本發(fā)明涉及微囊藻毒素-LR的醫(yī)藥用途，尤其是微囊藻毒素-LR在制備預防和治療肺纖維化的藥物中的應用，屬于醫(yī)藥技術領域。

背景技術：

肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是由多種原因引起的嚴重肺間質(zhì)慢性疾病。根據(jù)病因可分為繼發(fā)性肺纖維化(Secondary pulmonary fibrosis，SPF)和特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)。前者病因明確，代表性病種有塵肺、矽肺、石棉肺，及自身免疫性疾病相關的肺纖維化等；后者病因不明確，是目前臨床干預乏術的常見肺疾病。IPF作為一種慢性炎癥性間質(zhì)性肺疾病，主要表現(xiàn)為成纖維細胞灶的出現(xiàn)，大量細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積，膠原積聚，最終導致正常肺組織構型改變，肺泡結構破壞，是一種慢性、進行性、不可逆轉的肺結構改變，是一種高死亡率的臨床肺疾病[1]。流行病學研究顯示，IPF發(fā)病率呈不斷上升趨勢，由于發(fā)病機制不清，目前沒有確切有效的治療方法，臨床也缺乏特異性的治療藥物[2]，病情一般持續(xù)性進展，最終多死于呼吸衰竭[3]，因此尋找有效的干預靶點和治療藥物十分重要。

在整個IPF發(fā)生過程中，尤其是疾病早期的炎癥階段，諸多細胞因子也參與其中。從某種意義上說，肺纖維化的發(fā)生是從上皮細胞受損、炎癥細胞浸潤和細胞因子網(wǎng)絡調(diào)控失衡開始，進而成纖維細胞增殖、膠原纖維沉積。。對IPF患者肺組織研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β在肺纖維化早期主要是由肺泡巨噬細胞分泌，當出現(xiàn)成纖維細胞灶時，增生的Ⅱ型肺泡上皮細胞上調(diào)TGF-β表達。TGF-β是目前已知最強的促ECM積聚誘導因子，也是肺纖維化形成機制研究的熱點分子和治療藥物開發(fā)的一個重要干預靶點。近十年研究表明，TGF-β可以促使上皮間質(zhì)轉化(epithelial-mesenehymal transition，EMT)[4，5，6]和成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，進而導致ECM積聚。研究表明用特異TGF-β抑制劑可明顯下調(diào)肺纖維化相關指標[7]。同時TGF-β還可刺激成纖維細胞合成ECM、抑制基質(zhì)蛋白酶的酶解、抑制肌成纖維細胞凋亡，這些作用都會進一步導致肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

TNF-α是臨床檢驗肺纖維化的一個重要指標。在纖維化的肺部組織中，發(fā)現(xiàn)TNF-α大量增殖，TNF-αmRNA的水平高于正常肺組織[8]。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-1β不但直接促進纖維化的發(fā)生，而且促進纖維蛋白溶酶原抑制物Ⅰ的產(chǎn)生，抑制ECM降解。在博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中，內(nèi)源性的TNF-α過量表達能促進肺纖維化。此外，當TNF-α與膜受體結合后還可激活胞內(nèi)的NF-κB和MAPK通路，調(diào)節(jié)基因轉錄，產(chǎn)生包括TGF-β，IL-1和IL-6在內(nèi)的多種細胞因子。

一些IL能促進肺纖維化的發(fā)生，例如，IL-1和IL-6[10]。IL-1亞型IL-1β能夠引發(fā)促炎因子IL-6、TNF-α和TGF-β1的表達量迅速增加，引起嚴重的炎癥反應。肺組織結構被破壞，造成嚴重損傷，ECM不斷沉積，逐漸形成肺纖維化。Markovics發(fā)現(xiàn)IL-1β能夠通過激活TGF-β在細胞膜受體上的avβ8活性亞基，間接激活TGF-β，啟動肺纖維化[11]。

核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是一種多功能的核轉錄因子，具有廣泛的生物學活性，能促進多種細胞因子、黏附分子和趨化因子的基因轉錄。Fujimoto等[12]給肺纖維化模型大鼠胃胃飼NF-κB信號通路抑制劑SP100030。一周后，將NF-κB胃飼組與對照組比較發(fā)現(xiàn):NF-κ處理鼠的肺損傷明顯減輕，炎癥因子的分泌量也明顯減少，纖維化程度減輕。表明NF-κB通路與肺纖維化形成有關。氧化應激可誘導NF-κB活化[13]，促進TGF-β、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生，介導肺泡炎和肺纖維化形成。Francesco等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當肺組織氧化抗氧化失衡，活性氧產(chǎn)生增加，可下調(diào)谷胱甘肽和一氧化氮的表達量，造成單核細胞和表皮細胞的調(diào)節(jié)異常。IL-1、IL-6、髓過氧化物酶、雙氧化酶、過氧化物酶等細胞因子和蛋白酶大量釋放，造成嚴重肺損傷和劇烈的炎癥反應。ECM分泌增加，逐漸形成肺纖維化。

