本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種不含明膠和人血白蛋白的腮腺炎疫苗保護(hù)劑的配方和使用方法。
背景技術(shù)：
：預(yù)防性疫苗的應(yīng)用使常見流行性傳染病得到了有效控制，有效的降低了這些傳染病的發(fā)病率和死亡率。但是，在疫苗的使用過程中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)疫苗均存在較高的不良反應(yīng)發(fā)生率；隨著疫苗的廣泛應(yīng)用和對(duì)不良反應(yīng)誘因的深入研究發(fā)現(xiàn)，很多接種疫苗后出現(xiàn)的不良反應(yīng)問題與疫苗產(chǎn)品的保護(hù)劑有直接關(guān)系，特別是凍干疫苗產(chǎn)品中的凍干保護(hù)劑，其中的明膠或明膠衍生物能直接引起被接種者過敏等變態(tài)反應(yīng)，研究表明明膠所致人體的過敏反應(yīng)有體液免疫機(jī)制(IgE抗體)，也有細(xì)胞免疫機(jī)制(張卓光，疫苗中牛源明膠的致敏作用，《國(guó)外醫(yī)學(xué)》，2002年(第2期)，25)?，F(xiàn)有疫苗產(chǎn)品多數(shù)是參考世界衛(wèi)生組織所頒發(fā)的生物制品規(guī)程為標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)的，標(biāo)準(zhǔn)中沒有對(duì)保護(hù)劑的明膠成分使用量加以限制。日本FDA于1986年批準(zhǔn)的疫苗上市許可及美國(guó)FDA批準(zhǔn)的疫苗上市許可中，均沒有把明膠作為生產(chǎn)疫苗的禁用成分。在早期的專利文獻(xiàn)中，大多數(shù)疫苗保護(hù)劑都含有明膠成分。國(guó)家藥典委員會(huì)在2007年7月17日至7月19日北京會(huì)議紀(jì)要中明確要求“作為穩(wěn)定劑成分的明膠注射到人體后可發(fā)生過敏反應(yīng)，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)進(jìn)行取代明膠成分的相關(guān)研究工作，以進(jìn)一步提高制品的安全性”。目前，人血清白蛋白在疫苗領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用病毒培養(yǎng)和凍干保護(hù)劑，人血清白蛋白是從人的血漿中提取，這樣的生產(chǎn)方式不僅受到血漿供應(yīng)的限制，而且還可能含有危險(xiǎn)的傳染病病原體，例如肝炎病毒等，因此使用過程中存在較大的擔(dān)憂；此外，人血清白蛋白的價(jià)格昂貴，使得疫苗的成本驟升。所以迫使研究者研究一系列人血清白蛋白的替代品來改進(jìn)傳統(tǒng)的配方。目前現(xiàn)有技術(shù)中不含明膠、人血清白蛋白的保護(hù)劑雖然降低了對(duì)人體的刺激性，但是對(duì)疫苗的保護(hù)效果并不理想，使得疫苗在凍干過程中和儲(chǔ)存過程中的穩(wěn)定性下降，易發(fā)生失效。因此，本領(lǐng)域中急需一種安全有效的無明膠、無人血清白蛋白疫苗凍干保護(hù)劑，在保障疫苗質(zhì)量的同時(shí)，降低免疫風(fēng)險(xiǎn)和生產(chǎn)成本。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種不含明膠、不含人血白蛋白的新型疫苗凍干保護(hù)劑，使內(nèi)毒素含量下降，不易發(fā)生過敏反應(yīng)，并且仍然能保持較高的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的有效期。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種疫苗凍干保護(hù)劑，該凍干保護(hù)劑各成分在疫苗半成品中的終濃度為：蔗糖30-100g/L、谷氨酸鈉0.5-15g/L、尿素0-10g/L、磷酸氫二鈉1-20g/L、枸櫞酸0.2-10g/L；所述疫苗半成品是指凍干前的液態(tài)疫苗。優(yōu)選地，該凍干保護(hù)劑各成分在疫苗半成品中的終濃度為：蔗糖30-80g/L、谷氨酸鈉0.5-10g/L、尿素0-5g/L、磷酸氫二鈉1-10g/L、枸櫞酸0.2-5g/L。更優(yōu)選地，該凍干保護(hù)劑各成分在疫苗半成品中的終濃度為：蔗糖50g/L、谷氨酸鈉10g/L、尿素5g/L、磷酸氫二鈉10g/L、枸櫞酸5g/L。本發(fā)明提供的腮腺炎疫苗凍干保護(hù)劑，其成分中不含明膠和人血白蛋白。