前、與之同時或之后將組合物遞送至受試者體內(nèi)。在一些情況下，不使用免疫抑制治療。

在一些情況下，本文所述的組合物配置為以即用的(off-the-shelf)方式提供以用于治療。在一個實(shí)例中，本發(fā)明的組合物呈干燥固體形式并可被儲存在架子上或者室內(nèi)或單元內(nèi)，然后在治療前用水、鹽水或另一種液體溶液立即溶解。

本文描述了包含心肌特異性材料的組合物，該組合物可經(jīng)由導(dǎo)管遞送以在MI后環(huán)境中促進(jìn)修復(fù)。該組合物包含心室ECM蛋白質(zhì)、肽和多糖的復(fù)雜混合物。在許多情況下，組合物在室溫下是液體并且在注入心肌后形成多孔纖維狀支架。當(dāng)組合物在體內(nèi)遞送至心肌梗死部位時，其促進(jìn)細(xì)胞流入并保持LV的幾何形狀和心臟功能。

在一些情況下，如本文所述的組合物可幫助再生或修復(fù)有缺陷的或缺如的心肌并恢復(fù)心臟功能。在此，可注射的細(xì)胞外基質(zhì)組合物可來源于哺乳動物或合成來源。組合物可進(jìn)一步包含細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞外基質(zhì)組合物可進(jìn)一步包含附加成分，例如但不限于：細(xì)胞、肽、多肽或蛋白質(zhì)、諸如多核苷酸或寡核苷酸的核酸、DNA、RNA、表達(dá)生物活性分子的DNA的載體、聚合物或其他材料、交聯(lián)劑以及其他添加劑如營養(yǎng)物或藥物分子。一種或幾種附加成分可包含于該組合物中。在一些情況下，附加成分是藥物。在一些情況下，藥物作為細(xì)胞外基質(zhì)組合物的一部分或作為ECM的注射溶液的成分來遞送；在一些情況下，在遞送本文所述的組合物的同時、之前或之后遞送藥物。藥物的實(shí)例包括但不限于：血壓或高血壓藥物(例如，ACE抑制劑、α激動劑、α阻滯劑、血管緊張素II受體阻滯劑、利尿劑或腎素阻滯劑)；抗心律不齊藥(例如，鈉通道阻滯劑、β阻滯劑、鉀通道阻滯劑、鈣通道阻滯劑)；降膽固醇藥(例如，他汀類藥物、考來烯胺(chloestyramine))；血液稀釋劑或抗凝劑(例如，阿司匹林、抑肽酶、氯吡格雷、依諾肝素、肝素、華法林、達(dá)比加群酯(dabiagatran etexilate))；控制心率的藥物(例如，洋地黃制劑)；和/或血管舒張劑(例如，硝酸甘油)。

一方面，如本文所述的組合物包含：來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)；和水。在一些情況下，組合物進(jìn)一步包含鹽水溶液。本發(fā)明的組合物可包含來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的ECM和脫細(xì)胞化的ECM可混溶于其中的液體溶液。

本文所述的組合物可包含體內(nèi)的許多因子或信號，包括但不限于：促進(jìn)新血管形成的因子，如VEGF和bFGF；促進(jìn)細(xì)胞浸潤的因子，如SDF；改變免疫應(yīng)答的因子；改變炎癥應(yīng)答的因子，如IL-10；促進(jìn)內(nèi)源性心肌細(xì)胞和心臟細(xì)胞存活的因子；和防止內(nèi)源性心肌細(xì)胞和心臟細(xì)胞凋亡的因子。

在一些情況下，描述了遞送方法，其中可將組合物放置在與有缺陷的或缺如的心肌接觸處，從而導(dǎo)致心肌組織再生以及心肌的收縮性、傳導(dǎo)性或功能的恢復(fù)。在一些情況下，本發(fā)明的組合物可募集內(nèi)源性細(xì)胞并可協(xié)調(diào)新募集的或添加的細(xì)胞的功能，還允許組合物中的細(xì)胞遷移和增殖。如本文所述，在一些情況下，組合物可幫助修復(fù)心肌組織。在一些情況下，這種修復(fù)涉及心臟組織和/或心臟組織的特有特征如條紋、T管或閏盤的恢復(fù)。

已經(jīng)制備了包含天然細(xì)胞外基質(zhì)支架的組合物，以供在哺乳動物組織移植手術(shù)中使用。ECM基質(zhì)的實(shí)例包括但不限于：小腸粘膜下層(SIS)，如在美國專利號5,275,826中描述的支架；膀胱粘膜下層(UBS)，如在美國專利號5,554,389中描述的支架；胃粘膜下層(SS)，如在美國專利號6,099,567中描述的支架；以及肝粘膜下層(LS)或肝基膜(LBM)，如在美國專利號6,379,710中描述的支架。此外，來自哺乳動物來源的膠原蛋白可從含有組織的基質(zhì)獲取并用于形成基質(zhì)組合物。細(xì)胞外基質(zhì)還可由細(xì)胞培養(yǎng)物來合成。已經(jīng)發(fā)表了為了再生整個心臟目的的心臟脫細(xì)胞化(Ott等人,Nature Medicine,2008)。也已經(jīng)描述了豬膀胱基質(zhì)的可注射凝膠形式(Freytes等人,Biomaterials,2008)。

本文公開了包含直接來源于天然心臟組織的脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)的生物相容性材料，并且通過將包含脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)的生物相容性材料注射到或植入受試者體內(nèi)而用于治療受試者(優(yōu)選地人類)體內(nèi)有缺陷的、患病的、損傷的或缺血的組織或器官。在一些情況下，將材料遞送至非人類動物受試者。

圖1圖示了遞送本文的組合物的示例性方法。圖1提供了從心肌梗死到引入本文所述的組合物的事件流程，導(dǎo)致了如下的結(jié)果：再生增加，梗死面積減小，LV重構(gòu)減少以及心臟功能改善。

圖2是圖示本文提供的方法和組合物的幾個實(shí)施方式的流程圖。在一些情況下，從動物獲取組織，201。該組織可以是心臟組織，例如心肌組織，但也可以是其他類型的組織。本文描述了組織的各處理步驟，202。例如，可對組織進(jìn)行脫細(xì)胞化、凍干、消化和溶解在期望的液體中，或備選地通過本文所述的步驟的任意組合進(jìn)行處理。結(jié)果形成了基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物；在一些實(shí)施方式中，基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物是可注射的。在各種實(shí)施方式中，基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物模擬受試者體內(nèi)受損組織的ECM，例如心肌梗死患者的心肌ECM。

在一些實(shí)施方式中，可將基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物模塑為特定形狀，然后將其移植到或引入受試者體內(nèi)?？蓪⒒贓CM的基質(zhì)產(chǎn)物模塑為期望形狀(例如，可能適合于移植到或引入受試者體內(nèi)的期望區(qū)域(例如，心肌)的導(dǎo)管、支架、移植物、補(bǔ)片等的形狀)的支持性基質(zhì)。可將細(xì)胞(例如，種子細(xì)胞)任選地接種到模塑的基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物上或在其上培養(yǎng)，204?？赏ㄟ^本文所述的方法制備補(bǔ)片、移植物或凝膠產(chǎn)物或相似的移植構(gòu)件，205?？蓪⒃撘浦矘?gòu)件移植或引入受試者體內(nèi)的受損區(qū)域，206。在一些實(shí)施方式中，移植(或引入)促進(jìn)該區(qū)域中的細(xì)胞生長或存活或者以其他方式使細(xì)胞聚集于受損區(qū)域；細(xì)胞或組織生長常常直接發(fā)生在基于ECM的基質(zhì)上。

