本發(fā)明涉及一種人參枸杞子組合物的制備方法及其產(chǎn)品，特別涉及一種以鮮枸杞子和鮮人參為原料經(jīng)過超微低溫破碎、酶解等工藝制備人參枸杞子組合物的方法以及由該方法得到的產(chǎn)品。本發(fā)明屬于食品、保健品和藥品加工
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：枸杞子為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的成熟果實，夏、秋二季果實呈紅色時采收。寧夏是枸杞原產(chǎn)地，栽培枸杞已有500多年的歷史，而中寧枸杞則是寧夏枸杞中之上品。中寧枸杞色艷、粒大、皮薄、肉厚、籽少、甘甜，品質(zhì)超群，是惟一被載入新版中國藥典的枸杞品種。其成熟果實中富含特殊生物活性功能成分，如枸杞多糖、單糖、甜菜堿、東莨菪堿、?；撬帷被?、脂肪酸、維生素B1、維生素B2、維生素C、微量元素等。其中，枸杞多糖被認為是枸杞子主要的功能保健因子，也是枸杞子功效研究報道中最多的一個組分。缺氧和疲勞是動物機體復(fù)雜的生理生化過程，有關(guān)枸杞子耐缺氧和抗疲勞作用的試驗早有報道；也有試驗證明枸杞子活性成分能夠抗腫瘤、抗脂質(zhì)過氧化，以及作為免疫調(diào)節(jié)劑被使用等。據(jù)最新出版的中國食物成分表記載，鮮枸杞中胡蘿卜素含量顯著高于水果蔬菜，還含有維生素E、維生素D、磷脂及微量元素硒等成分。目前市場上，枸杞子通常以干燥顆粒為主要產(chǎn)品類型。通常采用的干燥技術(shù)主要為自然風干或者高溫干燥，極其容易損失活性成分，對枸杞子最大功效的發(fā)揮極為不利，尤其對于產(chǎn)量有限的中寧枸杞更是巨大浪費。人參(PanaxginsengC.A.Mey)為五加科人參屬草本植物，多于秋季采挖。被譽為“百草之王”，是聞名世界的珍貴保健品。鮮人參主根高30-60厘米，肥厚，肉質(zhì)，黃白色，主要成分有多種人參皂苷，人參多糖，揮發(fā)油，多種氨基酸，肽類及多種維生素等。大量研究表明，人參的主要藥用活性成分人參皂苷，具有抗腫瘤，抗疲勞，抗衰老，抗休克，抗病毒和抗炎癥，抗感染，抗組織損傷，抗神經(jīng)細胞凋亡，治療老年癡呆，改善心臟等功效。目前，常規(guī)的加工方法是將人參直接干燥處理，后再根據(jù)需要碾細制散劑。這些方法工藝簡單、易于操作，但不溫和，容易造成有效物質(zhì)的流失，且一些有害物質(zhì)如農(nóng)殘和重金屬等有害物質(zhì)也易殘留，對人體有著潛在的危害，生產(chǎn)周期也較長。人參作為一種名貴中藥材，能最大限度地發(fā)揮藥效是所有研究者、商家和消費者的理想。據(jù)相關(guān)報道，新鮮人參與干燥人參成品的化學(xué)活性成分存在著很大差別，而且生物活性也極大不同。相比較而言，鮮人參的綜合藥效更顯著。以鮮藥材為原料的人參、枸杞子組方未見報道。本發(fā)明依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，選用道地藥材，以整體鮮藥材入藥保留全部有效成分，保持各有效成分間的天然配比關(guān)系。并且在中國藥典中，枸杞歸肝經(jīng)腎經(jīng)，人參歸脾經(jīng)、肺經(jīng)、心經(jīng)、腎經(jīng)。鮮人參與鮮枸杞組方直接作用到人體的心肝脾肺腎，能歸五經(jīng)，入五臟，整體提高心肝脾肺腎的功能強度。因此，有必要開發(fā)一種具有針對性的人參枸杞子組合物制備方法，既保留所有活性物質(zhì)，又能減少有害物質(zhì)的殘留，提高質(zhì)量和效率。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種人參枸杞子組合物(簡稱“參杞組合物”)的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，該方法以鮮枸杞子和鮮人參為基本原料，通過加入Vc、Vc鈉、Vc磷酸酯、茶多酚作為護色劑和生物活性穩(wěn)定劑，經(jīng)過半纖維素酶、淀粉酶和果膠酶的復(fù)合酶酶解，結(jié)合超微低溫破碎技術(shù)和酶解工藝，最終能夠完整保留枸杞鮮果和鮮人參的營養(yǎng)成分，進而優(yōu)化參杞組合物的抗疲勞、抗缺氧、抗腫瘤以及提高免疫力的功效。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：本發(fā)明的一種人參枸杞子組合物的制備方法，以鮮枸杞子和鮮人參為原料，所述方法包括以下步驟：(1)清洗：將新鮮的人參根洗凈瀝干后切碎，鮮枸杞子洗凈瀝干后切碎；(2)加入護色劑和生物活性穩(wěn)定劑：向切碎的鮮人參、鮮枸杞子顆粒中加入由Vc、Vc鈉、Vc磷酸酯、茶多酚所組成的復(fù)合護色劑和生物活性穩(wěn)定劑；(3)粗破碎：將步驟(2)得到的含有護色劑和生物活性穩(wěn)定劑的顆粒用粗破碎機作粗破碎處理，備用；(4)酶解：按照料液比1：8-12的比例向步驟(3)得到的混合粗顆粒中加入純水，然后加入所述混合粗顆粒重量0.1-5％的復(fù)合酶進行酶解，所述復(fù)合酶由半纖維素酶、淀粉酶和果膠酶組成；(5)超微低溫破碎：將步驟(4)酶解后的漿劑置于超微破碎儀中進行超微低溫破碎，制得粒度100-300目的漿料，備用。