用于配制本發(fā)明凍干保護(hù)劑的基質(zhì)液為199培養(yǎng)液或PBS緩沖溶液或注射用水。進(jìn)一步地，所述的199培養(yǎng)液為無酚紅199培養(yǎng)基。本發(fā)明提供了上述腮腺炎疫苗凍干保護(hù)劑在制備凍干腮腺炎疫苗中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種制備凍干腮腺炎疫苗的方法，包括以下步驟：提供腮腺炎病毒液；按比例加入本發(fā)明所述的腮腺炎疫苗凍干保護(hù)劑至病毒液中，制成腮腺炎病毒活疫苗原液；將腮腺炎病毒活疫苗原液按疫苗半成品中目標(biāo)病毒滴度加入適量稀釋液配制成疫苗半成品，使疫苗凍干保護(hù)劑中各成分在疫苗半成品中的終濃度為：蔗糖30-100g/L、谷氨酸鈉0.5-15g/L、尿素0-10g/L、磷酸氫二鈉1-20g/L、枸櫞酸0.2-10g/L；所述稀釋液含有與本發(fā)明的凍干保護(hù)劑相同的成分，且各成分的濃度與本發(fā)明凍干保護(hù)劑在疫苗半成品中的終濃度一致；所述疫苗半成品為凍干前的液態(tài)疫苗；所述目標(biāo)病毒滴度為5.8±0.3lgCCID50/ml；疫苗半成品在2-8℃條件下，分裝，凍干。凍干的條件為：預(yù)凍階段最低溫度-45℃～-48℃，達(dá)到最低溫度后維持2小時(shí)；升華干燥階段最終溫度-35℃，達(dá)到最終溫度的時(shí)間為17小時(shí)，真空壓力控制在4-6Pa；解吸干燥階段最終溫度28℃，真空不控制，運(yùn)行8小時(shí)。利用本發(fā)明提供的上述制備方法制備得到的一種凍干腮腺炎疫苗也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供了一種無明膠無人血白蛋白的凍干保護(hù)劑，其能夠合理替代明膠和人血白蛋白，且能達(dá)到同類產(chǎn)品相同的有效性，并具有更高的安全性。本發(fā)明中凍干保護(hù)劑的安全性與上市產(chǎn)品比較不易發(fā)生過敏反應(yīng)，安全性更高，而疫苗的質(zhì)量遠(yuǎn)高于《中國(guó)藥典》三部要求的標(biāo)準(zhǔn)，其效果包括：(1)保護(hù)劑成分中不含有明膠、人血白蛋白、右旋糖酐、海藻糖，不易引發(fā)過敏反應(yīng)，如蕁麻疹、皮膚瘙癢、發(fā)熱、惡心等，疫苗的安全性更高，減少了接種疫苗的不良反應(yīng)；(2)采用本發(fā)明制備的腮腺炎減毒活疫苗成品病毒滴度均大于4.8lgCCID50/ml，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)高于《中國(guó)藥典》三部要求不低于4.0lgCCID50/ml標(biāo)準(zhǔn)；熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果均大于4.4lgCCID50/ml，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)高于《中國(guó)藥典》三部要求不低于4.0lgCCID50/ml標(biāo)準(zhǔn)；病毒滴度下降值不高于0.6lg，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)高于《中國(guó)藥典》三部要求下降不高于1.0lg標(biāo)準(zhǔn)；(3)水分均低于2.0％，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)高于《中國(guó)藥典》三部要求不高于3.0％標(biāo)準(zhǔn)；(4)采用本發(fā)明制備的腮腺炎減毒活疫苗成品加速穩(wěn)定性及長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果不低于含明膠和人血白蛋白的對(duì)照樣品；(5)采用本發(fā)明制備的腮腺炎減毒活疫苗成品的內(nèi)毒素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于2015版《中國(guó)藥典》三部要求(應(yīng)不高于50EU/劑)；(6)腮腺炎減毒活疫苗成品進(jìn)行豚鼠全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)：供試品經(jīng)皮下注射致敏后再經(jīng)靜脈注射激發(fā)，觀察豚鼠注射供試品后所產(chǎn)生的全身過敏反應(yīng)，過敏反應(yīng)應(yīng)為陰性。