一些實(shí)施方式涉及模擬ECM(例如心肌ECM)的基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物(202)以及修復(fù)受損組織或利用其防止組織中的損傷的方法。在許多情況下，將基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物注射到、植入或以其他方式引入受損組織，例如損傷的心肌、心肌梗死，207。在一些情況下，在注射之前或之后允許形成凝膠。在一些實(shí)施方式中，在將溶液輸入受試者之后發(fā)生凝膠形成，208。凝膠形成可取決于溫度變化，例如，向體溫的轉(zhuǎn)變或向約37℃的溫度的轉(zhuǎn)變。之后細(xì)胞諸如內(nèi)源性細(xì)胞可聚集于基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物，211。任選地，將細(xì)胞以注射或其他方式引入基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物的注射部位或移植部位之上或其附近，209。在各種實(shí)施方式中，基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物模擬受損組織的ECM，并因此促進(jìn)細(xì)胞生長、分化或向受損區(qū)域的歸巢，210。結(jié)果，在一些情況下，細(xì)胞聚集于受損區(qū)域，211(細(xì)胞生長通常直接發(fā)生在基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物上)。在各種實(shí)施方式中，在經(jīng)過細(xì)胞足以聚集于受損區(qū)域的時間后，基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物降解，212。

本公開內(nèi)容還提供了使組織培養(yǎng)物在組織培養(yǎng)孔上生長的組合物和方法，213。使用本文所述的方法和組合物產(chǎn)生的基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物可用于涂覆組織培養(yǎng)孔。許多類型的細(xì)胞可在所述已涂覆的培養(yǎng)孔上培養(yǎng)。例如，心肌細(xì)胞可在用基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物涂覆的孔上培養(yǎng)，215。在一些實(shí)施方式中，將多潛能干細(xì)胞(pluripotent stem cells)、多能干細(xì)胞(multipotent stem cells)或心肌細(xì)胞前體細(xì)胞在涂覆的孔上培養(yǎng)，214。然后基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物可促進(jìn)或允許培養(yǎng)的細(xì)胞分化為特定組織的細(xì)胞，例如可使用來源于心肌組織的基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物來產(chǎn)生涂層，并且涂層可以促進(jìn)細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，216。

在其他實(shí)施方式中，可使用由人工創(chuàng)建的ECM產(chǎn)生的基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物。在此類情況下，此類基于ECM的基質(zhì)產(chǎn)物可用于涂覆組織培養(yǎng)孔，213，從而得以注入受損的心肌(或其他類型的受損組織)，207，或模塑為期望形狀的支持性基質(zhì)，203。

心肌梗死后，目前的標(biāo)準(zhǔn)療法如藥物和醫(yī)療裝置(或缺乏療法)通常是無效的，并最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡、不利的LV重構(gòu)、LV擴(kuò)張和心力衰竭。本文描述了遞送可注射的組合物的方法。在一些情況下，將本發(fā)明的組合物遞送至LV可導(dǎo)致再生增加、梗死面積減小、LV重構(gòu)減少或心臟功能改善。心臟基質(zhì)的溶液形式、凝膠形式和吸附形式提供了類似于體內(nèi)所見比例的天然ECM的許多成分。

在一些情況下，脫細(xì)胞化的心臟細(xì)胞外基質(zhì)來源于選自人類心臟、豬心臟、牛心臟或任何其他哺乳動物或動物心臟(包括但不限于，山羊心臟、小鼠心臟、大鼠心臟、兔心臟和雞心臟)的天然心臟組織。在一些情況下，脫細(xì)胞化的心臟細(xì)胞外基質(zhì)來源于天然組織，該天然組織來自于源自于如本文所述組織的胚胎或胎兒來源，而沒有額外的限制。

在又一實(shí)施方式中，包含脫細(xì)胞化的心臟細(xì)胞外基質(zhì)的生物相容性材料呈可注射凝膠或溶液的形式，且可通過將細(xì)胞移植或遞送至心肌梗死后的梗死壁或?qū)⒓?xì)胞募集至受損的心臟組織內(nèi)而用于心臟修復(fù)。在其他情況下，包含脫細(xì)胞化的心臟ECM的生物相容性材料例如是補(bǔ)片、乳劑、粘性液體、凝膠、片段、顆粒、微珠或納米珠。

在本文公開的另一方面，組合物包含孔隙大小約為30-40微米的材料，其中所述材料是與心臟組織生物相容的，且其中所述材料可通過內(nèi)徑為25G或更小的導(dǎo)管注射。在一些情況下，所述材料包含來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)。在一些情況下，該組合物包含孔隙大小小于50微米的材料。

在一些情況下，本發(fā)明的組合物促進(jìn)所植入的細(xì)胞的成熟。例如，植入受損心肌中的未成熟細(xì)胞可與本文所述的基質(zhì)組合物的遞送一起植入或在其后不久植入，其中所述基質(zhì)組合物促進(jìn)所植入的細(xì)胞的成熟。在一些情況下，組合物促進(jìn)所植入的細(xì)胞的分化。例如，誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞可與基質(zhì)組合物的遞送一起植入或在基質(zhì)組合物的遞送后不久植入；且基質(zhì)組合物起到促進(jìn)iPS細(xì)胞分化的作用。在一些情況下，體內(nèi)因子還可作用于iPS細(xì)胞以獨(dú)立地或與基質(zhì)組合物一起促進(jìn)分化。在另一實(shí)例中，胚胎干(ES)細(xì)胞或成體干細(xì)胞與基質(zhì)組合物的遞送一起植入或在其后植入；且ES細(xì)胞或成體干細(xì)胞隨后分化成更成熟的細(xì)胞類型。在一些情況下，體內(nèi)因子也可作用于ES細(xì)胞或成體干細(xì)胞以獨(dú)立地或與基質(zhì)組合物一起促進(jìn)分化。

在又一實(shí)例中，組合物可促進(jìn)所植入的細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。例如，可將非心臟細(xì)胞與組合物一起遞送至受試者體內(nèi)，該組合物可促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為心臟表型。在一些實(shí)例中，本發(fā)明的組合物促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞的成熟和/或促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞的分化。在另一實(shí)例中，本發(fā)明的組合物促進(jìn)體外培養(yǎng)的細(xì)胞的成熟和/或促進(jìn)體外培養(yǎng)的細(xì)胞的分化。

在一些情況下，本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包含與如本文所述的基質(zhì)材料中的多糖相結(jié)合的生長因子。

在一些情況下，公開了用于移植前在研究實(shí)驗(yàn)室中或在臨床環(huán)境中培養(yǎng)心肌細(xì)胞或其他心臟相關(guān)細(xì)胞以及用于心臟修復(fù)的生物相容性材料(例如，不引起受試者體內(nèi)免疫應(yīng)答的材料)。還提供了制備和利用脫細(xì)胞化的心臟細(xì)胞外基質(zhì)涂覆組織培養(yǎng)板或孔的表面的方法。該生物相容性材料還適合于植入患者體內(nèi)。

本文進(jìn)一步提供了生產(chǎn)包含本發(fā)明的脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)的生物相容性材料的方法。此方法包括以下步驟：(a)從受試者獲得含有細(xì)胞外基質(zhì)和非細(xì)胞外基質(zhì)成分的心臟組織樣品；以及(b)處理心臟組織樣品以去除非細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而獲得脫細(xì)胞化的心臟細(xì)胞外基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，從諸如非靈長類動物(例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類動物(例如，猴和人)的哺乳動物或從禽源(例如，雞、鴨等)分離心臟組織樣品。使用一種或多種物理、化學(xué)和/或生物技術(shù)來完成心臟組織樣品的脫細(xì)胞化程序。

對于人類治療，心臟細(xì)胞外基質(zhì)材料具有許多潛在來源：人類心臟(包括自體的、同種異體的或尸體的)、豬心臟、牛心臟、山羊心臟、小鼠心臟、大鼠心臟、兔心臟、雞心臟以及其他動物來源。在一些情況下，ECM源自于多只動物(例如，多頭豬)或多個動物物種(例如，豬和不同的物種，如兔)。與全心臟移植不同，一個供體心臟可用于治療許多人。非人類動物將是心臟細(xì)胞外基質(zhì)的來源，而無需人類供體。作為研究試劑，可使用非人類動物來源(豬心臟、牛心臟、山羊心臟、小鼠心臟、大鼠心臟、兔心臟、雞心臟等)。首先對心臟進(jìn)行脫細(xì)胞化，僅留下細(xì)胞外基質(zhì)和/或細(xì)胞外蛋白質(zhì)和/或多糖。

