本發(fā)明涉及治療感冒的藥物領(lǐng)域，特別地，涉及一種治療風(fēng)熱感冒的藥物組合物。此外，本發(fā)明還涉及一種包括上述治療風(fēng)熱感冒的藥物組合物的制備方法。
背景技術(shù)：
感冒是臨床公認(rèn)的發(fā)病率最高的疾病，75％的人每年至少患1次感冒，我國年均患感冒的人數(shù)高達(dá)10億，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，每年死于各種感冒的人數(shù)在200萬以上。該病起病情況較急且有較為明顯的癥狀，給患者的生活和工作帶來諸多不便。由于比較常見，所以群眾對該病治療的認(rèn)知和重視程度普遍較低，在治療上往往會比較草率，多不去正規(guī)的醫(yī)療機構(gòu)而自行選擇應(yīng)用藥物進(jìn)行治療，這也是導(dǎo)致濫用感冒藥成為造成嚴(yán)重不良反應(yīng)的重要因素，更帶來一定的社會問題。感冒用藥目前已成為otc(非處方藥)市場的第一大類藥品。有資料顯示，美國因感冒發(fā)生的直接費用為29億美元；我國主要用于感冒的醫(yī)療費用達(dá)92億元，且呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢。
中醫(yī)有著悠久的歷史，西醫(yī)傳入前在中國醫(yī)療史上一直占獨家統(tǒng)治地位，在治療感冒等最為常見的疾病積累豐富的經(jīng)驗并形成了完整的治療體系，有良好的療效及較高的安全性，更是普遍受到群眾和社會的公認(rèn)。因此治療感冒的中成藥也成為了大家數(shù)家庭中的必備藥物。基于國人在長期的生活中形成的對感冒疾病認(rèn)知的程度，讓所有患者接受正規(guī)的醫(yī)學(xué)治療顯然難于實現(xiàn)，而患者自行應(yīng)用藥物治療該藥的現(xiàn)狀更是無法改變。所以能為大眾提供療效更為確切、安全性更高的治療感冒的藥物是目前醫(yī)學(xué)界所必須面臨的挑戰(zhàn)。
目前臨床用于治療感冒的藥物主要分為兩大類，西藥類和中藥類，其藥物的研究現(xiàn)狀如下。
西藥方面，美國iafp/pen和fnp協(xié)會專家達(dá)成的關(guān)于普通感冒的共識指出，由于感冒病毒種類過多(目前已發(fā)現(xiàn)200種)、不斷變異以及無法及時診斷等，限制了抗病毒藥物的應(yīng)用，造成感冒治療缺乏針對性，治療感冒的方案以對癥為主，尚無特效感冒藥，并且感冒患者的癥狀往往不只是1～2種，因此治療感冒的藥物多采用復(fù)方制劑，以及時全面控制癥狀。市場上的西藥抗感冒類制劑成分常選用解熱鎮(zhèn)痛成分、收縮血管成分、中樞性鎮(zhèn)咳成分、抗組胺成分、中樞興奮成分、抗病毒成分及祛痰成分中一種或幾種成分組合而成。但西藥抗感冒副作用廣泛且偶發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)事件，造成患者的用藥安全性存在很大隱患。如果在不了解所含成分的情況下盲目選擇多種藥物，特別容易造成某些成分的重復(fù)使用，從而導(dǎo)致這些成分不良反應(yīng)的累加，這樣不但達(dá)不到治療目的，甚至可能由于某種成分劑量過大造成藥物中毒。所以能為大眾提供更為有效、不良反應(yīng)少、安全性高的藥物是目前臨床中首要解決的問題。
相比國外，我國運用中藥治療感冒的歷史悠久，積累了無數(shù)寶貴的經(jīng)驗，其療效好、副作用小，得到了廣大醫(yī)生和患者的認(rèn)可。辨證施治是中醫(yī)治療疾病的一大特色，根據(jù)不同的癥狀將感冒分為風(fēng)熱感冒、風(fēng)寒感冒、暑濕感冒等，感冒用藥也因不同證型而異，分別治以辛涼解表、辛溫解表、清暑解表，兼夾證則在解表的基礎(chǔ)上分別配合化痰、消導(dǎo)、鎮(zhèn)驚之法，體質(zhì)虛弱者可采用扶正解表法。
目前市售的以“風(fēng)熱襲肺”型感冒為主治證候的中成藥，相對于其發(fā)病率而言不多，說明了現(xiàn)有品種遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足目前的臨床需求。中醫(yī)傳統(tǒng)治療感冒強調(diào)疏散風(fēng)熱為主，上市藥品卻多重清熱解毒。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種治療風(fēng)熱感冒的藥物組合物，以解決現(xiàn)有的中成藥無法滿足治療風(fēng)熱感冒的技術(shù)問題。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
本發(fā)明一方面提供了一種治療風(fēng)熱感冒的藥物組合物，藥物組合物主要由以下重量份的原料藥制成：
木蝴蝶1～17份荊芥2～28份柴胡3～45份
了哥王2～25份黃芩2～37份紫珠4～45份
牛黃0.05～0.3份薄荷素油0.005～0.09份。
進(jìn)一步地，藥物組合物主要由以下重量份的原料藥制成：
木蝴蝶2～5份荊芥4～12份柴胡5～17份
了哥王3～11份黃芩7～13份紫珠8～19份
牛黃0.12～0.20份薄荷素油0.015～0.04份。
進(jìn)一步地，紫珠為廣東紫珠、裸花紫珠或大葉紫珠，牛黃為人工牛黃或天然牛黃。
本發(fā)明另一方面提供了一種治療風(fēng)熱感冒的藥物組合物的制備方法，包括以下步驟：
將木蝴蝶、紫珠和了哥王粗碎。
將荊芥和柴胡加水蒸餾提取揮發(fā)油，將揮發(fā)油與薄荷素油合并用環(huán)糊精包合成揮發(fā)油包合物。
將木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠合并水提，濃縮、干燥、粉碎、制成浸膏粉。