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；若未特別指明，實(shí)施例中所用試劑均為市售。腮腺炎病毒S79株來源于衛(wèi)生部上海生物制品研究所。實(shí)施例1本發(fā)明實(shí)施例中腮腺炎病毒S79株病毒液的制備方法1.將孵化9～11天的SPF種蛋進(jìn)行解剖，棄去雞胚頭及內(nèi)臟，將組織塊消化制備細(xì)胞懸液，用細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液將細(xì)胞懸液稀釋到適宜的細(xì)胞濃度，分裝于10L轉(zhuǎn)瓶置于36.5±1℃恒溫室培養(yǎng)，培養(yǎng)至長(zhǎng)成致密單層細(xì)胞。2.待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后，棄細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液換pH值7.2～7.4病毒生長(zhǎng)液，按MOI0.001～0.01接種腮腺炎病毒(S79株)，置于33±1℃恒溫室繼續(xù)培養(yǎng)。3.病毒培養(yǎng)44～52小時(shí)后棄去病毒生長(zhǎng)液，并用0.85％的生理鹽水洗滌細(xì)胞表面除去牛血清白蛋白，洗換后加入不含牛血清白蛋白、pH值7.4～7.6的病毒維持液，置于33±1℃中繼續(xù)培養(yǎng)。4.鏡下觀察當(dāng)病變達(dá)到75％以上時(shí)，收獲病毒液，合并后即為單次收獲液。實(shí)施例2本發(fā)明凍干保護(hù)劑的組分、含量(在疫苗半成品中的終濃度)組分1：蔗糖，藥用級(jí)，30～100g/L；組分2：谷氨酸鈉，藥用級(jí)，0.5～15g/L；組分3：尿素，藥用級(jí)，0.0～5.0g/L；組分4：磷酸氫二鈉，分析純，1.0～20g/L；組分5：枸櫞酸，藥用級(jí)，0.2～10g/L；溶劑：注射用水或PBS緩沖溶液或199培養(yǎng)液；本發(fā)明凍干保護(hù)劑的配制方法：(1)將上述組分1稱量后，加入溶劑溶解，定溶后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，滅菌條件為121℃、30分鐘；(2)稱取上述組分2、組分3，加入溶劑溶解，定溶后液體通過0.2微米濾器除菌過濾，置于2～8℃冷庫(kù)，備用；(3)稱取上述組分4、組分5，分別加入溶劑溶解，然后混合定溶，定溶后液體通過0.2微米濾器除菌過濾，置于2～8℃冷庫(kù)，備用；(4)保護(hù)劑在使用前將(1)(2)(3)進(jìn)行混合。實(shí)施例3以腮腺炎病毒S79株制備的工作種子接種原代雞胚細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液后，將凍干保護(hù)劑與病毒收獲液按1:4(V/V)的比例混合制備疫苗原液，其中，凍干保護(hù)劑在疫苗原液中的終濃度為蔗糖50g/L、谷氨酸鈉10g/L、尿素5g/L、磷酸氫二鈉10g/L、枸櫞酸5g/L。向疫苗原液中加入適量pH6.8～7.0的稀釋液，使得目標(biāo)病毒滴度為5.8lgCCID50/ml，即獲得半成品溶液；其中，稀釋液為含有蔗糖50g/L、谷氨酸鈉10g/L、尿素5g/L、磷酸氫二鈉10g/L、枸櫞酸5g/L的溶液。將半成品分裝于西林瓶中凍干，即為腮腺炎減毒活疫苗成品。凍干方法為：預(yù)凍階段溫度-45℃，達(dá)到溫度后維持2小時(shí)；升華干燥階段最終溫度-35℃，達(dá)到最終溫度的時(shí)間為17小時(shí)，真空壓力控制在5±1Pa；解吸干燥階段最終溫度28℃，真空不控制，運(yùn)行8小時(shí)。實(shí)施例4以腮腺炎病毒S79株制備的工作種子接種原代雞胚細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液后，將凍干保護(hù)劑與病毒收獲液按1:4(V/V)的比例混合制備疫苗原液，其中，凍干保護(hù)劑在疫苗原液中的終濃度為蔗糖30g/L、谷氨酸鈉3g/L、尿素2g/L、磷酸氫二鈉5g/L、枸櫞酸2g/L。向疫苗原液中加入適量pH6.8～7.0的稀釋液，使得目標(biāo)病毒滴度為5.8lgCCID50/ml，即獲得半成品溶液；其中，稀釋液為含有蔗糖30g/L、谷氨酸鈉3g/L、尿素2g/L、磷酸氫二鈉5g/L、枸櫞酸2g/L的溶液。將半成品分裝于西林瓶中凍干，即為腮腺炎減毒活疫苗成品。