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(1)中所述的鮮人參、鮮枸杞子的重量比1～100：1～100，優(yōu)選的，鮮人參和鮮枸杞子的重量比為1：1.5。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(2)中所述的復(fù)合護色劑或生物活性穩(wěn)定劑由Vc、Vc鈉、Vc磷酸酯、茶多酚按照重量比為1～10：1～10：1～10：1～10組成，更優(yōu)選的，Vc、Vc鈉、Vc磷酸酯、茶多酚的重量比為3：2：2：3。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(4)中所述的酶解按照以下方法進行：按照料液比1:10的比例向步驟(3)得到的混合粗顆粒中加入純水，然后加入所述混合粗顆粒重量3.5％的復(fù)合酶，調(diào)節(jié)pH為4.2～5.6，于35～60℃水浴中酶解2.5～4.5h。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(4)中所述的復(fù)合酶由半纖維素酶、淀粉酶和果膠酶按照重量比為1～10：1～10：1～10組成，更優(yōu)選的，半纖維素酶、淀粉酶和果膠酶的重量比為3.5：2：3。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(5)中超微所述的超微低溫破碎是由將步驟(4)酶解后的漿料置于超微破碎儀中，在電壓為380V，輸出頻率16-50Hz，功率23.5-32kW，電機轉(zhuǎn)速3000-9000rpm，溫度為5～-20℃條件下，制得100-300目的漿料。在本發(fā)明中，更優(yōu)選的，電壓為380V，輸出頻率為50Hz，功率為25kW，電機轉(zhuǎn)速為9000rpm，溫度為-5℃。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，還包括向得到的漿料中添加低聚果糖和Vc制成直接口服原液，或根據(jù)用藥或口感需要，制成果汁、果醬、果凍、丸劑、片劑、膠囊劑或顆粒劑。進一步的，本發(fā)明還提出了按照本發(fā)明所述的制備方法制備得到的人參枸杞子組合物。為了說明本發(fā)明的鮮參杞組合物在抗缺氧、抗疲勞、抗腫瘤或提高免疫力等方面的藥效。本發(fā)明通過動物整體藥效學(xué)實驗進行了驗證研究。負重游泳試驗表明，采用本發(fā)明方法制備得到的參杞組合物的高劑量組與對照組相比能顯著延長小鼠負重游泳時間，游泳運動后小鼠血乳酸濃度消除幅度高于對照組，降低運動后血清尿素氮濃度，肝糖原含量顯著升高。調(diào)節(jié)免疫實驗提示，高劑量組的溶血空斑數(shù)明顯增多；高劑量組耳廓腫脹度、半數(shù)溶血值和中、高劑量組淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗吸光度差值顯著增加；高劑量組的單核-巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)顯著增加，校正碳廓清指數(shù)呈現(xiàn)極其顯著增高趨勢，NK細胞活性顯著增加。說明本發(fā)明的鮮人參和鮮枸杞子組合物對小鼠具有抗疲勞，提高運動耐力和增強免疫力的作用?？谷毖踉囼灡砻?，本發(fā)明的參杞組合物可以延長小鼠密閉缺氧存活時間，并對血紅蛋白(Hb)、丙二醛(MDA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性產(chǎn)生積極影響。說明本發(fā)明的參杞組合物具有耐缺氧功效，能夠進一步應(yīng)用于具有人體耐缺氧功能的食品、保健品和藥物中。本發(fā)明用小鼠S180實體瘤模型觀察研究本發(fā)明組合物的體內(nèi)抑瘤作用，并進行了免疫學(xué)指標測定。結(jié)果表明，本發(fā)明組合物活性成分可顯著提高荷瘤鼠胸腺指數(shù)、巨噬細胞吞噬功能、脾細胞抗體形成、淋巴細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)和細胞毒性T淋巴細胞殺傷功能水平，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴效應(yīng)，高劑量組能顯著抑制移植性腫瘤S180的生長。在體液免疫和細胞免疫水平上均呈現(xiàn)出積極作用，而提高荷瘤鼠免疫功能是抑制腫瘤效應(yīng)的機制之一。因此，可判定為本發(fā)明組合物對抗腫瘤有一定功效。