將浸膏粉、揮發(fā)油包合物和牛黃，混勻，制劑，得到治療風(fēng)熱感冒的藥物組合物。
進(jìn)一步地，揮發(fā)油的提取方法為:
加入荊芥和柴胡總質(zhì)量2～20倍水，加熱蒸餾提取1～15小時。
進(jìn)一步地，環(huán)糊精包合操作中，環(huán)糊精的用量為揮發(fā)油質(zhì)量的2～20倍，包合操作采用研磨法、飽和水溶液法、膠體磨法、超聲法、冷凍干燥技術(shù)、噴霧干燥技術(shù)中的一種。
環(huán)糊精為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精。
進(jìn)一步地，揮發(fā)油包合物采用膠體磨法制備，環(huán)糊精為β-環(huán)糊精，β-環(huán)糊精的用量為揮發(fā)油質(zhì)量的6～10倍，加水量為β-環(huán)糊精的質(zhì)量的8～12倍，研磨時間為10～40分鐘。
進(jìn)一步地，木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠合并加入其總質(zhì)量2～20倍的水提取1～5次，每次0.5～5小時。
干燥方法為減壓干燥或噴霧干燥、微波干燥或冷凍干燥。
進(jìn)一步地，木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠的水提次數(shù)為3次，第一次水提中加入木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠總質(zhì)量8～10倍水提取2～3小時，第二次水提和第三次水提中均加入木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠總質(zhì)量6～8倍水提取2～3小時。優(yōu)選地，第一次水提中用水為98～100℃的水。
干燥方法為60～80℃下減壓干燥。
進(jìn)一步地，將木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠合并水提操作還包括將荊芥和柴胡蒸餾后的藥渣加入木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠中合并水提。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明的藥物組合物包括木蝴蝶、荊芥、柴胡、了哥王、黃芩、紫珠、牛黃和薄荷素油。
木蝴蝶味微苦，甘，涼。入肺、胃、肝經(jīng)。功能清肺熱，利咽喉，祛痰咳。因其質(zhì)輕揚而走上，為我國南方及東南亞一帶治療溫邪侵襲肺衛(wèi)所致咽喉灼熱腫痛、咳嗽聲嘶等癥習(xí)用之藥，故用之為君藥。
荊芥味辛微苦，性微溫。以其辛開溫散，能疏達(dá)表衛(wèi)腠理，祛風(fēng)熱于表；微苦又能上清頭目諸風(fēng)，止頭痛，明目，解肺、肝、咽喉熱痛，消腫，除諸毒，發(fā)散瘡癰(《滇南本草》)?！侗静菥V目》謂其能散風(fēng)熱，清頭目，利咽喉。黃芩，味苦性寒，入肺、胃經(jīng)。其性清肅，所以除邪；味苦所以燥濕；陰寒所以勝熱，故主諸熱(《本草經(jīng)疏》)，為中醫(yī)清上焦肺熱常用之品，且有無黃芩不能涼肌達(dá)表之說。二者相須為用，能增強君藥解表清熱之功，故共為臣藥。
柴胡味苦辛，性微寒。歸肝，膽經(jīng)。功能解表退熱，疏肝解郁，升舉陽氣。為傷寒發(fā)汗解表要藥(《滇南本草》)，又是引清氣退熱必用之藥(《綱目》)。《本草匯言》亦言：清肌退熱，柴胡最佳。了哥王味苦辛，性寒有毒，能消熱解毒，化痰散結(jié)，消腫止痛；紫珠苦澀，涼。功擅清熱、解毒。能治一切咽喉痛(《閩南民間草藥》)，惡寒發(fā)熱(《閩東本草》)；牛黃味苦甘性涼，清心涼肝，豁痰開竅，清熱解毒。四藥佐助君臣藥迅速緩解發(fā)熱及肺系咽喉灼熱腫痛、咳嗽痰黃、聲嘶等癥。故共用為佐藥。
薄荷素油系從薄荷新鮮莖和葉提取的揮發(fā)油，氣味芳香，有調(diào)味藥及驅(qū)風(fēng)之功。一方面佐助君臣藥解表散風(fēng)、利咽止痛，又“性銳而輕清，善行頭面”(《藥品化義》)，為“風(fēng)熱家引經(jīng)要藥”(《本草經(jīng)疏》)，能引諸藥入肺衛(wèi)，為佐使藥。
本發(fā)明的藥物組合物符合傳統(tǒng)中醫(yī)理論君臣佐使的理論，配伍精當(dāng)，配合使用具有協(xié)同增效作用。一是用藥之清揚而善走上達(dá)表之品，符合“治上焦如羽，非輕不舉”的上焦溫病治療之古訓(xùn)；二是疏清并重，衛(wèi)氣兼顧，既疏達(dá)表衛(wèi)以祛風(fēng)熱之外出，并以清肺以期截斷溫邪之內(nèi)傳。本發(fā)明的藥物組合物具有清熱疏風(fēng)、解毒利咽、止咳化痰的作用，對上呼吸道感染常見癥狀尤其是發(fā)熱、咽痛、咳嗽等，見效快、療效好，服用方便，無毒副作用。
除了上面所描述的目的、特征和優(yōu)點之外，本發(fā)明還有其它的目的、特征和優(yōu)點。
具體實施方式
以下對本發(fā)明的實施例進(jìn)行詳細(xì)說明，但是本發(fā)明可以由權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同方式實施。
本發(fā)明一方面提供了一種治療風(fēng)熱感冒的藥物組合物，藥物組合物主要由以下重量份的原料藥制成：
木蝴蝶1～17份荊芥2～28份柴胡3～45份
了哥王2～25份黃芩2～37份紫珠4～45份
牛黃0.05～0.3份薄荷素油0.005～0.09份。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明的藥物組合物包括木蝴蝶、荊芥、柴胡、了哥王、黃芩、紫珠、牛黃和薄荷素油。