在一個實(shí)施方式中，將心臟細(xì)胞外基質(zhì)凍干、碾碎并用低pH的胃蛋白酶或其他基質(zhì)降解酶如基質(zhì)金屬蛋白酶進(jìn)行消化。在一些情況下，組合物進(jìn)一步包含胃蛋白酶。在一些情況下，組合物進(jìn)一步包含消化酶，例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合。在一些情況下，組合物進(jìn)一步包含如本文所述的多種消化酶?？苫诒灰环N或多種消化酶切割的肽鍵為此處的組合物選擇一種或多種消化酶。

在一些情況下，組合物被配置為在體溫(例如，37℃或更高)下膠凝。在一些情況下，組合物被配置為在高于20、25、30或35℃下膠凝。在一些情況下，制備如本文所述的組合物的方法包括基于組合物膠凝的期望溫度來選擇酶。在一些情況下，制備如本文所述的組合物的方法包括基于組合物在體內(nèi)遞送時期望的膠凝時間來選擇酶。在一些情況下，組合物在遞送至體內(nèi)組織后的30分鐘、20分鐘、10分鐘、5分鐘、1分鐘或更短的時間內(nèi)呈凝膠形式。在一些情況下，利用本文所述的方法對一個心臟進(jìn)行脫細(xì)胞化。在一些情況下，利用本文所述的方法對兩個或更多個心臟進(jìn)行脫細(xì)胞化。在一些情況下，從多只動物(例如，多頭豬)或多個動物物種(例如，豬和不同的物種，如兔)獲得心臟組織。在一個方面，本文提供了制備組合物的方法，該方法包括：對心臟組織進(jìn)行脫細(xì)胞化；凍干脫細(xì)胞化的心臟組織；在第一液體中用酶消化所述凍干的組織；凍干所述消化的組織；以及通過將凍干的消化組織與第二液體合并來制備組合物。在一些情況下，并入液體的過程中包括溶解。在一些情況下，該方法包括多個但不是全部所述步驟。例如，該方法可包括對心臟組織進(jìn)行脫細(xì)胞化，在第一液體中用酶消化組織，以及將消化的組織與第二液體合并。在一些情況下，該方法不包括對心臟組織進(jìn)行脫細(xì)胞化。在一些情況下，該方法不包括將消化的組織與第二液體合并。

在一些情況下，通過使用十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液進(jìn)行脫細(xì)胞化。在一些情況下，酶是消化酶，例如，胃蛋白酶。在一些情況下，第一液體是磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、鹽水或其他緩沖溶液。在一些情況下，第二液體是水，例如，無菌水和/或去離子水，或者第二液體可以是鹽水。

另一方面，組合物包含：凍干的來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)。凍干的基質(zhì)可在水中混溶，從而形成溶液。在一些情況下，溶液在低于25、20、15、10、5或0℃的溫度下是液體溶液。在一些情況下，溶液在高于20、30、35或37℃的溫度下是凝膠。在一些情況下，當(dāng)水與組合物混合并且組合物在體內(nèi)遞送時溶液是液體。

在一種情況下，當(dāng)從病理上評估時，本發(fā)明的組合物顯示細(xì)胞核、DNA、RNA缺失。在另一種情況下，本發(fā)明的組合物包含分子量條帶低于約20kDa的心臟細(xì)胞外材料的部分。在一些情況下，本發(fā)明的組合物具有至少為5、10或15μg/mg凍干組合物的糖胺聚糖含量。在另一種情況下，本發(fā)明的組合物具有約15至25μg/mg凍干組合物的糖胺聚糖含量。

在一些情況下，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將組合物凍干，并在低于25℃、低于0℃、低于-20℃或低于-70℃的溫度下儲存該組合物長達(dá)6個月。

可將本文所述的組合物直接注射至受試者體內(nèi)，其因此用作材料治療。例如，可中和含有心臟細(xì)胞外基質(zhì)的溶液并使用PBS/鹽水或其他緩沖液使其達(dá)到合適的濃度。之后可通過小直徑針將含有心臟細(xì)胞外基質(zhì)的溶液注射至心肌內(nèi)。在體溫下，這種溶液隨后可形成凝膠。細(xì)胞或藥物/蛋白質(zhì)還可在凝膠內(nèi)或與凝膠一起遞送。例如，未分化的細(xì)胞可在凝膠內(nèi)或與凝膠一起遞送，并且此類細(xì)胞隨后可在體內(nèi)分化。在其他實(shí)例中，部分分化的或終末分化的細(xì)胞在凝膠內(nèi)或與凝膠一起遞送。

本文提供的組合物，尤其是凝膠試劑，可用于組織培養(yǎng)應(yīng)用?？芍泻秃行呐K細(xì)胞外基質(zhì)的溶液并使用PBS/鹽水使其達(dá)到合適的濃度。之后可將此溶液放置于組織培養(yǎng)板/孔中。一旦放置在37℃或高于室溫的培養(yǎng)箱中，溶液就會形成可用于細(xì)胞培養(yǎng)的凝膠。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種組合物，該組合物包含：來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)，其中所述組合物呈模具的形狀。在一個實(shí)例中，該組合物是體外試劑。

在一個方面，組織培養(yǎng)裝置包含：含有來源于心臟組織的脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)的組合物。在一些情況下，裝置是組織培養(yǎng)板。在一些情況下，裝置的基質(zhì)呈模具的形狀。在一些情況下，裝置進(jìn)一步包含組織培養(yǎng)基。

在一些情況下，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括使組合物膠凝成為預(yù)定的形狀或模具。例如，組合物可在組織培養(yǎng)皿或板內(nèi)膠凝，或者組合物可膠凝以適配模具的特定形狀。示例性的形狀可以是諸如支架或?qū)Ч艿纳镝t(yī)學(xué)產(chǎn)品的形狀。其他形狀可包括那些配置為在體內(nèi)適合于心臟的形狀?；卓梢允抢w維素。在一些情況下，纖維素為用于植入受試者體內(nèi)的形狀。在一些情況下，裝置進(jìn)一步包含組織培養(yǎng)基。在一些情況下，形狀是組織培養(yǎng)形狀，例如但不限于皿、小瓶、培養(yǎng)皿、板、孔以及多孔板。

在另一種情況下，使組合物膠凝至一個形狀或產(chǎn)品上以產(chǎn)生用該組合物涂覆的裝置。在另一種情況下，使組合物膠凝至一個形狀或模具內(nèi)而后凍干。在另一種情況下，可將該凍干的形狀植入體內(nèi)或用作體外支架，或可以在使用之前將其再水合。

在一種情況下，用于受試者心臟修復(fù)的治療方法包括部分地或完整地注射或植入本發(fā)明的生物相容性材料。本發(fā)明還提供了用于治療受試者的心律不齊或其他有缺陷的、患病的、損傷的或缺血的組織或器官的治療方法，該方法包括注射或植入本發(fā)明的生物相容性材料。

本發(fā)明的組合物可包含來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的ECM和另一種成分或多種成分。在一些情況下，整個組合物中的ECM的量高于組合物的90％或95％(重量)。在一些實(shí)施方式中，整個組合物中的ECM高于組合物的1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％(重量)。

在此，制備了脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)，使得用于心肌組織再生的許多生物活性得以保留。本發(fā)明的組合物的示例性生物活性包括但不限于：細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞成熟、細(xì)胞組織化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡(凋亡)的控制或引發(fā)，血管生成的刺激，蛋白水解活性，酶活性，細(xì)胞運(yùn)動性，蛋白質(zhì)和細(xì)胞調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄事件的激活，針對翻譯事件的準(zhǔn)備，對一些生物活性的抑制(例如對凝固、干細(xì)胞吸引、趨化性的抑制)，以及MMP或其他酶活性。

本發(fā)明的組合物包含基本上脫細(xì)胞化的基質(zhì)。在一些情況下，脫細(xì)胞化的基質(zhì)不包含天然細(xì)胞。在一些情況下，脫細(xì)胞化的基質(zhì)包含低于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(重量)的細(xì)胞成分。

