本發(fā)明涉及一種來自棉子糖乳球菌的活性化合物與三萜類化合物的聯(lián)合應(yīng)用，屬于生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：天然產(chǎn)物是藥物先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的重要來源，近年來，越來越多的天然產(chǎn)物化學家把目光投向生物種類更加多樣的微生物。香鱗毛蕨Dryopterisfragrans（L.）Schott．是一種野生多年生蕨類植物，系鱗毛蕨科鱗毛蕨屬。其生境極其特殊，生于海拔700-2400米的林下或高寒地區(qū)的滑石坡、森林中的碎石坡上和火山周圍的巖漿縫隙中。主要分布于黑龍江省五大連池地質(zhì)公園內(nèi)、塔河縣白卡獸山、呼中的大白山的高山地帶及小興安嶺北部地區(qū)。其中尤以生長于五大連池的香鱗毛蕨活性最強。民間流傳香鱗毛蕨對銀屑病、頭皮炎、干癬、痤瘡等多種皮膚病有良好的治療效果?，F(xiàn)有技術(shù)有人從中分離出具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物：經(jīng)實驗證明，該三萜類化合物可直接抑制K562細胞的增殖，抑制能力隨濃度的增加和作用時間的延長而增強。同時，可誘導(dǎo)K562細胞凋亡，且這種促凋亡的效應(yīng)隨著濃度和時間的增加而增加，該化合物可能為慢性粒細胞白血病的治療提供一種潛在的手段。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)來自棉子糖乳球菌的活性化合物與三萜類化合物的聯(lián)合應(yīng)用具有令人驚訝的協(xié)同效果。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種來自棉子糖乳球菌的活性化合物與三萜類化合物的聯(lián)合應(yīng)用，具體而言，聯(lián)合應(yīng)用后可以大大增加對腫瘤的抑制程度，以及對酪氨酸酶的抑制程度。可見，在腫瘤和美白領(lǐng)域會有很好的應(yīng)用前景。本發(fā)明人從廣東微生物保藏中心購得一株棉子糖乳球菌，其編號為：GIM1.1015，根據(jù)保藏中心的記載，該菌株的其他編號為：JCM5706。=ATCC43920=CGMCC1.1935=DSM20443=NBRC100932。對該株棉子糖乳球菌進行培養(yǎng)，在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-72h，共發(fā)酵100L。過濾、濃縮后得到水相10L，用乙酸乙酯進行萃取，減壓濃縮后得到乙酸乙酯層浸膏20g，經(jīng)300目硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脫，合并相同組分，各組分再經(jīng)反復(fù)硅膠層析，SephadexLH-20和ＲP-18反相柱色譜分離純化以及C18高效液相制備得兩種化合物，1(3.5mg)、化合物2(8.1mg)經(jīng)鑒定，化合物1的結(jié)構(gòu)式為：本發(fā)明人還驚訝地發(fā)現(xiàn)，該活性化合物具有顯著的降血脂作用，還具有美白作用。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明公開了一種來自棉子糖乳球菌的活性化合物與三萜類化合物的聯(lián)合應(yīng)用，具體而言，聯(lián)合應(yīng)用后可以大大增加對腫瘤的抑制程度，以及對酪氨酸酶的抑制程度?？梢?，在腫瘤和美白領(lǐng)域會有很好的應(yīng)用前景。具體實施方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例1：本發(fā)明人從廣東微生物保藏中心購得一株棉子糖乳球菌，其編號為：GIM1.1015，根據(jù)保藏中心的記載，該菌株的其他編號為：JCM5706。=ATCC43920=CGMCC1.1935=DSM20443=NBRC100932。對該株棉子糖乳球菌進行培養(yǎng)，在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-72h，共發(fā)酵100L。