木蝴蝶味微苦，甘，涼。入肺、胃、肝經(jīng)。功能清肺熱，利咽喉，祛痰咳。因其質(zhì)輕揚而走上，為我國南方及東南亞一帶治療溫邪侵襲肺衛(wèi)所致咽喉灼熱腫痛、咳嗽聲嘶等癥習(xí)用之藥，故用之為君藥。
荊芥味辛微苦，性微溫。以其辛開溫散，能疏達(dá)表衛(wèi)腠理，祛風(fēng)熱于表；微苦又能上清頭目諸風(fēng)，止頭痛，明目，解肺、肝、咽喉熱痛，消腫，除諸毒，發(fā)散瘡癰(《滇南本草》)?！侗静菥V目》謂其能散風(fēng)熱，清頭目，利咽喉。黃芩，味苦性寒，入肺、胃經(jīng)。其性清肅，所以除邪；味苦所以燥濕；陰寒所以勝熱，故主諸熱(《本草經(jīng)疏》)，為中醫(yī)清上焦肺熱常用之品，且有無黃芩不能涼肌達(dá)表之說。二者相須為用，能增強君藥解表清熱之功，故共為臣藥。
柴胡味苦辛，性微寒。歸肝，膽經(jīng)。功能解表退熱，疏肝解郁，升舉陽氣。為傷寒發(fā)汗解表要藥(《滇南本草》)，又是引清氣退熱必用之藥(《綱目》)?！侗静輩R言》亦言：清肌退熱，柴胡最佳。了哥王味苦辛，性寒有毒，能消熱解毒，化痰散結(jié)，消腫止痛；紫珠苦澀，涼。功擅清熱、解毒，能治一切咽喉痛(《閩南民間草藥》)，惡寒發(fā)熱(《閩東本草》)；牛黃味苦甘性涼，清心涼肝，豁痰開竅，清熱解毒。牛黃可以為天然牛黃或人工牛黃。四藥佐助君臣藥迅速緩解發(fā)熱及肺系咽喉灼熱腫痛、咳嗽痰黃、聲嘶等癥。故共用為佐藥。
薄荷素油系從薄荷新鮮莖和葉提取的揮發(fā)油，氣味芳香，有調(diào)味藥及驅(qū)風(fēng)之功。一方面佐助君臣藥解表散風(fēng)、利咽止痛，又“性銳而輕清，善行頭面”(《藥品化義》)，為“風(fēng)熱家引經(jīng)要藥”(《本草經(jīng)疏》)，能引諸藥入肺衛(wèi)，為佐使藥。
上述治療風(fēng)熱感冒的藥物組合物，可以為湯劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑或丸劑等其它劑型。
本發(fā)明的藥物組合物符合傳統(tǒng)中醫(yī)理論君臣佐使的理論，配伍精當(dāng)，配合使用具有協(xié)同增效作用。一是用藥之清揚而善走上達(dá)表之品，符合“治上焦如羽，非輕不舉”的上焦溫病治療之古訓(xùn)；二是疏清并重，衛(wèi)氣兼顧，既疏達(dá)表衛(wèi)以祛風(fēng)熱之外出，并以清肺以期截斷溫邪之內(nèi)傳。本發(fā)明的藥物組合物具有清熱疏風(fēng)、解毒利咽、止咳化痰的作用，對上呼吸道感染常見癥狀尤其是發(fā)熱、咽痛、咳嗽等，見效快、療效好，服用方便，無毒副作用。
進(jìn)一步地，藥物組合物主要由以下重量份的原料藥制成：
木蝴蝶2～5份荊芥4～12份柴胡5～17份
了哥王3～11份黃芩7～13份紫珠8～19份
牛黃0.12～0.20份薄荷素油0.015～0.04份。
該配比的藥物組合物配比更為合理，藥效更好。
進(jìn)一步地，紫珠為紫珠屬的藥物，其中廣東紫珠、裸花紫珠或大葉紫珠較為常用。牛黃為人工牛黃或天然牛黃。人工牛黃相比天然牛黃的價格較為便宜，同時具備天然牛黃的藥效，因此可選人工牛黃。
本發(fā)明另一方面提供了一種治療風(fēng)熱感冒的藥物組合物的制備方法，包括以下步驟：
將木蝴蝶、紫珠和了哥王粗碎。
將荊芥和柴胡加水蒸餾提取揮發(fā)油，將揮發(fā)油與薄荷素油合并用環(huán)糊精包合成揮發(fā)油包合物。
將木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠合并水提，濃縮、干燥、粉碎、制成浸膏粉。
將浸膏粉、揮發(fā)油包合物和牛黃，混勻，制劑，得到治療風(fēng)熱感冒的藥物組合物。
藥材木蝴蝶需粗碎，黃芩無需粗碎，可提高有效成分的轉(zhuǎn)移率。本發(fā)明的制備方法中將處方中的揮發(fā)油粉末化，提高了制劑中揮發(fā)油的穩(wěn)定性。揮發(fā)油本身不穩(wěn)定，易揮發(fā)，傳統(tǒng)的制劑工藝多采用噴淋加入法，不能保證揮發(fā)油在制劑的穩(wěn)定性，本發(fā)明中將其用環(huán)糊精包合，使其粉末化，大大提高了揮發(fā)油的穩(wěn)定性和利用率。
治療風(fēng)熱感冒的藥物組合物可以為湯劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑或丸劑等其它劑型。由于湯劑在攜帶與使用等方面有諸多不便。中藥顆粒劑、片劑、膠囊劑、丸劑等劑型既能保持中醫(yī)藥的傳統(tǒng)用藥特色，又能最大限度地提取和保留處方中藥物的有效成分，發(fā)揮其綜合治療作用，這些劑型與傳統(tǒng)湯劑相比，具有性質(zhì)穩(wěn)定、質(zhì)量可控、便于工業(yè)化生產(chǎn)和攜帶服用方便的優(yōu)點。因此本發(fā)明中優(yōu)選為將其制成片劑、膠囊劑、顆粒劑或丸劑。湯劑的制備方法可依據(jù)中藥的熬制方法進(jìn)行熬制。在將藥物組合物制成片劑、膠囊劑、顆粒劑或丸劑的過程中，需加入相應(yīng)的輔料，具體的制劑過程可按照常規(guī)劑型的制劑過程進(jìn)行。如片劑的生產(chǎn)方法還需加入適量輔料，制成素片，或包薄膜衣或糖衣制成包衣片。膠囊劑的生產(chǎn)方法還需加入適量輔料，并需裝入膠囊中。輔料可根據(jù)制劑需求進(jìn)行選擇一種或幾種，如輔料可以為可溶性淀粉、玉米淀粉、糊精、麥芽糊精、甘露醇、蔗糖、預(yù)膠化淀粉、硫酸鈣、聚維酮、交聯(lián)聚維酮、甲基纖維素、乙基纖維素、二氧化硅、乳糖、硬脂酸鎂、滑石粉、微粉硅膠、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、乙醇、純化水、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚維酮、羥丙甲纖維素、煉蜜、糖漿、甜菊素、阿司帕坦。
可選地，揮發(fā)油的提取方法為：