在一些情況下，本發(fā)明的組合物可包含分級分離的來源于心臟組織的脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)。例如，本發(fā)明的組合物包含分子量低于300kDa、低于200kDa、低于100kDa、低于50kDa或低于20kDa的基質(zhì)材料。對于另一實(shí)例，本發(fā)明的組合物包含分子量低于300kDa、低于200kDa、低于100kDa、低于50kDa或低于20kDa的非水性基質(zhì)材料。對于又一實(shí)例，本發(fā)明的組合物包含分子量處于上限為300kDa、200kDa、100kDa、50kDa或20kDa且下限為0.5kDa、1kDa、2kDa、5kDa、10kDa或20kDa的范圍內(nèi)的基質(zhì)材料。

在一些情況下，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包含交聯(lián)劑，如戊二醛、甲醛、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或雙胺反應(yīng)性分子。

在一些情況下，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包含肽、蛋白質(zhì)、核酸、多核苷酸、寡核苷酸、DNA、RNA、促存活添加劑、蛋白聚糖或糖胺聚糖。在一些情況下，組合物還包含免疫抑制劑。在其他情況下，組合物不包含免疫抑制劑。

如本文所述，組合物可包含脫細(xì)胞化的ECM和不同組織脫細(xì)胞化ECM或者合成的或天然存在的聚合物。本發(fā)明的組合物的示例性聚合物包括但不限于：聚對苯二甲酸乙二醇酯纖維(滌綸)、聚四氟乙烯(PTFE)、戊二醛交聯(lián)的心包膜、聚乳酸(PLA)、聚二醇(PGA)、透明質(zhì)酸、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯(polyethelene)、鎳鈦諾以及來自動物和非動物來源的膠原蛋白(如植物膠原蛋白或合成膠原蛋白)。在一些情況下，組合物的聚合物是生物相容的和可生物降解的和/或可生物吸收的。示例性的可生物降解的或可生物吸收的聚合物包括但不限于：聚乳酸、聚乙交酯、聚己內(nèi)酯、聚二氧六環(huán)及它們的無規(guī)共聚物和嵌段共聚物?？缮锝到獾暮?或可生物吸收的聚合物可含有選自乙交酯、丙交酯、二氧環(huán)己酮、己內(nèi)酯、三亞甲基碳酸酯、乙二醇和賴氨酸的單體。材料可以是含有這些單體的無規(guī)共聚物、嵌段共聚物或單體、均聚物、共聚物和/或雜聚物的混合物?？缮锝到獾暮?或可生物吸收的聚合物可包含可生物吸收的和可生物降解的直鏈脂肪族聚酯如聚乙交酯(PGA)及其無規(guī)共聚物(乙交酯-丙交酯)共聚物(PGA-co-PLA)。合適的生物相容性聚合物的其他實(shí)例是包括甲基丙烯酸乙酯在內(nèi)的聚羥基烷基甲基丙烯酸酯和諸如聚乙烯吡咯烷酮和聚丙烯酰胺的水凝膠。其他合適的可生物吸收的材料為生物聚合物，其包括膠原蛋白、明膠、藻酸、殼多糖、殼聚糖、纖維蛋白、透明質(zhì)酸、葡聚糖、聚氨基酸、聚賴氨酸以及這些材料的共聚物。根據(jù)本發(fā)明考慮使用上述實(shí)例的任意組合、共聚物、聚合物或其混合物?？赏ㄟ^已知方法制備此類可生物吸收的材料。

在一些情況下，本發(fā)明的組合物包含自然衍生的聚合物和ECM。在此使用的自然衍生的聚合物的實(shí)例包括但不限于：藻酸鹽、纖維蛋白膠和多糖如透明質(zhì)酸。

在一種情況下，本發(fā)明的組合物包含來源于心臟組織的脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)，且進(jìn)一步包含生物相容性金屬。生物相容性金屬的實(shí)例包括但不限于鈦。在一個實(shí)例中，本發(fā)明的組合物包含生物相容性金屬的小直徑纖維或小直徑顆粒。組合物中的金屬可以為材料結(jié)構(gòu)提供支持。此外，當(dāng)脫細(xì)胞化的ECM在體內(nèi)降解時，可留下組合物的金屬部分以便為周圍組織提供支持結(jié)構(gòu)。

在一些情況下，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包含纖維素?？衫美w維素以使材料在體內(nèi)和體外形成期望的形狀。例如，當(dāng)用作組織培養(yǎng)試劑時，本文所述的組合物可包含纖維素，并且可設(shè)置成特定形狀。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種裝置，其中纖維素提供了基底，本文所述的組合物在該基底上沉積。該裝置然后可以特定形狀進(jìn)行遞送，以進(jìn)行組織修復(fù)。

可商購的ECM制品也可并入本文所述的方法、裝置和組合物中。在一個實(shí)施方式中，ECM來源于小腸粘膜下層或SIS。可商購的制品包括但不限于Surgisis^TM、Surgisis-ES^TM、Stratasis^TM和Stratasis-ES^TM(Cook Urological Inc.；Indianapolis,Ind.)以及GraftPatch^TM(Organogenesis Inc.；Canton Mass.)。在另一實(shí)施方式中，ECM來源于真皮?？缮藤彽闹破钒ǖ幌抻赑elvicol^TM(作為Permacol^TM在歐洲出售；Bard,Covington,Ga.)、Repliform^TM(Microvasive；Boston,Mass.)和Alloderm^TM(LifeCell；Branchburg,N.J.)。

本文描述了制備包含來源于組織的脫細(xì)胞化ECM的可注射組合物的方法。還描述了相關(guān)的組合物、裝置和使用方法。當(dāng)加溫至室溫以上(包括接近約37℃的生理溫度)時，組合物的粘度可增加。根據(jù)一個非限制性實(shí)施方式，ECM衍生的組合物在室溫和低于35℃的其他溫度下為可注射溶液。在另一非限制性實(shí)施方式中，凝膠在37℃的體溫或接近體溫時可注射，但是隨著溫度升高，其更快地膠凝。在一些情況下，在37℃的生理溫度下在小于5分鐘的時間內(nèi)形成凝膠。在一些情況下，在37℃的生理溫度下在小于10分鐘的時間內(nèi)形成凝膠。在一些情況下，在37℃的生理溫度下在小于15分鐘的時間內(nèi)形成凝膠。在一些情況下，在37℃的生理溫度下在小于30分鐘的時間內(nèi)形成凝膠。在一些情況下，在37℃的生理溫度下在小于45分鐘的時間內(nèi)形成凝膠。在一些情況下，在37℃的生理溫度下在小于1小時的時間內(nèi)形成凝膠。在一些情況下，在小于5分鐘的時間內(nèi)在體內(nèi)形成凝膠。在一些情況下，在小于10分鐘的時間內(nèi)在體內(nèi)形成凝膠。在一些情況下，在小于15分鐘的時間內(nèi)在體內(nèi)形成凝膠。在一些情況下，在小于30分鐘的時間內(nèi)在體內(nèi)形成凝膠。在一些情況下，在小于45分鐘的時間內(nèi)在體內(nèi)形成凝膠。在一些情況下，在小于1小時的時間內(nèi)在體內(nèi)形成凝膠。

在一個實(shí)施方式中，首先對心臟進(jìn)行脫細(xì)胞化，僅留下細(xì)胞外基質(zhì)。然后將基質(zhì)凍干、磨成或壓成細(xì)粉，并用胃蛋白酶或其他酶溶解。酶的實(shí)例包括但不限于：基質(zhì)金屬蛋白酶、膠原酶和胰蛋白酶。

在一個方面，遞送用于心臟修復(fù)的材料的方法包括：提供包含來源于心臟組織的脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)的凍干組合物；對凍干的基質(zhì)進(jìn)行滅菌；用液體溶液溶解凍干的基質(zhì)，從而形成材料；以及將材料遞送到心臟組織。在一些情況下，利用環(huán)氧乙烷或通過輻射對基質(zhì)進(jìn)行滅菌。在一些情況下，液體溶液是水、鹽水或緩沖溶液。在一些情況下，遞送是經(jīng)皮遞送，例如，通過經(jīng)心內(nèi)膜或經(jīng)冠狀動脈的導(dǎo)管遞送組合物。在一些情況下，遞送組合物的步驟發(fā)生在心肌梗死后約1到30天。在一些情況下，遞送組合物的步驟發(fā)生在心肌梗死后至少1個月或至少一年。遞送組合物的步驟發(fā)生在心肌梗死后約1到24小時。在一些情況下，組合物被遞送至心肌梗死處、心肌梗死處的邊緣區(qū)或離心肌梗死處2cm或更小的范圍內(nèi)。例如，遞送組合物的步驟可改變心室重構(gòu)。