在動物模型中，肺損傷之后會發(fā)生包括新生血管形成的顯著肺血管的變化。有研究發(fā)現(xiàn)，在IPF患者中存在廣泛的血管新生。同時，在IPF患者血漿中發(fā)現(xiàn)了促血管生成因子和細胞因子的表達增加[15]。此外，F(xiàn)arkas等[16]發(fā)現(xiàn)IPF中存在微血管和大血管重塑。進一步的研究表明，IPF中的微纖維化區(qū)或正常肺組織區(qū)毛細血管密集程度增加，但在纖維化程度最嚴重的區(qū)域毛細血管密集程度卻減少，IPF中的成纖維細胞灶無血管組織，其周圍是由毛細血管分布的雜亂無章的組織所包繞[15]。

VEGF是迄今已知功能效應最強的血管生成因子之一[15,17]。VEGF能增加血管通透性，是維持血管完整性的關鍵因素。VEGF在博來霉素誘導的IPF中存在作用，纖維化肺組織中存在大量含VEGF的II型肺泡上皮細胞和肌成纖維細胞，它們中的VEGF活性增強可能會誘導巨噬細胞活化、肥大細胞遷移和聚集，從而將參與纖維化形成過程的細胞與血管新生聯(lián)系起來[15]。內(nèi)皮素1(ET-1)被認為有促成纖維細胞和肺泡上皮細胞增殖，促成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，促進膠原合成和抑制膠原降解的作用。ET-1能通過旁分泌刺激不同細胞類型誘導產(chǎn)生大量促纖維生長因子包括TNF-α、TGF-β和纖維連接蛋白。此外ET-1可以通過誘導VEGF的產(chǎn)生，以增強新生血管形成。

微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是環(huán)境水資源中藍藻水華污染產(chǎn)生的常見毒素之一，其主要是通過抑制絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶1和2A(Serine/threonine protein phosphatases 1 and 2A，PP1和PP2A)的活性而產(chǎn)生毒性。目前發(fā)現(xiàn)MCs有80多種異構體，其中微囊藻毒素-LR(MC-LR)存在面廣，且是MCs中毒性最強的一種異構體。我們早期的研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠連續(xù)12個月飲水暴露MC-LR，小鼠肺部僅出現(xiàn)炎癥反應，但沒有發(fā)生肺纖維化現(xiàn)象，說明MC-LR可能存在抗纖維化作用，但迄今為止，未見有關微囊藻毒素-LR抗肺纖維化的生物活性或臨床應用方面的研究。

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技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了微囊藻毒素-LR的醫(yī)藥新用途，即微囊藻毒素-LR用于制備預防和/或治療肺纖維化疾病的藥物的用途。

通過博來霉素誘導大鼠肺纖維化這一經(jīng)典模型，通過MC-LR干預比較及相關分子分析，創(chuàng)新性的提出MC-LR可從抑制TGF-β通路和抑制血管生成途徑，有效阻止肺纖維化進程。

基于以上研究本發(fā)明提供了MC-LR在干預、治療大鼠肺纖維化的藥物中的應用。

本發(fā)明提供了MC-LR為抑制BLM誘導的肺纖維化相關分子TGF-β、TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB、ET-1mRNA表達的藥物中的應用。

本發(fā)明提供了MC-LR可促進抗BLM誘導的肺纖維化相關分子Nrf2mRNA表達的藥物中的應用。

本發(fā)明提供了MC-LR為抑制BLM誘導的肺組織血管生成的藥物中的應用。

本發(fā)明提供了在MC異構體中尋找干預、治療大鼠肺纖維化藥物的線索。

本發(fā)明經(jīng)過驗證，微囊藻毒素-LR可以改善由博來霉素引發(fā)的肺纖維化狀態(tài)。微囊藻毒素-LR可抑制博萊霉素引發(fā)的肺纖維化相關分子TGF-β、TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB、ET-1mRNA表達的升高。微囊藻毒素-LR可抑制博萊霉素引發(fā)的肺組織VEGF mRNA表達的增高。微囊藻毒素-LR通過TGF-β/Smad通路及抑制血管生成等途徑，干預并緩解博萊霉素誘導大鼠肺纖維化。為制備預防和/或治療肺纖維化疾病的藥物提供新的途徑。