加入荊芥和柴胡總質(zhì)量2～20倍水，加熱蒸餾提取1～15小時。
在該條件下，揮發(fā)油的提取效率較高，可避免浪費。優(yōu)選地，荊芥、柴胡揮發(fā)油提取條件的加水量為藥材總量的8～10倍量，蒸餾提取揮發(fā)油的時間為4～7h。
可選地，環(huán)糊精包合操作中，環(huán)糊精的用量為揮發(fā)油質(zhì)量的2～20倍，包合操作采用研磨法、飽和水溶液法、膠體磨法、超聲法、冷凍干燥技術(shù)、噴霧干燥技術(shù)中的一種。環(huán)糊精為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精。
選擇該用量可使得揮發(fā)油的包合效果好，包合率高。另外膠體磨法制備揮發(fā)油包合物的工藝相比研磨法和飽和水溶液法，工藝簡單、可行，并且還有包合時間短、包合率高、產(chǎn)量高等優(yōu)勢，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，因此為優(yōu)選的方法。
可選地，揮發(fā)油包合物采用膠體磨法制備，環(huán)糊精為β-環(huán)糊精，β-環(huán)糊精的用量為揮發(fā)油質(zhì)量的6～10倍，加水量為β-環(huán)糊精的質(zhì)量的8～12倍，研磨時間為10～40分鐘。
荊芥、柴胡、薄荷素油包合方法，采用膠體磨法包合揮發(fā)油的工藝條件是以揮發(fā)油6～10倍量的β-環(huán)糊精，加水量為β-環(huán)糊精的8～12倍，研磨10～40分鐘，揮發(fā)油包合率可達(dá)到較高水平。
可選地，木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠合并加入其總質(zhì)量2～20倍的水提取1～5次，每次0.5～5小時。干燥方法為減壓干燥或噴霧干燥、微波干燥或冷凍干燥。在該條件下，提取較為徹底，可避免浪費。
可選地，木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠的水提次數(shù)為3次，第一次水提中加入木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠總質(zhì)量8～10倍水提取2～3小時，第二次水提和第三次水提中均加入木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠總質(zhì)量6～8倍水提取2～3小時；優(yōu)選地，第一次水提中用水為98～100℃的水；干燥方法為60～80℃下減壓干燥。
步驟(3)的水提取條件為提取三次，加水量及提取時間為第一次加8～10倍量沸水提取2～3小時，第二次、第三次加6～8倍量常溫水提取2～3小時，提取液濃縮后在60～80℃減壓干燥，在該范圍內(nèi)有效成分提取及保留率均較高。第一次提取用水為溫度較高，可避免提取過程中有效成分黃芩苷被酶水解。第二、三次提取用水為常溫水，溫度較低，如10～30℃的水。
可選地，將木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠合并水提操作還包括將荊芥和柴胡蒸餾后的藥渣加入木蝴蝶、了哥王、黃芩和紫珠中合并水提。
荊芥和柴胡蒸餾后的藥渣可能還有殘留的有效成分，將其與木蝴蝶、了哥王、黃芩、紫珠合并水提，可將殘留的有效成分提取，進(jìn)一步提高利用率。
實施例1
本發(fā)明藥物組合物有效成分的原料組成及重量為：
木蝴蝶10份荊芥15份柴胡25份
了哥王15份黃芩25份裸花紫珠20份
人工牛黃0.25份薄荷素油0.08份。
本發(fā)明藥物組合物制備方法的工藝步驟為：
(1)取木蝴蝶、裸花紫珠、了哥王粗碎，備用。
(2)取荊芥、柴胡加10倍量水加熱蒸餾提取法提取揮發(fā)油7小時，所得揮發(fā)油與薄荷素油合并用10倍量β-環(huán)糊精加6倍量水以研磨法包合成包合物。
(3)上述藥渣與木蝴蝶、了哥王、黃芩、裸花紫珠合并水提分別加15倍沸水、12倍、12倍常溫水提取三次，提取時間分別為3小時、2小時、2小時，收集濾液，與上述提取揮發(fā)油的濾液合并，減壓濃縮至密度約1.20～1.30，50℃微波真空干燥，粉碎成細(xì)粉。
(4)將上述浸膏粉加入揮發(fā)油包合物、人工牛黃，混勻，加適量輔料，攪拌均勻，加80％乙醇溶液制成顆粒，干燥后整粒，用壓片機壓制成型。然后在合適的裝置中向藥片連續(xù)噴淋成膜材料(含有常規(guī)的含聚合物的包衣物質(zhì))，至包衣合格，即制成片劑。
實施例2
本發(fā)明藥物組合物有效成分的原料組成及重量為：
木蝴蝶6份荊芥12份柴胡15份
了哥王9份黃芩15份大葉紫珠15份
人工牛黃0.20份薄荷素油0.06份。
本發(fā)明藥物組合物制備方法的工藝步驟為：
(1)取木蝴蝶、大葉紫珠、了哥王粗碎，過10目篩。
(2)將荊芥、柴胡加8倍量水以加熱蒸餾提取法提取揮發(fā)油8小時，所得揮發(fā)油與薄荷素油合并用8倍量羥丙基-β-環(huán)糊精加10倍量水以膠體磨法包合成包合物。
(3)上述藥渣與木蝴蝶、了哥王、黃芩、大葉紫珠合并水提分別加18倍、15倍提取兩次，提取時間分別為4小時、3小時，收集濾液，與上述提取揮發(fā)油的濾液合并，濃縮至相對密度約1.06～1.10，進(jìn)風(fēng)溫度150℃、出風(fēng)溫度100℃，噴霧干燥。
(4)將上述浸膏粉加入揮發(fā)油包合物、人工牛黃，混勻，加適量糊精、甜菊素制成顆粒劑。
實施例3
本發(fā)明藥物組合物有效成分的原料組成及重量為：
木蝴蝶5份荊芥9份柴胡12份
了哥王7份黃芩12份廣東紫珠12份
天然牛黃0.18份薄荷素油0.04份。
本發(fā)明藥物組合物制備方法的工藝步驟為：
(1)取木蝴蝶、廣東紫珠、了哥王粗碎，備用。