在凝膠治療的一個實(shí)例中，隨后中和溶液并使用PBS或鹽水使其達(dá)到合適濃度。在一個實(shí)施方式中，隨后可通過針將溶液注入心肌(例如，經(jīng)由導(dǎo)管，穿過肋骨，或在開胸手術(shù)期間)。針號可以是但不限于22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g或更小。在一個實(shí)施方式中，用于注射凝膠的針號為27g。遞送還可通過球囊輸注導(dǎo)管或其他非針導(dǎo)管進(jìn)行。在體溫下，溶液之后可形成凝膠。

在本發(fā)明的又一方面，用于修復(fù)心臟組織的方法包括將包含來源于心臟組織的脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)的組合物注射到或植入受試者體內(nèi)。在一些情況下，在心肌梗死后一個月之內(nèi)注射或植入組合物，或者在心肌梗死后兩周之內(nèi)注射或植入組合物。在一些情況下，在心肌梗死后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、20天、45天、2個月、3個月、4個月、6個月或1年之內(nèi)注射或植入組合物。在一些情況下，組合物在注射或植入后的3個月內(nèi)或1個月內(nèi)降解。在一些情況下，組合物在注射或植入后的6周、2個月、4個月、6個月或1年內(nèi)降解。在一些情況下，所述組合物的注射或植入修復(fù)先天性缺陷。

在其他情況下，所述組合物的注射或植入防止或修復(fù)所述受試者所遭受的心臟組織損傷。該損傷可以是心肌梗死。在一些情況下，所述修復(fù)包括，在所述心肌梗死后的3個月，與具有心臟組織損傷而沒有接受所述組合物的注射或植入的受試者相比，心室容積變化至少低20％。在一些情況下，所述修復(fù)包括，在所述心肌梗死后的3個月，與具有心臟組織損傷而沒有接受所述組合物的注射或植入的受試者相比，心室容積變化至少低5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。所述損傷可以是心肌梗死。在一些情況下，所述修復(fù)包括，在所述心肌梗死后的3個月，與具有心臟組織損傷而沒有接受所述組合物的注射或植入的受試者相比，心室容積變化至少低5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些情況下，所述修復(fù)包括，在所述心肌梗死后的3個月，與具有心臟組織損傷而沒有接受所述組合物的注射或植入的受試者相比，射血分?jǐn)?shù)增加20％。(射血分?jǐn)?shù)是對心臟功能的衡量，其測量來自心室的輸出效率)。在一些情況下，所述修復(fù)包括，在所述心肌梗死后的3個月，與具有心臟組織損傷而沒有接受所述組合物的注射或植入的受試者相比，射血分?jǐn)?shù)增加大于20％、30％、50％、75％、100％或200％。

在又一實(shí)施方式中，凝膠可單獨(dú)地或與用于內(nèi)源性細(xì)胞長入、血管生成和再生的上述組分組合地注入梗死區(qū)、邊緣區(qū)或心肌。在又一實(shí)施方式中，凝膠也可單獨(dú)地或與上述組分組合地用作基質(zhì)，以改變心臟的機(jī)械性能和/或預(yù)防不利的左心室重構(gòu)。在又一實(shí)施方式中，凝膠可單獨(dú)地或與上述組分組合地與細(xì)胞一起遞送以用于心肌再生。在又一實(shí)施方式中，凝膠可單獨(dú)地或與上述組分組合地用于產(chǎn)生傳導(dǎo)阻滯以治療心律不齊。

在一種示例性方法中，可使用經(jīng)心內(nèi)膜遞送來注射組合物。在這個實(shí)例中，可利用NOGA引導(dǎo)的Myostar Catheter產(chǎn)生心內(nèi)膜的三維機(jī)電功能圖。使用該三維圖，可在遞送部位或心肌梗死部位處或在接近遞送部位或心肌梗死部位處進(jìn)行組合物的經(jīng)心內(nèi)膜注射。

在本文所述的另一示例性方法中，可使用與骨髓細(xì)胞的冠狀動脈內(nèi)注射相似的經(jīng)冠狀動脈遞送來注射本發(fā)明的組合物。在這個實(shí)例中，可在梗阻部位處擴(kuò)張穿導(dǎo)絲(over-the-wire)血管成形術(shù)球囊，并且可經(jīng)由導(dǎo)腔注入組合物。

對于可溶性試劑，在包括但不限于0.5M、0.1M或0.01M乙酸或0.1M HCl的低pH溶液中使溶液達(dá)到期望濃度，然后將其置于組織培養(yǎng)板/孔、蓋玻片或其他表面/3D基底內(nèi)以供組織培養(yǎng)。在置于37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)1小時之后，或在室溫或4℃下過夜之后，可將溶液除去。在用PBS沖洗板/孔之后，可將細(xì)胞在吸附的基質(zhì)上培養(yǎng)。溶液可在注射/植入之前、期間或之后與肽、蛋白質(zhì)、核酸、多核苷酸、寡核苷酸、DNA、RNA、藥物、營養(yǎng)物、促存活添加劑、蛋白聚糖和/或糖胺聚糖組合。

本發(fā)明的試劑提供了細(xì)胞在體外在心臟細(xì)胞外基質(zhì)的凝膠和吸附形式上的附著和存活。本發(fā)明已顯示，與標(biāo)準(zhǔn)平板涂層相比，心臟細(xì)胞外基質(zhì)的可溶性試劑形式誘導(dǎo)新生心肌細(xì)胞的更快的擴(kuò)散、更快的成熟和改善的存活。

在一些情況下，本發(fā)明提供的組合物可包含基質(zhì)并包含細(xì)胞。該細(xì)胞可以是任何種類的細(xì)胞。在一些情況下，該細(xì)胞是多種心臟細(xì)胞或心血管細(xì)胞，包括但不限于：來源于自體或同種異體來源的干細(xì)胞、祖細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。

可通過在ECM中培養(yǎng)細(xì)胞而制備包含ECM和細(xì)胞的本發(fā)明組合物。此外，在將諸如生長因子的蛋白質(zhì)添加到細(xì)胞外基質(zhì)中時，可將蛋白質(zhì)添加到組合物中，或者可將蛋白質(zhì)分子與基質(zhì)中的分子共價或非共價連接。蛋白質(zhì)與基質(zhì)分子的共價連接可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)共價蛋白質(zhì)連接程序來完成。蛋白質(zhì)可與一種或多種基質(zhì)分子共價連接。

在一個實(shí)施方式中，當(dāng)遞送包含細(xì)胞的組合物時，細(xì)胞可來自用于治療心肌的細(xì)胞源，包括自體的、非自體的、HLA匹配的、同種異體的、異種的或自生的來源。因此，人胚胎干細(xì)胞(hESC)、新生心肌細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、自體移植的擴(kuò)增的心肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞可通過本發(fā)明的組合物來遞送。在一些情況下，本發(fā)明的細(xì)胞可離體培養(yǎng)，并且在培養(yǎng)皿環(huán)境中直接分化成心肌細(xì)胞或分化成可變成心肌細(xì)胞的骨髓細(xì)胞。之后可將培養(yǎng)的細(xì)胞與組合物一起或與支架和其他組分接觸而移植到哺乳動物體內(nèi)。成肌細(xì)胞是適合于移植到心肌內(nèi)的另一細(xì)胞類型，然而，它們在體內(nèi)并不總是發(fā)育成心肌細(xì)胞。成體干細(xì)胞是又一細(xì)胞種類，其可能是本發(fā)明的組合物的一部分。成體干細(xì)胞被認(rèn)為通過在新部位生成其他干細(xì)胞(例如適合心肌的干細(xì)胞)而工作，或者它們在體內(nèi)直接分化成心肌細(xì)胞。它們在引入諸如心臟的器官后也可分化成其他譜系。在另一種情況下，間充質(zhì)干細(xì)胞與活化細(xì)胞因子一起施用。已表明間充質(zhì)細(xì)胞亞群在體外暴露于細(xì)胞因子時朝肌源性細(xì)胞系分化。