因此，在上述研究的基礎(chǔ)上，更進一步的，本發(fā)明還提出了所述的人參枸杞子組合物在制備抗缺氧、抗疲勞、抗腫瘤或提高免疫力藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：1、本發(fā)明以鮮藥材為原料，縮短了傳統(tǒng)藥材飲片的工藝周期，減少了更多活性成分的轉(zhuǎn)化，同時截留更多活性成分。實驗證明鮮藥材從離開母體開始，伴隨生理變化，體內(nèi)成分即發(fā)生分解、轉(zhuǎn)化等一系列生物化學(xué)反應(yīng)，所以藥材離開母體時間越短，效果越好。最大限度保留并保護了鮮枸杞子和鮮人參的天然活性成分的天然比例和空間結(jié)構(gòu)，更能體現(xiàn)枸杞子與人參組合物的藥效。而且口感鮮美，物料顏色鮮艷，避免了傳統(tǒng)中藥色澤深、特征藥味難聞、口味苦澀的缺點。2、本發(fā)明加入強效抗氧化劑Vc、Vc鈉、Vc磷酸酯以及茶多酚在組合物里，有效的保護了在加工和儲運過程中，枸杞子及人參的各種天然成分的空間結(jié)構(gòu)、配比和穩(wěn)定性。3、半纖維素、纖維素、淀粉及果膠是枸杞子和人參體內(nèi)主要的高分子，也是生物活性小分子形成的底物，通過高選擇性的半纖維素酶、淀粉酶和果膠酶酶解這些大分子底物，能夠有效游離活性小分子，提高活性小分子的利用度，進而提高整體藥效。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1鮮參杞組合物的制備(1)清洗：將新鮮的人參根、枸杞子，洗凈瀝干后切碎，鮮人參和鮮枸杞子的重量比為1：1.5；(2)加入護色劑和生物活性穩(wěn)定劑：向切碎的鮮人參、枸杞子顆粒中加入由Vc、Vc鈉、Vc磷酸酯、茶多酚按照重量比為3：2：2：3所組成的復(fù)合護色劑及生物活性穩(wěn)定劑；(3)粗破碎：將步驟(2)得到的含有護色劑及生物活性穩(wěn)定劑的顆粒用粗破碎機作粗破碎處理，備用；(4)酶解：按照料液比1:10的比例向步驟(3)得到的混合粗顆粒中加入純水，然后加入所述混合粗顆粒重量3.5％的復(fù)合酶，調(diào)節(jié)pH為4.5，于45℃水浴中酶解3.5h；所述復(fù)合酶由半纖維素酶、淀粉酶和果膠酶按照重量比為3.5：2：3組成；(5)超微低溫破碎：將步驟(4)酶解后的漿劑置于超微破碎儀中進行超微低溫破碎，微波破碎儀的電壓為380V，輸出頻率為50Hz，功率為25kw，電機轉(zhuǎn)速為9000rpm，溫度為-5℃，制得粒度為300目的漿料，即得鮮參杞組合物漿劑。還可將得到的鮮參杞組合物漿劑根據(jù)用藥或口感需要，制成果汁、果醬、果凍、丸劑、片劑、膠囊劑或顆粒劑。實施例2鮮參杞組合物的制備(1)清洗：將新鮮的人參根、枸杞子，洗凈瀝干后切碎，鮮人參和鮮枸杞子的重量比為1：1.0；(2)加入護色劑和生物活性穩(wěn)定劑：向切碎的鮮人參、枸杞子顆粒中加入由Vc、Vc鈉、Vc磷酸酯、茶多酚按照重量比為5：4：5：3所組成的復(fù)合護色劑及生物活性穩(wěn)定劑；(3)粗破碎：將步驟(2)得到的含有護色劑及生物活性穩(wěn)定劑的顆粒用粗破碎機作粗破碎處理，備用；(4)酶解：按照料液比1:8的比例向步驟(3)得到的混合粗顆粒中加入純水，然后加入所述混合粗顆粒重量2％的復(fù)合酶，調(diào)節(jié)pH為5，于40℃水浴中酶解3h；所述復(fù)合酶由半纖維素酶、淀粉酶和果膠酶按照重量比為1：1：1組成；(5)超微低溫破碎：將步驟(4)酶解后的漿劑置于超微破碎儀中進行超微低溫破碎，微波破碎儀的電壓為380V，輸出頻率為33Hz，功率為24.5kw，電機轉(zhuǎn)速為6000rpm，溫度為5℃，制得180目的漿料，即得鮮參杞組合物漿劑。還可將得到的鮮參杞組合物漿劑根據(jù)用藥或口感需要，制成果汁、果醬、果凍、丸劑、片劑、膠囊劑或顆粒劑。實施例3鮮參杞組合物的制備(1)清洗：將新鮮的人參根、枸杞子，洗凈瀝干后切碎，鮮人參和鮮枸杞子的重量比為1：2.0；(2)加入護色劑和生物活性穩(wěn)定劑：向切碎的鮮人參、枸杞子顆粒中加入由Vc、Vc鈉、Vc磷酸酯、茶多酚按照重量比為1：1：1：1所組成的復(fù)合護色劑及生物活性穩(wěn)定劑；(3)粗破碎：將步驟(2)得到的含有護色劑及生物活性穩(wěn)定劑的顆粒用粗破碎機作粗破碎處理，備用；(4)酶解：按照料液比1:12的比例向步驟(3)得到的混合粗顆粒中加入純水，然后加入所述混合粗顆粒重量2％的復(fù)合酶，調(diào)節(jié)pH為5.5，于50℃水浴中酶解2.5h；所述復(fù)合酶由半纖維素酶、淀粉酶和果膠酶按照重量比為2：1：1組成；(5)超微低溫破碎：將步驟(4)酶解后的漿劑置于超微破碎儀中進行超微低溫破碎，微波破碎儀的電壓為380V，輸出頻率為16Hz，功率為23Kw，電機轉(zhuǎn)速為3000rpm，溫度為-12℃，制得100目的漿料，即得鮮參杞組合物漿劑。