(2)將荊芥、柴胡加8倍量水加熱蒸餾提取法提取揮發(fā)油6小時，所得揮發(fā)油與薄荷素油合并用10倍量β-環(huán)糊精加15倍量水以飽和水溶液法包合成包合物。
(3)上述藥渣與木蝴蝶、了哥王、黃芩、廣東紫珠合并水提分別加8倍、6倍、6倍、6倍水提取四次，提取時間分別為3小時、2小時、2小時、2小時，收集濾液，與上述提取揮發(fā)油的濾液合并，減壓濃縮至相對密度約為11～13，冷凍干燥、粉碎成細(xì)粉。
(4)將上述浸膏粉加入揮發(fā)油包合物、天然牛黃，混勻，加適量輔料，裝入膠囊中。
實施例4
本發(fā)明藥物組合物有效成分的原料組成及重量為：
木蝴蝶3份荊芥6份柴胡9份
了哥王6份黃芩9份廣東紫珠9份
人工牛黃0.10份薄荷素油0.02份。
本發(fā)明藥物組合物制備方法的工藝步驟為：
(1)取木蝴蝶、廣東紫珠、了哥王粗碎，備用。
(2)將荊芥、柴胡加8倍量水加熱蒸餾提取法提取揮發(fā)油6小時，所得揮發(fā)油與薄荷素油合并用10倍量羥丙基-β-環(huán)糊精加15倍量水以膠體磨法包合成包合物。
(3)上述藥渣與木蝴蝶、了哥王、黃芩、廣東紫珠合并水提分別加7倍沸水、5倍、5倍常溫水提取三次，提取時間分別為3小時、2小時、2小時，收集濾液，與上述提取揮發(fā)油的濾液合并，減壓濃縮、70℃干燥、粉碎成細(xì)粉。
(4)將上述浸膏粉加入揮發(fā)油包合物、人工牛黃，混勻，加適量輔料制成顆粒劑。
試驗例1
藥效學(xué)實驗，下述試驗是在上述實施例4的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，經(jīng)驗證，實施例中的藥物組合物有良好的效果。所使用的生藥為實施例4中不包含輔料的藥物組合物，即浸膏粉、揮發(fā)油包合物和牛黃的混合物。市售藥物對照組中使用的市售藥物為xx公司生產(chǎn)的風(fēng)熱感冒顆粒。
1.解熱作用
(1)酵母致大鼠發(fā)熱模型實驗
實驗方法：sd大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，每天上下午各測體溫1次(體溫計插入肛門2cm，測定直腸溫度，測溫時輕輕擠出直腸內(nèi)糞塊)，選取體溫在36.3～38.0℃，且體溫變化不超過0.5℃的大鼠制備發(fā)熱模型。將合格大鼠隨機分為空白對照組、模型組、市售藥物對照組(2.70g/kg)、藥物組合物高(7.60g生藥/kg)、中(3.80g生藥/kg)、低(1.90g生藥/kg)劑量組，每組10只。實驗當(dāng)日每隔1h測體溫1次，連續(xù)2次，取其平均值作為基礎(chǔ)體溫。將體溫合格的各給藥組和模型組大鼠按10ml/kg劑量背部皮下注射20％干酵母混懸液，制備大鼠干酵母發(fā)熱模型，空白對照組皮下注射等體積生理鹽水。發(fā)熱模型建立6h后，分別以相應(yīng)藥物及劑量灌胃給予大鼠，空白組和模型組給予等量生理鹽水，灌胃體積為20ml/kg。測定給藥后1、2、3、4h體溫變化，并按下式計算4h內(nèi)解熱作用抑制率。結(jié)果見表1。
表1對酵母致大鼠發(fā)熱的影響(
注：與空白對照組比較，△p＜0.05，△△p＜0.01；與模型組比較，※p＜0.05，※※p＜0.01；與市售藥物對照組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01
結(jié)論：本藥物組合物不同劑量均能降低干酵母致大鼠發(fā)熱模型體溫，解熱作用與市售對照組相當(dāng)，說明本藥物組合物對酵母致大鼠發(fā)熱模型有一定的解熱作用。
(2)致家兔發(fā)熱實驗
實驗方法：取體重1.5～2.0kg的新西蘭大白兔，雌雄各半，于實驗室預(yù)養(yǎng)3d，每天適應(yīng)性測肛溫2次(末端涂抹少許凡士林，插入兔肛門，深度約為3cm，電子體溫計報鳴時，記錄體溫)。實驗前禁食不禁水12h，測量肛溫2次，間隔30min，篩選基礎(chǔ)體溫在38.2～39.5℃，且自身體溫變化小于0.3℃的家兔用于后續(xù)實驗。用生理鹽水配制0.5μg/mllps溶液100ml，實驗前將內(nèi)毒素溶液置于38℃水中溫浴。家兔耳緣靜脈緩慢注入內(nèi)毒素溶液1.0ml/kg復(fù)制家兔發(fā)熱模型，空白對照組注入等量生理鹽水，1h后測定家兔肛溫(t)。選取體溫上升＞0.6℃的模型家兔36只，隨機分為模型組、市售藥物對照組(1.40g/kg)、藥物組合物高(3.94g生藥/kg)、中(1.97g生藥/kg)、低(0.985g生藥/kg)劑量組，每組6只，空白對照組選取體溫合格的6只家兔。各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)藥物1次，給藥容積為4ml/kg，空白對照組和模型組給予等量蒸餾水，給藥后每1h測肛溫一次(ti，i＝1，2，3，4，5，6)，連續(xù)測定6h。計算6h內(nèi)溫度變化平均值(δt)，并按下式計算6h內(nèi)藥物降低內(nèi)毒素致家兔發(fā)熱模型體溫的百分率(％)。結(jié)果見表2。
表2對內(nèi)毒素致家兔解熱的影響(
注：與空白對照組比較，△p＜0.05，△△p＜0.01；與模型組比較，※p＜0.05，※※p＜0.01；與市售藥物對照組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01。
結(jié)論：本藥物組合物解熱作用較強。
2.止咳化痰作用
(1)對濃氨水噴霧法誘導(dǎo)小鼠咳嗽的影響