以下列表包括可用作本發(fā)明組合物的細(xì)胞組分的一些細(xì)胞：人胚胎干細(xì)胞、胎兒心肌細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、自體移植的擴(kuò)增的心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、全能細(xì)胞、多能細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能細(xì)胞、血液干細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成體干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、實(shí)質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、外源性細(xì)胞、內(nèi)源性細(xì)胞、干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、骨髓衍生的祖細(xì)胞、祖細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、未分化細(xì)胞、多能祖細(xì)胞、單能祖細(xì)胞、單核細(xì)胞、心肌細(xì)胞、心臟成肌細(xì)胞、骨骼成肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、異種細(xì)胞、同種異體細(xì)胞、成體干細(xì)胞、出生后干細(xì)胞和由轉(zhuǎn)分化生成的心肌細(xì)胞。如本文所述，分化細(xì)胞可用作本發(fā)明提供的組合物的細(xì)胞組分。分化細(xì)胞的實(shí)例包括心肌細(xì)胞、心臟成肌細(xì)胞和本文描述的或本領(lǐng)域已知的其他心臟細(xì)胞。此類細(xì)胞可通過從動物或人的器官(例如，心臟)分離細(xì)胞而獲得。此類細(xì)胞還可通過使ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞、成體干細(xì)胞或其他祖細(xì)胞(例如，心肌細(xì)胞的祖細(xì)胞)分化而獲得。分化方法是本領(lǐng)域已知的。此類細(xì)胞還可通過不同細(xì)胞類型的細(xì)胞(例如，骨髓細(xì)胞)整體轉(zhuǎn)分化而獲得。

人胚胎干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞可在包含心臟基質(zhì)的本發(fā)明的組合物上生長。在一些情況下，在本發(fā)明組合物的存在下生長的hESC衍生的心肌細(xì)胞提供更類似于體內(nèi)的形態(tài)學(xué)。在一些情況下，在本發(fā)明組合物的存在下生長的hESC衍生的心肌細(xì)胞提供增加的成熟標(biāo)志物。

本發(fā)明還涉及包含脫細(xì)胞化的心臟細(xì)胞外基質(zhì)的藥物遞送系統(tǒng)，其用于將細(xì)胞、藥物、分子或蛋白質(zhì)遞送到受試者體內(nèi)以治療有缺陷的、患病的、損傷的或缺血的組織或器官。在一個實(shí)施方式中，包含單獨(dú)的或與其他組分組合的脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)的生物相容性材料作為非破壞性傳導(dǎo)阻滯用于治療心律不齊。生物相容性材料還可用于移植細(xì)胞，或者被單獨(dú)地注射以募集天然細(xì)胞或充當(dāng)藥物遞送載體。本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)一步包含細(xì)胞、藥物、蛋白質(zhì)或選自但不限于以下各項(xiàng)的其他生物材料：促紅細(xì)胞生成素、干細(xì)胞因子(SCF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、軟骨生長因子(CGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)、骨骼生長因子(SGF)、成骨細(xì)胞衍生的生長因子(BDGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、細(xì)胞因子生長因子(CGF)、干細(xì)胞因子(SCF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(EGGS)、集落刺激因子(CSF)、生長分化因子(GDF)、整合素調(diào)節(jié)因子(IMF)、鈣調(diào)蛋白(CaM)、胸苷激酶(TK)、腫瘤壞死因子(TNF)、生長激素(GH)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、組織抑制劑基質(zhì)金屬蛋白酶(TIMP)、干擾素、白細(xì)胞介素、細(xì)胞因子、整合素、膠原蛋白、彈性蛋白、肌原纖蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、糖胺聚糖、血連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、硫酸乙酰肝素、皮膚素、硫酸軟骨素(CS)、透明質(zhì)酸(HA)、玻連蛋白、蛋白聚糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白、腱生蛋白、生腱蛋白和淋巴因子。

組織培養(yǎng)板可用本發(fā)明的細(xì)胞外基質(zhì)的凝膠形式或本發(fā)明的細(xì)胞外基質(zhì)的吸附形式涂覆，以培養(yǎng)心肌細(xì)胞或與心臟修復(fù)相關(guān)的其他細(xì)胞類型。這可用作這些細(xì)胞生長的研究試劑，或者用作在移植之前培養(yǎng)細(xì)胞的臨床試劑?？蓪⒓?xì)胞外基質(zhì)試劑應(yīng)用于其他組織基質(zhì)和細(xì)胞。

對于凝膠試劑，可使溶液的pH達(dá)到約6至約9的pH。在一些情況下，使pH達(dá)到約7.4的生理pH。然后使用PBS/鹽水或其他緩沖液使凝膠達(dá)到合適的濃度，然后將其置于組織培養(yǎng)板和/或孔中。一旦放置于37℃的培養(yǎng)箱中，溶液可形成凝膠，該凝膠可用于供細(xì)胞培養(yǎng)使用的任何2D或3D培養(yǎng)基底。在一個實(shí)施方式中，凝膠可與戊二醛、甲醛、雙NHS分子或其他交聯(lián)劑交聯(lián)，或者與細(xì)胞、肽、蛋白質(zhì)、DNA、藥物、營養(yǎng)物、促存活添加劑、蛋白聚糖和/或糖胺聚糖組合，或者與合成聚合物組合和/或交聯(lián)，以供進(jìn)一步使用。

本發(fā)明還提供了在吸附基質(zhì)上培養(yǎng)細(xì)胞的方法，包括以下步驟：(a)提供在包括但不限于0.5M或0.01M乙酸或0.1M HCl的低pH溶液中包含本發(fā)明生物相容性材料從而達(dá)到期望濃度的溶液，(b)將所述溶液置于組織培養(yǎng)板或孔中，(c)溫育所述組織培養(yǎng)板或孔，例如在37℃下溫育1小時，或在室溫或4℃下溫育過夜，(d)除去所述溶液，(e)用PBS沖洗所述組織培養(yǎng)板或孔，和(f)在吸附基質(zhì)上培養(yǎng)細(xì)胞?？稍诎景l(fā)明的心臟細(xì)胞外基質(zhì)的吸附基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞是心肌細(xì)胞或與心臟修復(fù)相關(guān)的其他細(xì)胞類型。

在一些情況下，組合物包含交聯(lián)劑，所述交聯(lián)劑包括但不限于：常用膠原蛋白交聯(lián)劑、HA交聯(lián)劑或降解及機(jī)械性質(zhì)改變的其他蛋白質(zhì)交聯(lián)劑。

在一種情況下，制備本發(fā)明組合物的方法包括電紡絲法。在一些情況下，本發(fā)明的方法配置用于控制納米纖維的尺寸、形狀或厚度。

在一些情況下，本發(fā)明的組合物可包含微珠。微珠可以是組合物的一部分或者通過組合物來遞送。示例性微珠可以是任何種類的材料，例如天然的或合成的。在一些情況下，微珠可具有改變的降解性質(zhì)或者包含例如MMP抑制劑、生長因子或小分子。

在一些情況下，組合物可包含在遞送組合物處可充當(dāng)粘合劑或錨的生物基團(tuán)。

在一種情況下，本發(fā)明的組合物可以是例如用于創(chuàng)傷修復(fù)的生物粘合劑。在一些情況下，本發(fā)明的組合物可配置為細(xì)胞粘附劑。例如，本發(fā)明的組合物可以是涂覆在醫(yī)療裝置或與包含或不含細(xì)胞的生物物質(zhì)混合。例如，本發(fā)明的組合物可以是用于合成聚合物血管移植物的涂層。在一些情況下，該組合物是抗細(xì)菌劑或者可包含抗細(xì)菌劑。