過濾、濃縮后得到水相10L，用乙酸乙酯進行萃取，減壓濃縮后得到乙酸乙酯層浸膏20g，經(jīng)300目硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脫，合并相同組分，各組分再經(jīng)反復(fù)硅膠層析，SephadexLH-20和ＲP-18反相柱色譜分離純化以及C18高效液相制備得兩種化合物，化合物1(3.5mg)、化合物2(8.1mg)經(jīng)鑒定，化合物1為淡黃色粉末，溶于二氯甲烷，分子式為C13H14O3;mp.60攝氏度，化合物1的結(jié)構(gòu)式為：其核譜數(shù)據(jù)如下所示：經(jīng)檢索核實，和已知文獻報告過的化合物一致（天然產(chǎn)物研究與開發(fā)NatProdＲesDev2014，26:159-161），但是該文獻沒有對該化合物的功能進行研究。實施例2：本發(fā)明人對實施例1的發(fā)酵方法進行改進，發(fā)現(xiàn)可以大幅提高該化合物的產(chǎn)量，為低成本工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能性。本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)：特定濃度范圍的甘草查爾酮B配合特定的溫度曲線，可以令人驚訝地大幅提高該化合物的產(chǎn)量。甘草查爾酮B購自上海麗臣公司，純度＞98%。從廣東微生物保藏中心購得一株棉子糖乳球菌，其編號為：GIM1.1015，根據(jù)保藏中心的記載，該菌株的其他編號為：JCM5706。=ATCC43920=CGMCC1.1935=DSM20443=NBRC100932。對該株棉子糖乳球菌進行培養(yǎng)，接種進modified-MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h：前18h保持35攝氏度；第19-22h保持18攝氏度，第23-48h保持30攝氏度培養(yǎng)；所述modified-MRS液體培養(yǎng)基為MRS+0.002%甘草查爾酮B，共發(fā)酵100L。過濾、濃縮后得到水相10L，用乙酸乙酯進行萃取，減壓濃縮后得到乙酸乙酯層浸膏20g，經(jīng)300目硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脫，合并相同組分，各組分再經(jīng)反復(fù)硅膠層析，SephadexLH-20和ＲP-18反相柱色譜分離純化以及C18高效液相制備得兩種化合物，化合物1(36.8mg)、化合物2(8.1mg)。實施例3：現(xiàn)有技術(shù)有人從中分離出具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物，下稱化合物2：經(jīng)實驗證明，該三萜類化合物可直接抑制K562細胞的增殖，抑制能力隨濃度的增加和作用時間的延長而增強。同時，可誘導(dǎo)K562細胞凋亡，且這種促凋亡的效應(yīng)隨著濃度和時間的增加而增加，該化合物可能為慢性粒細胞白血病的治療提供一種潛在的手段。黑色素為高分子生物色素，主要由2種醌型的聚合物組成，分別是真黑素(eumelanin)和褐黑素(pheomelanin)。黑色素的生物合成首次由Raper和Mason闡明，近年來Cooksey和Schallreuter對其進行了完善。皮膚黑色素的形成過程包括黑色素細胞的遷移、分裂成熟、黑色素小體(melanosome)的形成、黑色素顆粒的轉(zhuǎn)運以及黑色素的排泄等一系列生制生化過程。黑色素的合成必須有3種物質(zhì)參與：合成黑色素的主要原料酪氨酸（tyrosine，Tyr）；催化酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏氐闹饕匏倜咐野彼崦福╰yrosinase，Tyr）以及參與此催化過程的氧元素①在酪氨酸酶的催化作用下，酪氨酸被氧化為多巴醌；②多巴醌自動氧化生成多巴和多巴色素，多巴也是酪氨酸酶的底物，它被催化后再次生成多巴醌。③多巴色素的反應(yīng)產(chǎn)物5，6-二羥基吲哚（DHI）和5，6-二羥基吲哚羧酸（DHICA）經(jīng)一系列的氧化反應(yīng)生成真黑素，其為皮膚的色素主要組分。④在半胱氨酸或者谷胱甘肽存在的條件下，多巴醌會轉(zhuǎn)變成半胱氨酰多巴，最后生成褐黑素，目前褐黑素在皮膚中的功能尚無文獻報道。