還可將得到的鮮參杞組合物漿劑根據(jù)用藥或口感需要，制成果汁、果醬、果凍、丸劑、片劑、膠囊劑或顆粒劑。實驗例1鮮參杞組合物的抗疲勞實驗及對免疫功能的影響1、實驗分組參杞組合物I組：采用傳統(tǒng)方法制備的人參枸杞子干燥粉劑。制備方法：干人參，產(chǎn)于東北長白山；干枸杞，由寧夏早康枸杞股份有限公司提供。按傳統(tǒng)方法加工制備并分為0.25g/kg(組合物/小鼠體重)和0.50g/kg(組合物/小鼠體重)2個劑量組，即低、高實驗劑量組。參杞組合物II組：采用本發(fā)明實施例1方法制備的參杞組合物漿劑。制備方法：新鮮人參，產(chǎn)于東北長白山；新鮮枸杞，由寧夏早康枸杞股份有限公司提供。按本發(fā)明實施例1方法加工制備并分為0.25g/kg(組合物/小鼠體重)和0.50g/kg(組合物/小鼠體重)2個漿劑劑量組，即低、高實驗劑量組。對照組：按等量生理鹽水灌胃。2、實驗器材游泳箱，鐵球，ACE全自動生化分析儀，721分光光度計，恒溫培養(yǎng)箱，ELX800酶標儀、離心機，CO2培養(yǎng)箱。血清尿素氮、血乳酸、肝糖原、SOD試劑盒購于南京建成生物工程研究所。都氏試劑(碳酸氫鈉1.0g、氰化鉀0.05g、高鐵氰化鉀0.2g、蒸餾水1000m1)、補體(新鮮豚鼠血清)、RPMI1640培養(yǎng)液自制、鹽酸、異丙醇、MTT、Hank’s液(pH7.2-7.4)、綿羊紅細胞(SRBC)、雞紅細胞(CRBC)、SA緩沖液、瓊脂糖、印度墨汁、0.1％Na2CO3；刀豆蛋白A(ConA)；小牛血清。3、實驗方法3.1抗疲勞作用3.1.1抗疲勞游泳：采用負重游泳試驗，取昆明種小鼠100只，隨機分為5組，每組20只，按分組劑量連續(xù)喂養(yǎng)28d，每日1次，于末次灌胃后30min，將小鼠放人25cm深的水中游泳，水溫保持在25℃，鼠尾根部負荷6％體重鐵球，立即開始計時，記錄小鼠從游泳開始到呼吸衰竭的時間。3.1.2肝糖元測定：取昆明種小鼠100只，隨機分為5組，每組20只，按劑量設(shè)計連續(xù)喂養(yǎng)28天，于末次灌胃后30min，將小鼠放入25-28℃水中游泳90min取出，立刻取鼠肝臟，離心勻漿后測肝糖元。3.1.3血乳酸測定：取昆明種小鼠100只，隨機分為5組，每組20只，按劑量設(shè)計連續(xù)喂養(yǎng)28天。在末次給樣后30min后，負重2％體重，在溫度25-28℃水中游泳60min取出，安靜30分鐘后，再測血乳酸。3.1.4尿素氮測定：取昆明種小鼠100只，隨機分為5組，每組20只，按劑量設(shè)計連續(xù)喂養(yǎng)28天，于末次灌胃后30min，將小鼠放入25-28℃水中游泳90min取出，采血、離心，測血清測尿素氮。3.2免疫調(diào)節(jié)作用3.2.1遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)：將灌胃后36h的小鼠，腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約3cm×3cm，用DNFB溶液50μL均勻涂抹致敏。第6天后再將其涂抹于耳部并進行攻擊，使局部產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。一般在抗原攻擊后24～48h達高峰，選擇攻擊后36h時頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8mm的耳片，稱重，測定其腫脹程度。用左右耳重量差表示遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的程度。3.2.2ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗：無菌取脾，制成單細胞懸液。用Hank's液洗滌2次，然后將細胞懸浮于2mL的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度為3×106個/mL。將每份細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，一孔加50μLConA(相當于5μg/mL)，另一孔不加ConA作為對照組，置5％CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不加小牛血清的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液，同時加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL鹽酸異丙醇，吹打均勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每組分裝3孔作為平行樣，用酶標儀，在波長570nm下讀取OD值，作統(tǒng)計處理。