凍干方法為：預(yù)凍階段溫度-45℃，達(dá)到溫度后維持2小時(shí)；升華干燥階段最終溫度-35℃，達(dá)到最終溫度的時(shí)間為17小時(shí)，真空壓力控制在5±1Pa；解吸干燥階段最終溫度28℃，真空不控制，運(yùn)行8小時(shí)。實(shí)施例5以腮腺炎病毒S79株制備的工作種子接種原代雞胚細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液后，將凍干保護(hù)劑與病毒收獲液按1:4(V/V)的比例混合制備疫苗原液，其中，凍干保護(hù)劑在疫苗原液中的終濃度為蔗糖80g/L、谷氨酸鈉2g/L、磷酸氫二鈉3g/L、枸櫞酸0.2g/L。向疫苗原液中加入適量pH6.8～7.0的稀釋液，使得目標(biāo)病毒滴度為5.8lgCCID50/ml，即獲得半成品溶液；其中，稀釋液為含有蔗糖80g/L、谷氨酸鈉2g/L、磷酸氫二鈉3g/L、枸櫞酸0.2g/L的溶液。將半成品分裝于西林瓶中，凍干，即為腮腺炎減毒活疫苗成品。凍干方法為：預(yù)凍階段溫度-45℃，達(dá)到溫度后維持2小時(shí)；升華干燥階段最終溫度-35℃，達(dá)到最終溫度的時(shí)間為17小時(shí)，真空壓力控制在5±1Pa；解吸干燥階段最終溫度28℃，真空不控制，運(yùn)行8小時(shí)。對(duì)以上3～5實(shí)施例制得的腮腺炎減毒活疫苗成品分別于37℃、4℃放置不同時(shí)間，取樣進(jìn)行外觀、水分及病毒滴定，并與科興(大連)疫苗技術(shù)有限公司的已上市產(chǎn)品(含明膠和人血清白蛋白)的腮腺炎減毒活疫苗產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)外觀：淡黃色疏松體，復(fù)溶后為淡黃色液體，無異物。(2)水分：依《中華人民共和國(guó)藥典》三部(附錄ⅫD)檢查，應(yīng)不高于3.0％。(3)病毒滴定：采用微量細(xì)胞病變法進(jìn)行病毒滴定檢測(cè)。取疫苗3瓶混合，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，每稀釋度病毒液接Vero細(xì)胞，置36.5±1℃、5％CO2培養(yǎng)，培養(yǎng)8天判定結(jié)果，病毒滴度應(yīng)不低于4.0lgCCID50/ml。結(jié)果見表1、表2。表1腮腺炎減毒活疫苗37℃加速穩(wěn)定性結(jié)果※為科興(大連)疫苗技術(shù)有限公司已上市的腮腺炎減毒活疫苗產(chǎn)品批號(hào)。表2腮腺炎減毒活疫苗2～8℃長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果※為科興(大連)疫苗技術(shù)有限公司已上市的腮腺炎減毒活疫苗產(chǎn)品批號(hào)。對(duì)以上3～5實(shí)施例的保護(hù)劑生產(chǎn)的成品分別于進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，并與科興(大連)疫苗技術(shù)有限公司的已上市產(chǎn)品(含明膠和人血清白蛋白)的腮腺炎減毒活疫苗產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查：依《中華人民共和國(guó)藥典》三部(附錄ⅫE凝膠限度試驗(yàn))檢查，應(yīng)不高于50EU/劑。(2)豚鼠全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)：供試品經(jīng)皮下注射致敏后再經(jīng)靜脈注射激發(fā)，觀察豚鼠注射供試品后所產(chǎn)生的全身過敏反應(yīng)，過敏反應(yīng)應(yīng)為陰性。試驗(yàn)結(jié)果如下表3：表3腮腺炎減毒活疫苗安全性評(píng)價(jià)實(shí)施例細(xì)菌內(nèi)毒素檢查豚鼠全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)3<1.25陰性4<1.25陰性5<1.25陰性201210003※<12.5陰性※為科興(大連)疫苗技術(shù)有限公司已上市的腮腺炎減毒活疫苗產(chǎn)品批號(hào)由以上數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明的不含明膠和人血白蛋白保護(hù)劑與目前常規(guī)使用的含明膠和人血白蛋白保護(hù)劑相比，穩(wěn)定性結(jié)果無顯著性差異，但是本發(fā)明的疫苗凍干保護(hù)劑提高了疫苗的安全性，可降低疫苗的不良反應(yīng)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3