具有以上6種作用機制的化合物中，只有特異性的酪氨酸酶滅活劑和特異性的酪氨酸酶抑制劑能直接作用于酪氨酸酶，它們的抑制作用相對較強，而其他幾類化合物都是間接作用于酪氨酸酶，抑制作用相對較弱。酪氨酸酶抑制劑根據(jù)抑制類型可分為競爭性抑制劑、非競爭性抑制劑和混合型（競爭性/非競爭性）抑制劑3類。酪氨酸酶是一種多活性酶，實驗原理是通過測定催化多巴氧化成多巴醌過程中的多巴化酶活性求得酪氨酸酶的抑制效果。在96孔細胞培養(yǎng)板上以密度為3×104細胞/孔接種人黑色素細胞懸液培養(yǎng)24h，用PBS洗滌細胞兩次，再加入含有曲通100的PBS溶液，添加L-多巴和待測物多巴。繼續(xù)培養(yǎng)1h后，計算反應(yīng)前后的475nmA的差值，結(jié)果除以細胞數(shù)，作為評價酪氨酸酶活性高低的指標。結(jié)果以半數(shù)抑制量IC50表示，結(jié)果越小，表明美白物質(zhì)的抑制作用越大。經(jīng)測定，化合物1的IC50為8.3μM?；衔?不具備酪氨酸酶抑制活性。將化合物1和2按照質(zhì)量比1:1混合時，IC50為5.3μM。將化合物1和2按照質(zhì)量比2:1混合時，IC50為4.6μM。將化合物1和2按照質(zhì)量比1:2混合時，IC50為1.6μM?？梢?，化合物1和2聯(lián)合使用，大大增強了酪氨酸酶的抑制活性，尤其是當將化合物1和2按照質(zhì)量比1:2混合時，IC50僅僅為1.6μM。實施例4：MTT（四唑鹽）法測定對人腫瘤細胞的殺傷作用。腫瘤細胞類型：人肝癌HepG-2細胞和人胃癌BGC-823細胞。實驗具體操作方法：腫瘤細胞培養(yǎng)于RPMI1640基質(zhì)中（含有10%L-谷氨酰胺的胎牛血清，100μg·mL?1盤尼西林，100μg·mL?1鏈霉素）。取處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，以濃度為10×104個mL-1，取180μL的細胞懸液置于96孔板中，每組均設(shè)3個平行孔，另設(shè)空白孔和對照孔，空白孔未接種細胞，對照孔為不含藥物的培養(yǎng)液。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液中加入待測樣品（樣品溶解于DMSO中，用培養(yǎng)基逐步稀釋，加入細胞中藥液的DMSO終濃度低于1%），使藥物終濃度為0、5、25、50、75、100μM。溶液繼續(xù)在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)48h。每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，溶解于PBS中，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，終止培養(yǎng)。小心吸棄上清液，每孔加入150μLDMSO，搖床上震蕩10min，使結(jié)晶物完全充分溶解。用酶標儀在570nm處測每孔的吸光值（A），計算出細胞存活抑制率：細胞存活抑制率%=[1-(實驗組A-空白組A)/（對照組A-空白組A）]×100%。數(shù)據(jù)使用SPSS軟件分析系統(tǒng)進行處理。實驗結(jié)果：不同濃度該新化合物對腫瘤細胞的存活抑制率實驗數(shù)據(jù)見下表。化合物1對腫瘤細胞的抑制作用：藥物濃度人肝癌HepG-2細胞抑制率（%）人胃癌BGC-823細胞抑制率（%）5μM0025μM0050μM2.356.52100μM5.987.39化合物2對腫瘤細胞的抑制作用：藥物濃度人肝癌HepG-2細胞抑制率（%）人胃癌BGC-823細胞抑制率（%）5μM3.22.925μM10.915.850μM22.930.8100μM35.946.7化合物1+化合物2按照質(zhì)量比1:1聯(lián)合使用時對腫瘤細胞的抑制作用：藥物濃度（化合物1+2的總濃度）人肝癌HepG-2細胞抑制率（%）人胃癌BGC-823細胞抑制率（%）5μM35.940.125μM55.960.750μM75.879.9100μM90.190.3結(jié)果表明，化合物1+2聯(lián)合使用物對上述腫瘤細胞均有顯著的生長抑制作用具有顯著的協(xié)同作用。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。當前第1頁1 2 3