3.2.3血清溶血素試驗：于灌胃給藥后第2天，每鼠每天腹腔注射20％壓積綿羊紅細胞(SRBC)生理鹽水細胞混懸液0.2ml，連續(xù)給藥5天，于最后一次給藥后1h，從小鼠眼眶靜脈叢取血，離心分離血清，取血清用生理鹽水稀釋500倍，取稀釋血清1ml置試管中，加5％SRBC混懸液0.5ml，置冰浴，再加入以生理鹽水1：10稀釋的豚鼠血清1ml混合，另設(shè)不加血清的空白對照。移置37℃恒溫水浴保溫30min后，立即移入冰浴終止反應(yīng)。用1500r/min離心5min，取上清1ml，加都氏試劑3m1，混勻放置10分鐘，取上清液用96孔板于540nm處比色，測吸光度值(OD)。另取5％SRBC混懸液0.25ml加都氏試劑4ml，同上測定OD值，作為半數(shù)溶血值。血清溶血素含量以半數(shù)溶血值(HC50)表示。按下式計算：HC50＝樣品的OD值/SRBC半數(shù)溶血時的OD值×稀釋倍數(shù)。3.2.4抗體生成試驗：每只小鼠經(jīng)腹腔注射2％(V/V)壓積羊紅細胞(SRBC)0.2mL免疫5d后，取脾，放在Hank’s液中撕碎制成細胞懸液。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后，與等量雙倍濃度的Hank's液混合，分裝小試管，每管0.5mL，再向管內(nèi)加50μL10％SRBC(用SA緩沖液配制)、20μL脾細胞懸液，混勻傾倒于瓊脂糖玻片上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育1.5h，然后加用SA緩沖液稀釋過的補體，繼續(xù)溫育1.5h，計數(shù)溶血空斑數(shù)。3.2.5小鼠碳廓清試驗：小鼠尾靜脈注射稀釋后的印度墨汁5mL/kg，注入后立即開始計時，分別于2min和10min時，從眼靜脈叢中取血20μL，并將其加入0.1％Na2CO3溶液，用分光光度計在600nm波長處測光密度值。以Na2CO3溶液作空白對照，根據(jù)動物體重和脾重計算吞噬指數(shù)。3.2.6小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗：每只鼠腹腔注射20％雞紅細胞懸液1ml，30～60min后頸椎脫臼處死。腹腔注射生理鹽水2ml，間隔1min后，剖腹吸出腹腔洗液1ml，分別滴于2片載玻片上，于37℃恒溫箱內(nèi)孵育30min，后用生理鹽水漂洗、晾干，以丙酮+甲醇(1+1)固定，4％Giemsa-磷酸緩沖液染色3min，再用蒸餾水漂洗、晾干，用油鏡觀察并計數(shù)，計算出吞噬率和吞噬指數(shù)。3.2.7NK細胞活性測定：取脾臟，制成細胞懸液為效應(yīng)細胞。在96孔板上分別加入不同劑量組和對照組處理過的效應(yīng)細胞100μL(20μL藥+80μL細胞)，再加入100μL靶細胞懸液(E/T＝50/1)，并同時設(shè)靶細胞自然釋放組(100μL靶細胞+100μLRPMI-1640)和最大釋放對照組(100μL靶細胞+100μL1％NP-40)，每個樣本設(shè)4個復(fù)孔平行。置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。慢慢吸出各孔上清100μL，加入另一培養(yǎng)板中，置37℃預(yù)溫10min，每孔加入新鮮配制的底物液100μL，室溫避光反應(yīng)10～15min，每孔加入1mol/L檸檬酸終止液30μL，終止反應(yīng)，用酶標儀于570nm波長處測定OD值。NK細胞活性(％)＝(試驗組OD值-自然釋放組OD值)/(最大釋放組OD值-自然釋放組OD值)×100％。3.3統(tǒng)計方法：運用SPSS22.0的t檢驗統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。4、實驗結(jié)果4.1參杞組合物的抗疲勞試驗參杞組合物的抗疲勞試驗結(jié)果如表1所示：表1參杞組合物的抗疲勞試驗數(shù)據(jù)注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。從表1可以看出，與對照組相比，參杞組合物I、II各劑量組均能不同程度的提高肝糖原含量和延長游泳時間，也能降低血尿素氮和血乳酸水平，說明兩種組合物都有一定的抗疲勞作用。與參杞組合物I低劑量組相比，參杞組合物II低劑量組的肝糖原含量更高、游泳時間更長，血尿素氮和血乳酸水平更低；與參杞組合物I高劑量組相比，參杞組合物II高劑量組的肝糖原含量顯著升高、游泳時間顯著延長，血尿素氮和血乳酸水平顯著降低。灌服參杞組合物II各劑量組合物后，小鼠的血乳酸消除幅度明顯加快，運動后血清尿素氮含量顯著降低。其中，相較低劑量組，高劑量組有極其顯著的療效。說明參杞組合物II高劑量組能極其顯著提高運動耐力。