實驗方法：取體重18～20gkm小鼠(雌雄各半)按體重隨機分為空白對照組、市售藥物對照組、藥物組合物高、中、低劑量組，每組10只。各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)藥物；空白對照組給予等量的蒸餾水，20ml/kg，1次/d，共7d。末次給藥前禁食不禁水12h，于末次給藥0.5h后，將300ml廣口瓶置于桌面，用移液器將0.1ml濃氨水吹打于棉球上，并將其置于廣口瓶內(nèi)，放入小鼠，蓋上瓶蓋，觀察小鼠的咳嗽反射(腹肌收縮，張大嘴，有時有咳嗽聲)，記錄下從放入小鼠到小鼠發(fā)生咳嗽反射的時間即咳嗽潛伏期和3min內(nèi)動物咳嗽次數(shù)，并計算咳嗽抑制率和止咳活性。結(jié)果見表3。
表3對氨水引咳小鼠的影響(
注：與空白對照組比較，△p＜0.05，△△p＜0.01；與藥物比較組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01。
結(jié)論：結(jié)果表明不同劑量的藥物組合物均具有較好的止咳作用，且明顯優(yōu)于市售藥物對照組。
(2)對小鼠氣管段酚紅分泌的影響
實驗方法：取體重18-20gkm小鼠(雌雄各半)，隨機分為空白對照組、市售藥物對照組(3.90g/kg)、藥物組合物高(10.96g生藥/kg)、中(5.48g生藥/kg)、低(2.74g生藥/kg)劑量組，每組10只。各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，空白對照組給予等量的蒸餾水，給藥劑體積20ml/kg，1次/d，共7d。末次給藥前禁食不禁水12h，于末次給藥后，各組動物腹腔注射0.5％酚紅生理鹽水溶液0.5ml/只，注射酚紅0.5h后處死動物，仰位固定，頸部拉直，解剖分離出氣管，剪下自甲狀軟骨下至氣管分支處的一段氣管，用5％nahco3溶液沖洗氣管3次，每次0.5ml，收集灌洗液，3000r/min離心10min，取上清，用5％nahco3溶液調(diào)“0”，在波長546nm處測od值，并根據(jù)酚紅的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酚紅含量(μg/ml)，記錄結(jié)果并按下式計算各給藥組化痰率(％)。結(jié)果見表4。
表4對氣管酚紅排泌的影響(
注：與空白對照組比較，△p＜0.05，△△p＜0.01；與市售藥物對照組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01。
結(jié)論：藥物組合物具有較好的化痰作用。
3.抗炎作用
(1)二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗
實驗方法：取體重18～22gkm雄性小鼠按體重隨機分為模型組、市售藥物對照組(3.90g/kg)、藥物組合物高(10.96g生藥/kg)、中(5.48g生藥/kg)、低(2.74g生藥/kg)劑量組，共6組，每組20只。禁食不禁水12h后，各組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，給藥劑量20ml/kg，模型組給予等量的蒸餾水。給藥0.5h后，每只小鼠于右耳廓內(nèi)外側(cè)涂予0.04ml二甲苯，左耳作為對照。造模后1.5h脫頸椎處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑9mm打孔器分別在同一部位摘取小鼠雙耳片，精密稱重，求左、右耳片重量，計算耳腫脹度。結(jié)果見表5。
腫脹度(mg)＝右耳片質(zhì)量(mg)－左耳片質(zhì)量(mg)
表5對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響(
注：與模型組比較，※p＜0.05，※※p＜0.01；與市售藥物對照組組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01。
結(jié)論：本藥物組合物具有一定的抗炎作用。
(2)對小鼠毛細(xì)血管通透性的影響實驗
實驗方法：取體重18～22gkm小鼠140只，雌雄各半，按體重隨機分成空白對照組、模型組、市售藥物對照組(3.90g/kg)、藥物組合物高(10.96g生藥/kg)、中(5.48g生藥/kg)、低(2.74g生藥/kg)劑量組，每組20只。各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，空白對照組和模型組給予等量蒸餾水，給藥容積為20ml/kg，1次/d，連續(xù)3d。于末次給藥15min后，尾靜脈注射l％evansblue生理鹽水0.1ml/10g。除空白對照組腹腔注射生理鹽水0.2ml/10g外，其余組腹腔注射0.5％醋酸生理鹽水溶液20ml/kg。30min后處死小鼠，剪開腹部皮膚，分離肌肉，暴露腹腔，用6ml生理鹽水反復(fù)沖洗腹腔內(nèi)evansblue溶液，收取3ml腹腔混合液，加入0.1mol/lnaoh溶液0.1ml，混勻后經(jīng)3000r/min離心10min，取上層清液，用分光光度法在波長590nm處測定吸光度值，比較各組吸光度的差異。結(jié)果見表6。
表6對醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性的影響(
注：與空白對照組比較，△p＜0.05，△△p＜0.01；與模型組比較，※p＜0.05，※※p＜0.01；與市售藥物對照組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01。
結(jié)論：本藥物組合物具有一定的抗炎作用，且強于市售藥物對照組。
4.止痛作用
(1)小鼠扭體實驗