附圖說明

圖1為MC-LR對各組肺組織炎癥程度的影響(Masson染色×200)。其中A為空白組大鼠肺組織纖維化程度(Masson染色×200)結果圖；B為博來霉素誘導肺纖維化模型大鼠肺組織纖維化程度(Masson染色×200)結果圖；C為采用博來霉素誘導肺纖維化后，第7天開始給予MC-LR干預后大鼠肺組織纖維化程度(Masson染色×200)結果圖；D為采用博來霉素誘導肺纖維化后，第14天開始給予MC-LR干預后大鼠肺組織纖維化程度(Masson染色×200)結果圖；E為采用博來霉素誘導肺纖維化后，第28天開始給予MC-LR干預后大鼠肺組織纖維化程度(Masson染色×200)結果圖；F為各組大鼠肺組織纖維化程度統(tǒng)計結果。

圖2為各組大鼠肺組織中TGF-βmRNA表達情況。MC-LR各處理組均對博來霉素誘導的TGF-β上升產(chǎn)生一定的抑制作用。

圖3為各組大鼠肺組織中TNF-αmRNA表達情況。MC-LR各處理組均對博來霉素誘導的TNF-α上升產(chǎn)生明顯的抑制作用，且早期處理組抑制作用更為顯著。

圖4為各組大鼠肺組織中IL-1βmRNA表達情況。MC-LR各處理組均對博來霉素誘導的IL-1β上升產(chǎn)生明顯的抑制作用，三組處理組間無顯著差異。

圖5為各組大鼠肺組織中IL-6mRNA表達情況。MC-LR各處理組均對博來霉素誘導的IL-6上升產(chǎn)生明顯的抑制作用，且早期處理表現(xiàn)出更為顯著的抑制作用。

圖6為各組大鼠肺組織中NF-κB mRNA表達情況。MC-LR各處理組均對博來霉素誘導的NF-κB上升產(chǎn)生明顯的抑制作用，晚期處理組呈現(xiàn)明顯差異。

圖7為各組大鼠肺組織中ET-1mRNA表達情況。MC-LR各處理組均對博來霉素誘導的ET-1上升產(chǎn)生明顯的抑制作用，且處理在較后期進行反而呈現(xiàn)較為顯著的抑制作用。

圖8為各組大鼠肺組織中Nrf2mRNA表達情況。博來霉素及MC-LR各處理組均呈現(xiàn)Nrf2mRNA表達上升。

圖9為各組大鼠肺組織中VEGF mRNA表達情況。MC-LR各處理組均有效抑制由博來霉素誘導的VEGF表達上升，且較晚處理效果更佳。

具體實施方式

實施例

用博萊霉素制作的肺纖維化模型，其病理組織學和生理學改變與人類肺纖維化近似，因此已成為國際、國內(nèi)各實驗室構建肺纖維化動物模型的常用藥物。博萊霉素經(jīng)口腔氣管內(nèi)滴注給藥可誘導大鼠發(fā)生肺纖維化，對照為生理鹽水口腔氣管內(nèi)滴注給大鼠。

實驗動物：SPF級Sprague Dawley大鼠，雄性，體重150g-200g，常州卡文斯實驗動物有限公司提供，動物合格證號為：SCXK(蘇)2011-0003。

大鼠博來霉素(BLM)誘導的肺纖維化模型的建立：SD成年雄性大鼠，腹腔注射氨基甲酸乙酯(烏拉坦，200g/L)1g/kg進行麻醉，大鼠麻醉后，固定，經(jīng)口行氣管插管，注入博來霉素(5mg/kg)。然后迅速將鼠板直立，旋轉鼠板，觀察大鼠呼吸情況。將大鼠放回干燥潔凈的鼠籠休息，等待蘇醒，之后正常飼養(yǎng)。實驗室條件下飼養(yǎng)60天(即通氣良好的20℃恒溫環(huán)境中，每12小時光照與黑暗交替，水糧足量，自由取用)，60天后取大鼠肺臟組織，石蠟包埋固定，部分肺組織冷凍保存。

取6-8周成年SD大鼠30只，采用隨機分組的辦法，將小鼠隨機分為5組，分空白對照組(control)，模型組(BLM)，建模加MC-LR給藥組(BLM7+MC-LR、BLM14+MC-LR和BLM28+MC-LR)，每組各6只。按照如上所述的方法建模(對照組滴注生理鹽水)。control組、BLM組建模后自然飲水(滅菌超純水)，建模加MC-LR給藥組分別在建模后的第7天(BLM7+MC-LR)、第14天(BLM14+MC-LR)和第28天(BLM28+MC-LR)開始給予濃度20μg/L的MC-LR自然飲水。大鼠于建模后第60天麻醉后，心臟取血，處死。收集大鼠肺組織，用PBS沖洗2次，去除表面殘余的血液。左上葉肺入4％甲醛中固定，逐級酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后，常規(guī)切片，Masson染色，進行肺纖維化形態(tài)學觀察，結果如圖1。其余肺組織直接放置液氮里，用于其他測定，如mRNA測定。