本發(fā)明的方法可包括遞送作為創(chuàng)傷修復(fù)裝置的組合物。例如，在心臟消融后，可遞送組合物以改善愈合。

在一種情況下，本發(fā)明的組合物包含用如本文所述的ECM組合物涂覆的藻酸鹽珠。

在一些情況下，該組合物是可注射的?？勺⑸涞慕M合物可以是，但不限于粉末、液體、顆粒、片段、凝膠或乳劑?？勺⑸涞慕M合物可注射到心臟內(nèi)，或者在許多情況下注射到左心室、右心室、左心房、右心房或心臟瓣膜內(nèi)。本發(fā)明的組合物可募集例如但不限于內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心臟祖細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞和心肌細(xì)胞。

制備本發(fā)明組合物的方法可包括對來自任何年齡的動物或人的組織進(jìn)行脫細(xì)胞化。

本發(fā)明的方法包括遞送包含ECM的組合物。示例性方法包括但不限于：在手術(shù)期間直接注射；穿過胸壁直接注射；通過導(dǎo)管穿過心內(nèi)膜遞送到心肌內(nèi)；通過冠狀血管遞送；和通過輸注球囊導(dǎo)管遞送。

在一些情況下，本發(fā)明的組合物是涂料。涂料可用于研究和臨床上的組織培養(yǎng)應(yīng)用。涂料可用于涂覆例如但不限于合成的或其他生物支架/材料或植入物。在一些情況下，對涂層進(jìn)行紋理化或圖案化。在一些情況下，制備涂層的方法包括吸附或化學(xué)連接。可使用組合物的溶液形式形成薄凝膠或吸附涂層。

通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本公開內(nèi)容，所述實(shí)施例不應(yīng)以任何方式解釋為對其范圍加以限制。對熟練技術(shù)人員而言顯而易見的是，各種修改和變化是可能的且預(yù)期在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

實(shí)施例1

本研究的目的是檢驗(yàn)?zāi)z作為體內(nèi)細(xì)胞粘附、生長、成熟和遞送的生長平臺的用途。結(jié)果證明由天然心臟細(xì)胞外基質(zhì)組織組成的凝膠可通過促進(jìn)細(xì)胞存活而有助于心臟組織再生。

對雌性Sprague Dawley大鼠施以安樂死并對它們的心臟進(jìn)行脫細(xì)胞化。然后將脫細(xì)胞化的心臟凍干、再水合、粉碎并再次凍干以形成干粉。用水使凍結(jié)的心臟再水合，然后將其浸入液氮中。一旦凍結(jié)，就在球狀及杯狀裝置內(nèi)以70psi整體壓碎心臟10秒。然后將粉末化的心臟微粒凍干。一旦變干，就將凍干的心臟組織與1％胃蛋白酶混合，并與0.01M HCl合并至10mg/mL的濃度。在室溫下攪拌溶液48小時，以使細(xì)胞外基質(zhì)組織溶解。48小時后，將HC1溶液等分到在冰上的Eppendorf管內(nèi)，并用0.1N NaOH中和至pH 7.4。

通過上述方法，天然大鼠心臟ECM凝膠已形成。如根據(jù)增加的材料粘性性質(zhì)所確認(rèn)的，2.5-8mg/mL凝膠在15分鐘內(nèi)發(fā)生成功膠凝。對于較高密度的凝膠，觀察到硬度增加。用1×PBS將pH經(jīng)過調(diào)整的溶液稀釋至一定濃度，將其以每孔50μL接種至96孔板上，然后轉(zhuǎn)移至37℃和5％CO₂的培養(yǎng)箱中。凝膠形成后，將100μL分離的2d新生心肌細(xì)胞以每孔60,000個細(xì)胞吸取至凝膠之上。幾天后，檢測細(xì)胞對凝膠的粘附。

將心肌細(xì)胞以1×10⁴接種在心臟ECM凝膠上表明細(xì)胞成功地粘附于ECM并存活。細(xì)胞在ECM上培養(yǎng)長達(dá)4天。

通過30G針將100ml心臟ECM溶液(7mg/mL)注入麻醉的大鼠的LV游離壁中?？傊?，研究表明，當(dāng)達(dá)到生理pH和溫度時，天然心臟細(xì)胞外基質(zhì)可被分離、溶解和自組裝成凝膠。

實(shí)施例2

在此，已研究了細(xì)胞涂層針對已脫細(xì)胞化和溶解的成體心室的天然心臟細(xì)胞外基質(zhì)的用途。優(yōu)點(diǎn)是天然心臟ECM可比傳統(tǒng)的細(xì)胞涂層具有更多組分，并且比用其他細(xì)胞類型進(jìn)行預(yù)處理更容易加以利用。

從Sprague-Dawley大鼠中取出心臟，并對其進(jìn)行脫細(xì)胞化。脫細(xì)胞化的心臟在液氮中冷凍后，進(jìn)行凍干、再水合和粉碎。然后在0.1M HCl中用胃蛋白酶消化ECM。消化48小時后，加入0.01M乙酸以稀釋至1mg/ml的最終濃度。

天然心臟ECM的胃蛋白酶消化物在使用二硫蘇糖醇(DTT)的還原性條件下在垂直凝膠電泳中進(jìn)行電泳，并與層粘連蛋白(BD Biosciences)和小牛皮膚膠原蛋白(Sigma)相比較。使用Imperial蛋白質(zhì)染色劑(Pierce)對凝膠進(jìn)行染色。當(dāng)與膠原蛋白和層粘連蛋白比較時，天然心臟ECM可展示出更為復(fù)雜的ECM組分的混合物。

使用分離試劑盒(Cellutron,Highland Park,NJ)從1至2日齡的Sprague-Dawley大鼠的心室收獲心肌細(xì)胞。舍棄最初的上清液，而獲取(strain)隨后20分鐘的消化物，并將其懸浮在補(bǔ)充有17％M199、10％馬血清、5％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素的DMEM中。分離后，將上清液預(yù)先接種到聚苯乙烯組織培養(yǎng)皿上，從而通過成纖維細(xì)胞的選擇性粘附來提高心肌細(xì)胞的純度。

在37℃下，1mg/ml天然心臟ECM或膠原蛋白I(Sigma,St.Louis,MO)吸附于48孔組織培養(yǎng)板上1小時。以200,000/cm²的密度接種分離的新生心肌細(xì)胞，并且在24小時后將培養(yǎng)基改變?yōu)榈脱寰S持培養(yǎng)基(DMEM，18.5％M199、5％HS、1％FBS和1％青霉素/鏈霉素)。細(xì)胞培養(yǎng)物維持在37℃和5％二氧化碳下，每日監(jiān)測，并且每2-3天添加新鮮培養(yǎng)基。在第2天、第4天和第7天固定培養(yǎng)物，并針對α-輔肌動蛋白、連接蛋白43、泛-鈣黏著蛋白、肌動蛋白和細(xì)胞核進(jìn)行染色。第2天，心肌細(xì)胞開始在培養(yǎng)中自發(fā)地搏動。第8天，在膠原蛋白上培養(yǎng)的細(xì)胞開始脫離培養(yǎng)板。在天然心臟ECM上培養(yǎng)的一組細(xì)胞持續(xù)搏動直到第45天。在膠原蛋白上培養(yǎng)的所有細(xì)胞在第14天停止搏動。

這項(xiàng)研究表明，與其他標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)涂層相比，天然心臟ECM包含更復(fù)雜的組分。附著于作為涂層以培養(yǎng)細(xì)胞的天然心臟ECM上的新生大鼠心肌細(xì)胞自發(fā)地開始搏動。在天然心臟ECM上培養(yǎng)的心肌細(xì)胞展示隨著時間推移而增加的輔肌動蛋白、連接蛋白43和泛-鈣黏著蛋白染色。另外，與在膠原蛋白上相比，新生心肌細(xì)胞在天然心臟ECM上的生存能力和附著增強(qiáng)。

實(shí)施例3

使用25分鐘缺血再灌注模型經(jīng)由左前降支動脈阻塞在大鼠中誘發(fā)心肌梗死。在心肌梗死后一周，由MRI圖像計算基線函數(shù)。豬心肌ECM以小塊形式在1％SDS中脫細(xì)胞化數(shù)天，隨后用DI漂洗過夜、凍干并磨成粉末。在0.1M HCl中用胃蛋白酶進(jìn)行消化以產(chǎn)生材料的可溶形式。