實驗方法：取體重18～22gkm小鼠(雌雄各半)，隨機分為模型組、市售藥物對照組(3.90g/kg)、藥物組合物高(10.96g生藥/kg)、中(5.48g生藥/kg)、低(2.74g生藥/kg)劑量組，每組10只。各給藥組分別以相應(yīng)藥物灌胃，給藥體積為20ml/kg，模型組給予等量蒸餾水。給藥0.5h后，各組動物腹腔注射0.6％冰乙酸10ml/kg，觀察15min內(nèi)各組小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的扭體次數(shù)，計算藥物抑制小鼠扭體反應(yīng)的百分比值(％)。結(jié)果見表7。
表7對冰醋酸致小鼠疼痛的影響(
注：與模型組比較，※p＜0.05，※※p＜0.01；與市售藥物對照組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01
結(jié)論：本藥物組合物高、中劑量對冰醋酸致小鼠疼痛模型有一定止痛作用，且作用強于市售藥物對照組。
(2)小鼠熱板實驗
實驗方法：取體重18～22g的雌性km小鼠放置于預(yù)熱至(55±0.5)℃金屬板上，以小鼠跳躍反應(yīng)潛伏期作為痛閾指標(biāo)。實驗前測定痛閾值，連續(xù)兩次，剔除潛伏期小于5s或大于30s動物，并以60s為截止時間，測定兩次痛閾值的平均值作為給藥前的基礎(chǔ)痛閾值。按基礎(chǔ)痛閾值的高低隨機分為空白對照組、市售藥物對照組(3.90g/kg)、藥物組合物高(10.96g生藥/kg)、中(5.48g生藥/kg)、低(2.74g生藥/kg)劑量組，每組20只。實驗前禁食不禁水12h，各組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，空白對照組給予等量的蒸餾水，給藥體積為20ml/kg。測定給藥后0.5h、1.0h、1.5h和2h的痛閾值。結(jié)果見表8。
表8對熱板致小鼠疼痛的影響(
注：與空白對照組比較，△p＜0.05，△△p＜0.01；與市售藥物對照組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01。
結(jié)論：本藥物組合物對熱板致小鼠疼痛模型具有一定止痛作用，作用強于市售藥物對照組。
5.抗過敏作用
(1)大鼠顱骨肥大細(xì)胞脫顆粒的影響
實驗方法：另取體重150～180gsd雄性大鼠，按體重隨機分成空白對照組、模型組、市售藥物對照組(2.70g/kg)、藥物組合物高(7.60g生藥/kg)、中(3.80g生藥/kg)、低(1.90g生藥/kg)劑量組，每組10只。各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，給藥體積20ml/kg，1次/d，連續(xù)6d，空白對照組和模型組給予等體積蒸餾水。于第6d，給藥后1h，除空白對照組外，將1:5大鼠卵白蛋白抗血清0.1ml注射大鼠顱頂皮下組織。48h后，尾靜脈注射以0.5％伊文思藍(lán)溶液配成的2mg/ml的卵白蛋白溶液，注射量10ml/kg。30min后處死大鼠，常規(guī)方法制備顱骨膜切片，切片脫蠟復(fù)水后放入甲苯胺藍(lán)溶液染液30s，蒸餾水洗2次，每次3～5min，30％酒精分色。在全片視野上、中、下、左、右5個視野倍鏡下(×400)對脫顆粒的肥大細(xì)胞(包膜出現(xiàn)明顯破裂或有顆粒外逸為脫顆粒)和肥大細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行計數(shù)，每只動物計數(shù)為該5個視野計數(shù)的均數(shù)。肥大細(xì)胞脫顆粒率(％)計算按下式計算。結(jié)果見表9。
表9大鼠顱骨腦膜肥大細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計(
注：與空白對照組相比，△p＜0.05，△△p＜0.01；與模型組相比，※p＜0.05，※※p＜0.01；與市售藥物對照組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01。
結(jié)論：本藥物組合物具有一定抑制過敏反應(yīng)的能力。
(2)對組織胺致豚鼠離體回腸收縮的影響
實驗方法：豚鼠回腸標(biāo)本的制備，實驗前豚鼠禁食12h，自由飲水。頸椎脫位處死后，打開腹腔，取出一段長約12cm回腸，放入預(yù)冷kreb’s營養(yǎng)液中，沿腸壁除去腸系膜，用kreb液沖洗腸腔柱，然后將回腸剪成數(shù)段長1.5～2cm的標(biāo)本備用。設(shè)置儀器參數(shù)：增益50mv，時間常數(shù)t直流(dc)，濾波頻率10hz，掃描速度1.25s/div。取一標(biāo)本回腸管置于含10ml溫度為(37.5±0.5)℃kreb’s營養(yǎng)液的麥?zhǔn)显〔壑?，持續(xù)通入95％o2和5％co2的混合氣體，調(diào)節(jié)流速使平均每秒1～2個氣泡。在其兩端對角處分別用醫(yī)用真絲編織線打結(jié)，一端系在l型通氣管上，加以固定，另一端連接固定于肌張力換能器上并引至計算機接口，預(yù)置前負(fù)荷0.5g，穩(wěn)定20min，用bl-420s型生物機能系統(tǒng)進(jìn)行描記，記錄回腸段自發(fā)收縮，待回腸段收縮穩(wěn)定后進(jìn)行實驗。分組及給藥：取spf級雄性豚鼠，將相同回腸段分組(n＝10)，即模型組、市售藥物對照組(1.5mg/ml)、藥物組合物高(4.24mg生藥/ml)、中(2.12mg生藥/ml)、低(1.06mg生藥/ml)劑量組。按上述所述方法制備回腸標(biāo)本，待自發(fā)節(jié)律穩(wěn)定后，每組均加入0.025mg/ml的組胺溶液20μl進(jìn)行造模，達(dá)最大收縮時，再分別加入kreb’s營養(yǎng)液、撲爾敏溶液、市售藥物對照溶液、藥物組合物高、中、低劑量溶液，模型組給予等量的kreb’s營養(yǎng)液。觀察并記錄加組胺后以及給藥后5min的平均張力，按以下公式計算其抑制率。結(jié)果見表10。.