4.2調(diào)節(jié)免疫實驗參杞組合物的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗、溶血空斑和血清溶血素試驗結(jié)果如表2所示，碳廓清、巨噬細胞吞噬指數(shù)和NK細胞活性測定結(jié)果如表3所示：表2遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗和溶血空斑試驗注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。表2結(jié)果表明，參杞組合物I、II高劑量組與對照組相比，高劑量組溶血空斑數(shù)和半數(shù)溶血值顯著增加，具有顯著的體液免疫功能。在細胞免疫功能上，各組小鼠耳廓腫脹度隨劑量而逐漸增加，高劑量組腫脹度與對照組相比差異有極其顯著性。參杞組合物II高劑量組加與不加ConA的吸光度差值差異有顯著性。說明參杞組合物II高劑量組能產(chǎn)生更強的免疫應(yīng)答反應(yīng)。表3碳廓清、巨噬細胞吞噬指數(shù)和NK細胞活性測定注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。如上表3所示，對照組的巨噬細胞只有少量被吞噬的雞紅細胞，與對照組相比，參杞組合物I、II各劑量組的參杞漿劑均能使吞噬率和吞噬指數(shù)增加，表明巨噬細胞數(shù)量有明顯增加，吞噬雞紅細胞的能力得到顯著增強。巨噬細胞功能方面，巨噬細胞吞噬指數(shù)均隨劑量增加而增加，且高劑量組吞噬指數(shù)增加亦有顯著差異。與對照組相比，各劑量組的校正碳廓清指數(shù)明顯升高，高劑量組具有極其顯著的升高，說明高劑量組相較于低劑量組具有非常明顯的吞噬作用。校正碳廓清指數(shù)隨著劑量增加不斷升高，說明更多的碳粒經(jīng)血液帶到肝、脾等部位后，被相應(yīng)部位的巨噬細胞吞噬消除。與參杞組合物I各劑量組相比，參杞組合物II各劑量組的校正碳廓清指數(shù)、吞噬率、吞噬指數(shù)和NK細胞活性更高；且各劑量組的作用與劑量成正比。綜上，說明參杞組合物II各劑量組均能明顯提高抗疲勞功效，而高劑量組具有更顯著的抗疲勞作用。而《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003版)規(guī)定：在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能、NK細胞活性四個方面任兩個指標顯示陽性，可判定該受試樣品具有增強免疫力功能作用。故可判定為本發(fā)明參杞組合物II具有明顯的增強免疫力功能作用。實驗例2參杞組合物的抗缺氧實驗1實驗分組同實驗例1。2實驗器材同實驗例1。3實驗方法將體重為20±2.3g的兩月齡昆明種小鼠飼養(yǎng)3天后，依體重隨機分為對照組和參杞組合物I、II組的高、低劑量組(分組同實驗例1)，每組10只。正常進食飲水，各劑量組按不同劑量每天分別灌胃參杞組合物，對照組給予等量的生理鹽水，14天后，全部小鼠按下述指標進行檢測。密閉缺氧試驗：于末次灌胃1h后，將小鼠裝入250ml的透明廣口瓶中，并放入10g鈉石灰以吸收CO2。密閉，觀察并記錄存活時間。當小鼠停止呼吸后，立即取出，迅速斷頭取血，取心、肝，勻漿后，備用。存活時間判定：自放人密閉瓶后開始計時，以呼吸停止為死亡指標。血紅蛋白含量：高鐵氰化法測定。在測定管中準確加入HiCN稀釋試劑5.0mL，吸取20μL全血，沖洗3次，混勻。放置3min后，用分光光度計于540nm測定吸光度值(OD540nm)。血紅蛋白(g/L)＝測定管OD540nm×367.6。MDA含量：TBA法。稱取心、肝勻漿各1g，加入2ml0.6％磷酸鹽緩沖液，混勻后，沸水浴15min，取出冷卻，在10000r/min離心10min，分離出上清，用分光光度計分別于450nm(OD450nm)、532nm(OD532nm)和600nm(OD600nm)處測定吸光度值。C(μmol/L)＝6.45×(OD532nm-OD600nm)-0.56×OD450nm。GPT活性：金氏法(King法)。取兩管，分別為測定管和空白管。測定管中加入0.5mLGPT底物液和0.1mL血清，混勻，置于37℃水浴中60min；再加2,4-二硝基苯肼溶液0.5mL，混勻后于37℃水浴中20min，最后加入0.4mol/LNaOH5.0mL混勻，放置10min后，在520nm波長處進行比色測定。以空白組調(diào)零，讀取測定分光光度值(OD520nm)。每生成1μM丙酮酸為一個轉(zhuǎn)氨酶活性單位。SOD活性：取勻漿200mL加酶活測定試劑，混勻后放置1min，于3500-4000r/min4℃離心15min，取上清液按照試劑盒測定吸光度值。4統(tǒng)計方法：運用SPSS22.0的t檢驗統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。