在注射前用1M NaOH將溶解的ECM調(diào)至pH 7.4，并用PBS稀釋至6mg/mL。在MI手術(shù)后，將動物隨機(jī)分成兩組，并在梗死手術(shù)后兩周通過30G針將ECM或鹽水注入雌性Sprague Dawley大鼠的LV游離壁內(nèi)。

注射手術(shù)后4周(MI后6周)，使用MRI再次評估心臟功能。

在第6周，注射了ECM的動物顯示出得到保持的功能(如基于射血分?jǐn)?shù)所評估的)，而注射了鹽水的動物未保持心臟功能。在注射了ECM的動物中，舒張末期容積和收縮末期容積也得到保持。

實(shí)施例4

目前，干細(xì)胞和其他細(xì)胞類型正處于臨床試驗(yàn)中，這些細(xì)胞通過27G導(dǎo)管遞送至心肌壁內(nèi)以治療心力衰竭。使用SDS去污劑對豬心室組織進(jìn)行脫細(xì)胞化，并對其進(jìn)行處理以形成基質(zhì)的可溶形式，中和至生理pH并稀釋至6mg/mL以供注射。

兩頭約克夏豬接受簧圈(coil)誘發(fā)的心肌梗死，并且在梗死后2個月注射單獨(dú)的心肌基質(zhì)或心肌基質(zhì)與細(xì)胞。

用熒光染料1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳菁碘化物(DiI)(一種用于組織學(xué)鑒定的細(xì)胞質(zhì)染料)預(yù)先標(biāo)記來源于胎兒心臟的外植體。使用在嚙齒動物模型中顯示提高h(yuǎn)ESC存活率的促存活混合物。

通過NOGA標(biāo)測(mapping)指導(dǎo)，經(jīng)導(dǎo)管以每30秒0.2mL的臨床相關(guān)速率注射單獨(dú)的基質(zhì)或基質(zhì)與細(xì)胞。各0.1mL的5份注射劑由基質(zhì)單獨(dú)組成或由基質(zhì)與細(xì)胞一起組成，注射到梗死的邊緣區(qū)內(nèi)。

基質(zhì)本身以及基質(zhì)與細(xì)胞一起能夠成功注入豬心臟內(nèi)，該過程是微創(chuàng)的且不會堵塞狹窄的導(dǎo)管。

實(shí)施例5

對豬心室心肌進(jìn)行脫細(xì)胞化，并通過對新鮮冷凍的脫細(xì)胞化組織切片進(jìn)行蘇木精和伊紅(H&E)染色以確認(rèn)細(xì)胞去除。在這個脫細(xì)胞化程序之后，將ECM凍干，然后磨成細(xì)顆粒。使用允許鑒定蛋白質(zhì)和蛋白聚糖的液相色譜質(zhì)譜法(LC-MS/MS)來表征心肌ECM粉末。LC-MS/MS顯示出多種ECM蛋白質(zhì)，指示脫細(xì)胞化后殘留的蛋白質(zhì)含量。所鑒定的ECM蛋白質(zhì)、糖蛋白和蛋白聚糖包括：I、III、IV、V和VI型膠原蛋白、彈性蛋白、纖維蛋白原、腔蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、纖蛋白和層粘連蛋白。對脫細(xì)胞化的心肌ECM內(nèi)的這些組分進(jìn)行的鑒定指示殘留的蛋白質(zhì)和蛋白聚糖的復(fù)雜組合。

為了生成組合物的可注射形式，通過酶消化溶解脫細(xì)胞化的基質(zhì)粉末。使基質(zhì)在持續(xù)攪拌下消化48小時。確定溶解的產(chǎn)物的糖胺聚糖(GAG)含量為23.2±4.63μg/mg基質(zhì)。

實(shí)施例6

通過添加NaOH和10X PBS使液體組合物達(dá)到生理pH，并用1X PBS將其稀釋至其最終濃度。此時，產(chǎn)物可立即使用，或者可凍干、冷凍保存，并且在使用之前用無菌水再水合。

組合物在經(jīng)心內(nèi)膜體內(nèi)注射到遍布間隔壁和LV游離壁的25個注射部位(每個部位0.2mL)后自組裝成水凝膠。對LV游離壁和間隔壁內(nèi)的基質(zhì)進(jìn)行的檢測確認(rèn)了向心肌內(nèi)的成功遞送以及基質(zhì)在體內(nèi)的膠凝。在衛(wèi)星器官中未觀察到材料。

實(shí)施例7

在本實(shí)施例中使用根據(jù)實(shí)施例5和6制備的組合物(在本實(shí)施例中被稱為“組合物”)。梗死后兩周，將組合物(n＝6)或鹽水(n＝6)注入雌性Sprague Dawley大鼠的LV游離壁。使用磁共振成像(MRI)評價MI后一周的心臟功能和LV幾何結(jié)構(gòu)作為治療前基線，并評價MI后六周的心臟功能和LV幾何結(jié)構(gòu)。如表1中所示，在注射了組合物的動物中，注射后四周的LV容積和射血分?jǐn)?shù)在統(tǒng)計學(xué)上仍等于基線測量值，而在鹽水對照動物中這兩個指標(biāo)都惡化。在已注射的動物中，注射后四周的LV容積和射血分?jǐn)?shù)在統(tǒng)計學(xué)上仍等于基線測量值，而在鹽水對照動物中這兩個指標(biāo)都惡化(圖3)。圖3展示了鹽水(a,b)和組合物(c,d)的注射前和注射后情況(與基線相比，*P<0.05；§P＝0.054)。射血分?jǐn)?shù)和容積的百分比變化也存在改善趨勢。

實(shí)施例8

對豬心室心肌進(jìn)行脫細(xì)胞化(圖4A)，并通過對新鮮冷凍的脫細(xì)胞化組織切片的蘇木精和伊紅(H&E)染色、利用Hoechst 33342的染色以及通過DNEasy試劑盒確認(rèn)細(xì)胞去除。在這個脫細(xì)胞化程序之后，將ECM凍干，然后磨成細(xì)顆粒(圖4B)。使用允許鑒定蛋白質(zhì)和蛋白聚糖的液相色譜質(zhì)譜法(LC-MS/MS)來表征心肌ECM粉末。LC-MS/MS顯示出多種ECM蛋白質(zhì)，指示脫細(xì)胞化后殘留的蛋白質(zhì)含量。所鑒定的ECM蛋白質(zhì)、糖蛋白和蛋白聚糖包括但不限于：I、III、IV、V和VI型膠原蛋白、彈性蛋白、纖維蛋白原、腔蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、纖蛋白和層粘連蛋白。對這些組分的鑒定指示殘留的蛋白質(zhì)和蛋白聚糖的復(fù)雜組合。

為了生成可注射形式，通過酶消化將脫細(xì)胞化的基質(zhì)粉末加工成液體。使基質(zhì)在持續(xù)攪拌下消化48小時，從而產(chǎn)生液體。通過溶液中可見顆粒的缺乏(圖4C)以及凝膠電泳中低分子量物質(zhì)的存在來確認(rèn)完全消化。在一些情況下，本發(fā)明的組合物不存在細(xì)胞核/DNA，具有低于20kDa的分子量帶，具有15-25μg/mg基質(zhì)的GAG含量，并且在48小時的消化后不存在可見顆粒。通過添加NaOH和10X PBS使液體達(dá)到生理pH，并用1X PBS將其稀釋至其最終濃度(6mg/mL，已針對合適的膠凝特性進(jìn)行優(yōu)化)。此時，產(chǎn)物可立即使用，或者可凍干、冷凍保存，并且在使用之前用無菌水再水合。為了在體外誘導(dǎo)膠凝，使溶液達(dá)到37℃，從而形成在規(guī)模和結(jié)構(gòu)上與天然ECM相似的多孔纖維狀支架(圖4D)?；蛘哌€可將材料注入體內(nèi)，在體內(nèi)其自組裝成水凝膠。雖然本文已示出和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白這些實(shí)施方式僅通過舉例的方式提供。

在不背離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在將會想到許多變更、變化和替換。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的本發(fā)明實(shí)施方式的各種替代方案可用于實(shí)踐本發(fā)明。以下權(quán)利要求旨在限定本發(fā)明的范圍，從而涵蓋這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等效方案。