所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±SD(x±s)表示。應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理，統(tǒng)計采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結果

如圖1中A空白；B博萊霉素模型；C～E不同時間MC-LR處理組；F肺纖維程度統(tǒng)計圖。病理組織切片經(jīng)Masson染色，結果表明對照組大鼠肺組織內(nèi)可見少量染成藍色的膠原纖維，是細胞外基質(zhì)的主要組成部分。模型組大鼠肺纖維化形成，Masson染色后可見多量致密被染成藍色的膠原纖維，呈束狀或片狀沉積，基本符合肺纖維化的特點，說明實驗大鼠肺纖維化模型制備成功。經(jīng)MC-LR處理后，可見大鼠肺組織成纖維細胞增生、膠原纖維沉積程度均比模型組輕。

圖2結果顯示MC-LR在20ug/L下可不同程度的降低TGF-β含量，較好地干預BLM誘導的大鼠肺纖維化發(fā)展程度。TGF-β是組織纖維化中公認的致纖維化因子，通過經(jīng)典的TGF-β1/Smads途徑參與纖維化進程。

TNF-α是一種具有廣泛生物活性的細胞因子，主要來源于活化的巨噬細胞、肥大細胞和T淋巴細胞，是致炎因子刺激下機體組織產(chǎn)生的一種重要的細胞免疫防御因子，它可促進內(nèi)皮細胞表達黏附分子，增進白細胞與之黏著，促進中性粒細胞的聚集和激活間質(zhì)組織釋放蛋白水解酶，刺激肺成纖維細胞的增生和膠原的合成。適量的TNF-α對肺泡正常結構的維持和防止肺纖維化是必要的，過量內(nèi)源性TNF-α的表達能促進肺纖維化的形成和發(fā)展。

圖3研究結果顯示，MC-LR干預各組均能有效抑制BLM誘導的TNF-α表達的上升，且建模7天即開始干預的組大鼠肺組織中TNF-α表達減少最為顯著。MC-LR各處理組均對博萊霉素誘導的TNF-α上升產(chǎn)生明顯的抑制作用，且早期處理組抑制作用更為顯著。

圖4對大鼠肺組織中IL-1βmRNA檢測顯示，MC-LR各處理組均對博來霉素誘導的IL-1β上升產(chǎn)生明顯的抑制作用，三組處理組間無顯著差異。有大量研究表明IL-1β在肺組織損傷和修復過程中起直接作用，IL-1β能夠有效的誘導TGFβ造成肺纖維化的形成。

IL-6是一種由多種細胞包括成纖維細胞產(chǎn)生的多功能細胞因子，通過自分泌或旁分泌方式作用于多種細胞包括成纖維細胞。越來越多的證據(jù)表明IL-6可能是一種促纖維化細胞因子。如圖5顯示，IL-6在MC-LR處理后可以顯著抵抗由BLM引發(fā)的IL-6表達增高，且MC-LR處理越早抑制效果越明顯。

NF-κB是一個二聚化合物的轉錄因子，存在于胞漿內(nèi)，當被激活后進入胞核，誘導基因表達，參與轉錄調(diào)控多種細胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β等)的基因表達，通過不同的機制促進肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展。如圖6顯示，MC-LR各處理組均對博來霉素誘導的NF-κB上升產(chǎn)生明顯的抑制作用，且晚期處理組差異顯著。

如圖7所示，內(nèi)皮素1(ET-1)被認為有促成纖維細胞和肺泡上皮細胞增殖，促成纖維細胞向肌纖維母細胞分化，促膠原纖維合成，并抑制膠原纖維降解的作用。在本研究中，我們觀察到肺組織中的ET1在BLM處理組顯著上升，而在MC-LR的三組中均發(fā)生不同程度的下降，具統(tǒng)計學差異。

Nrf2主要通過抗氧化反應元件調(diào)控多種抗氧化基因的表達，進而增加抗氧化物質(zhì)的生成，抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。如圖8研究結果顯示，BLM組肺組織中Nrf2mRNA發(fā)生上調(diào)，MC-LR干預后Nrf2的表達增加更為明顯。

近年來血管生成在肺纖維化發(fā)生中的作用日益受到重視，血管生成可能是肺纖維化形成過程中的一個關鍵環(huán)節(jié)。很多研究發(fā)現(xiàn)在BLM誘導的肺纖維化動物模型中，抑制促血管生成因子或給予抗血管生成因子干預、減輕血管生成可緩解肺纖維化的進展。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是目前己知的最主要的血管生成因子，能夠促進新血管的生成，增加血管通透性，并參與炎性細胞浸潤。我們的結果同樣顯示，在BLM組肺組織中VEGF過度表達，而給予MC-LR干預后能有效阻抑VEGF的表達，如圖9所示。

除上述實施外，本發(fā)明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發(fā)明要求的保護范圍。