5結(jié)果與分析5.1參杞組合物對密閉缺氧時間的影響參杞組合物對小鼠缺氧耐受力的影響如表4所示：表4參杞組合物對小鼠缺氧耐受力的影響劑量組小鼠數(shù)(只)存活時間(min)增加率(％)對照組1012.36±1.12-II組低1012.79±0.853.47II組高1016.82±1.23**36.08I組低1012.83±1.083.80I組高1014.48±1.31*17.15注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。表4結(jié)果表明，各劑量組均延長了小白鼠的存活時間，其中高劑量組分別延長了17.15％和36.08％。與各低劑量組和參杞組合物I高劑量組相比，參杞組合物II高各劑量組能極顯著提高小鼠缺氧耐受力。5.2對血紅蛋白含量的影響參杞組合物對血紅蛋白含量的影響如表5所示：表5對血紅蛋白含量的影響劑量組血紅蛋白(g/L)抑制率(％)對照組258.49±12.67-II組低236.34±14.89*8.57II組高196.52±15.38**23.97I組低252.63±14.252.27I組高214.47±13.15**17.03注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。表5比較了各劑量組中小鼠血紅蛋白濃度的變化。結(jié)果顯示不同劑量組參杞組合物可以不同程度地緩解缺氧對機體的損害，參杞組合物II高各劑量組能極顯著降低抗缺氧處理后小鼠的血紅蛋白含量，這對于研究高原耐缺氧功能新食品有一定意義。5.3對MDA含量和酶活性的影響參杞組合物對MDA含量和酶活性的影響如表6所示：表6對MDA含量和酶活性的影響注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。從表6結(jié)果可以看出，與對照組相比，各劑量組小鼠的心、肝MDA含量顯著升高，與低劑量組相比，高劑量組的MDA含量增長更顯著；其中，參杞組合物II高劑量組小鼠心、肝中的MDA含量增長極其顯著(P＜0.01)。表中的GPT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)含量，隨著鮮人參枸杞子組合物劑量的增大，呈現(xiàn)出增多的趨勢，而高劑量組相較對照組，呈極其顯著變化。受試藥物能明顯增加肝臟SOD活力，降低MDA含量，提高抗氧化酶的活性，增強消除自由基的能力，使脂質(zhì)過氧化損傷降低。與參杞組合物I各劑量組相比，參杞組合物II各劑量組的功效更顯著。參杞組合物均可以延長小鼠密閉缺氧存活時間，對血紅蛋白(Hb)、丙二醛(MDA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性均有影響，為進一步研究人體耐缺氧功能保健食品、藥物提供依據(jù)。實驗例3參杞組合物活性成分的抗腫瘤實驗1、實驗材料藥物(人參、枸杞子活性成分)：枸杞子多糖、人參皂苷均由寧夏早康枸杞股份有限公司提供。動物：ICR小鼠，體重18～22g。2、實驗分組小鼠60只，隨機分為6組，即正常對照組、荷瘤模型組和參杞組合物I、II組10、20mg/kg(組合物/小鼠體重)人參皂苷、枸杞子多糖混合組。除正常對照組外，其余5組小鼠的右前腋下接種2×106個/mlS180瘤(小白鼠肉瘤)細胞液0.2ml建立荷瘤模型，接種3d后開始按上述劑量灌胃給藥，對照組小鼠灌胃等容量的生理鹽水，連續(xù)10d，間隔12小時后處死小鼠，取樣測定指標。接種3天后，荷瘤模型組皮下有可觸及到的腫塊，且逐漸的長大，肉眼觀察局部可見隆起，并且腫塊向胸廓蔓延，小鼠活躍度降低，活動減少。提示本實驗腋下荷瘤鼠模型建模成功。療效評價方法：于停藥后次日處死動物，剝?nèi)∧[瘤稱重，按下列公式計算腫瘤抑制率：腫瘤抑制率＝(荷瘤模型組平均瘤重－給藥組平均瘤重)/荷瘤模型組平均瘤重×l00％。3、實驗方法采用小鼠S180實體瘤模型觀察研究本發(fā)明組合物的體內(nèi)抑瘤作用，并進行了免疫學(xué)指標測定。研究本發(fā)明組合物的抑瘤率和對荷瘤鼠胸腺指數(shù)的影響：小鼠灌胃2周后，間隔12小時后眼眶取血處死，摘取瘤、胸腺，經(jīng)生理鹽水洗滌后用濾紙吸干稱重。巨噬細胞吞噬功能試驗：于試驗前3d，每只小鼠腹腔注射6％淀粉肉腸1ml，試驗當日，每只小鼠腹腔注射1％雞紅細胞(CRBC)1ml，30min后腹腔注射Hank’s液1ml輕揉腹邊緣部，20min后用注射器吸取腹腔液涂片，甲醇固定，吉姆薩染色，顯微鏡下計算吞噬率和吞噬指數(shù)。對荷瘤鼠脾細胞抗體形成的影響：小鼠給藥5d后腹腔注射0.2ml20％的綿羊紅細胞(SRBC)第10d后眼眶取血處死，摘除脾臟，并用PBS緩沖液制成5×106/ml的脾細胞懸液，后在試管中依次加入1ml脾細胞懸液，0.4％SRBC和1∶10的豚鼠血清各1ml，37℃水浴1h后3000r/min離心5min，取上清液于413nm處測定吸光度值。淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗：將小鼠脫臼處死后無菌取出小鼠脾臟，剪碎，過200目尼龍網(wǎng)配制成單個細胞懸液，用0.01％Tris-NH4Cl溶解紅細胞，PBS洗滌3次后配成細胞濃度為5×106/ml的懸液，每孔0.1ml加入96孔培養(yǎng)板中，再分別加入終濃度為5μg/ml刀豆蛋白A(ConA)，將培養(yǎng)板放入含有5％CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，用MTT比色分析法570nm處測定吸光值。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)殺傷活性的測定：小鼠給藥10d后，取脾臟，制備濃度為5×106/ml的效應(yīng)細胞，濃度為1×105/ml的S180細胞為靶細胞，效靶比為50∶1。放入37℃恒溫箱24h，用MTT法測定490nm處吸光值(OD490nm)，進而得到CTL效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷率。細胞殺傷率＝[1-(實驗組OD490nm-效應(yīng)細胞對照組OD490nm)/靶細胞對照組OD490nm]×100％。4、統(tǒng)計分析方法不同數(shù)據(jù)間用t檢驗作統(tǒng)計學(xué)分析，采用SPSS22.0軟件處理。5、結(jié)果參杞組合物活性成分的抗腫瘤效果及其對免疫功能影響如表7-9所示：表7人參枸杞子活性成分對S180瘤和對荷瘤鼠胸腺指數(shù)的影響(n＝10)劑量組瘤重(g)抑制率(％)胸腺指數(shù)(mg/g)荷瘤模型組2.18±0.08-1.26±0.34正常對照組--1.93±0.10II組低1.59±0.3527.061.57±0.13II組高1.02±0.09**53.21**1.88±0.16**I組低1.65±0.1924.311.31±0.19I組高1.28±0.24*41.28*1.72±0.11**注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。表7結(jié)果表明，各劑量組的人參枸杞子活性成分都能在一定程度上抑制移植性腫瘤S180的生長，各低劑量組人參枸杞子活性成分的抑瘤率分別為24.31％和27.06％，高劑量組的抑瘤率則達到了41.28％和53.21％，抑制率非常顯著?！冬F(xiàn)代腫瘤治療藥物學(xué)》中抗腫瘤中草藥有效性的標準中復(fù)方中藥的抑瘤率＞40％，本實驗中人參枸杞子活性成分I、II高劑量組都能有效抗腫瘤。荷瘤鼠的胸腺指數(shù)顯著低于正常對照組，但與荷瘤模型組相比，經(jīng)低、高劑量組人參枸杞子活性成分治療后的荷瘤鼠的胸腺指數(shù)顯著增加，人參枸杞子活性成分I、II高劑量組均能取得極其顯著的治療效果。與荷瘤模型組相比，各劑量組的瘤重均有降低，取得顯著的抑瘤效果。其中，人參枸杞子活性成分II高劑量組能極其顯著提高荷瘤鼠的胸腺指數(shù)，具有極其顯著地抗腫瘤功效。表8人參枸杞子活性成分對荷瘤鼠吞噬細胞吞噬功能的影響(n＝10)劑量組吞噬率(％)吞噬指數(shù)(mg/g)荷瘤模型組30.46±2.830.34±0.16正常對照組50.66±2.251.29±0.21II組低33.25±2.840.74±0.13II組高49.71±1.62**1.25±0.11**I組低34.51±2.650.72±0.18I組高37.96±3.26*0.87±0.19*注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。表8結(jié)果表明，荷瘤鼠腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)均顯著低于正常對照組，人參枸杞子活性成分II組10mg/kg和20mg/kg均可明顯增強荷瘤鼠巨噬細胞吞噬功能，以20mg/kg人參枸杞子活性成分效果最好，可使荷瘤鼠巨噬細胞吞噬功能恢復(fù)到接近正常小鼠水平。表9人參枸杞子活性成分對荷瘤鼠脾細胞抗體形成、淋巴細胞轉(zhuǎn)化和CTL殺傷功能的影響(n＝10)注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。從上表9中可以看出，在413nm處吸光值人參枸杞子活性成分對低、高劑量組的影響呈遞增趨勢，但人參枸杞子活性成分高劑量組高于正常對照組和荷瘤鼠模型組，與低劑量組相比，有顯著性差異。人參枸杞子活性成分能提高機體免疫力，增強小鼠細胞毒性淋巴細胞殺傷活性的作用。與低劑量組相比，高劑量組的殺傷活性明顯升高，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義。荷瘤鼠脾細胞抗體生成、淋巴細胞轉(zhuǎn)化和CTL殺傷功能均明顯低于正常對照組。經(jīng)過人參枸杞子活性成分II治療過荷瘤鼠的脾細胞抗體生成量、淋巴細胞轉(zhuǎn)化和CTL殺傷功能增加，與荷瘤模型鼠相比達到極顯著水平。當前第1頁1 2 3