表10對組胺致豚鼠離體回腸收縮作用的影響(
注：與模型組比較，※p＜0.05，※※p＜0.01；與市售藥物對照組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01。
結(jié)論：本藥物組合物具有抑制過敏反應(yīng)的能力，且強于市售藥物對照組。
6.體內(nèi)外抗病毒作用
(1)體外抗流感病毒試驗
實驗方法：
藥物對流感病毒增殖的抑制作用：稱取適量藥物組合物、市售藥物，以dmem(10％fbs)為溶媒，配成適量濃度的溶液。取細(xì)胞密度達(dá)90％的mdck細(xì)胞培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)液，接種100tcid50的病毒液，100μl/孔，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中吸附2h后，用細(xì)胞維持液輕洗細(xì)胞表面3遍，然后加入最大無毒濃度以下6個相應(yīng)稀釋度的藥物組合物藥液，設(shè)市售藥物為陽性藥物對照組，100μl/孔，同時設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照，每個濃度4個復(fù)孔。置37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別繼續(xù)培養(yǎng)48h，在病毒對照+++～++++時棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5mg/mlmtt的培養(yǎng)液50μl，繼續(xù)培養(yǎng)2～3h后洗去mtt上清，加入dmso溶解液每孔100μl，混勻，5～10min后，用酶標(biāo)儀測570nm波長下的od值。并按下公式計算藥物對流感病毒抑制率、ic50及治療指數(shù)ti。結(jié)果見表11
藥物對流感病毒神經(jīng)氨酸酶活力的影響：取藥物組合物抗流感病毒實驗48h后細(xì)胞，加入ripa細(xì)胞裂解液，裂解細(xì)胞，備用。按照試劑盒說明書操作，在96孔熒光酶標(biāo)板內(nèi)每孔遞次加入70μl神經(jīng)氨酸酶檢測緩沖液，10μl神經(jīng)氨酸酶，及10μl樣品。振動搖勻1min后，加入10μl神經(jīng)氨酸酶熒光底物。再振動1min，37℃孵育30min。熒光測定激發(fā)波長為322nm，發(fā)射波長為450nm。根據(jù)熒光強度計算各組樣品組織中神經(jīng)氨酸酶的相對活力。結(jié)果見表12。
實驗結(jié)果
表11不同藥物對流感病毒增殖的抑制作用
表12對鼠源流感病毒神經(jīng)氨酸酶活力的影響(168h,n＝4)
注：與細(xì)胞對照組比較，△p＜0.05，△△p＜0.01；與病毒對照組比較，※p＜0.05，※※p＜0.01。
結(jié)論：在對mdck細(xì)胞最大無毒濃度下，藥物組合物有顯著抑制鼠源流感病毒(a/fm/1/471:160)作用，同時能在一定程度上降低流感病毒的活力。
(2)體內(nèi)抗流感病毒實驗
實驗方法：藥物對甲ι型流感病毒小鼠的治療作用：取體重14～16gkm雌性小鼠，按體重隨機分為正常對照組、病毒對照組、市售藥物對照組(3.90g/kg)、藥物組合物高(10.96g生藥/kg)、中(5.48g生藥/kg)、低(2.74g生藥/kg)劑量組，每組10只。除正常對照組，其余各組小鼠經(jīng)戊巴比妥輕度麻醉后，均以肺流感病毒10-5滴鼻法感染病毒，40ul/只。感染病毒2h后市售藥物對照組、藥物組合物高、中、低劑量組按上述劑量灌胃給藥，正常對照組和病毒對照組灌胃等體積的蒸餾水，20ml/kg，2次/天，連續(xù)給藥7天。記錄給藥后一周內(nèi)各組小鼠感染后死亡情況，計算死亡保護(hù)率、平均存活天數(shù)、延長生命率。結(jié)果見表13。
表13對流感病毒fm1感染小鼠的治療效果
注：與正常對照組相比，△p＜0.05，△△p＜0.01；與病毒對照組相比，※p＜0.05，※※p＜0.01；與市售藥物組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01。
結(jié)論：本藥物組合物對a/fm/1/47(h1n1)感染的小鼠肺炎具有一定的保護(hù)作用。
(3)體內(nèi)抗柯薩奇病毒實驗
實驗方法：藥物組合物體內(nèi)抗cb3實驗：取70只4周齡balb/c雄性小鼠，按體重隨機均分為空白對照組、病毒對照組、阿昔洛韋組(0.260g/kg)、市售藥物對照組(3.90g/kg)、藥物組合物高(10.96g生藥/kg)、中(5.48g生藥/kg)、低(2.74g生藥/kg)劑量組，共7組，每組10只。感染部位常規(guī)消毒后，模型對照組和各給藥組動物腹腔注射103tcid50cb30.2ml/只，空白對照組注射等量dmem培養(yǎng)基，觀察并記錄小鼠發(fā)病及死亡情況。感染cb3病毒24h后，各組動物分別灌胃給予相應(yīng)藥物，灌胃給藥體積為20ml/kg，1次/d，空白對照組和病毒對照組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)給藥10d。每天觀察小鼠的體重、活動狀態(tài)、飲食情況、體型和毛色變化等生存狀況以及發(fā)病和死亡情況。
結(jié)論：體內(nèi)抗cb3實驗表明，本藥物組合物高、中劑量具有一定對抗cb3致心肌細(xì)胞病理損害、肝細(xì)胞病變、肺組織病變和腸組織病變的作用，且作用較明顯。
7抗細(xì)菌作用
(1)體外抗菌作用(紙片瓊脂擴散法)
實驗方法：取直徑10cm平皿，傾入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml，冷凝后用滅菌的棉簽蘸取供試菌菌液均勻涂抹在培養(yǎng)基表面，室溫放置2～3min，用無菌鑷子將在不同濃度的藥液中浸潤的紙片均勻間隔貼于各瓊脂培養(yǎng)基表面，輕壓紙片使接觸良好，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，24h后取出，觀察抑菌圈，測量并記錄結(jié)果。每個濃度的藥物抑菌實驗重復(fù)3次，抑菌結(jié)果為3次實驗平均值。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑小于9mm為低度敏感，9.1～11mm為中度敏感，11.1～15mm為高度敏感。結(jié)果見表14。
表14不同濃度藥物組合物對各種致病菌的作用(體外實驗)(
結(jié)論：本藥物組合物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌均有一定抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑制作用最為明顯。
(2)體內(nèi)抗菌實驗
實驗方法：選取健康小鼠(雌雄各半)，隨機分成空白對照組、模型組、市售藥物對照組(3.90g/kg)，藥物組合物高(10.96g生藥/kg)、中(5.48g生藥/kg)、低(2.74g生藥/kg)劑量組，每組20只。各給藥組按劑量連續(xù)灌胃給藥3d，1次/d，空白對照組和模型組給予等量生理鹽水。末次給藥前小鼠禁食12h，給藥30min后，根據(jù)菌株毒力的預(yù)試情況選用使80％～100％小鼠死亡的金黃色葡萄球菌的干酵母懸液0.5ml/只，給小鼠腹腔注射造成感染(空白對照組注射等量干酵母生理鹽水溶液)。感染后6h再給藥1次，觀察和記錄各組動物感染后7d內(nèi)的反應(yīng)情況以及死亡數(shù)，計算各組動物平均存活天數(shù)及死亡率。結(jié)果見表15。
表15對金葡菌感染小鼠的保護(hù)作用
注：與空白對照組比較，△p＜0.05，△△p＜0.01；與模型組比較，※p＜0.05，※※p＜0.01；與市售藥物對照組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01。
結(jié)論：本藥物組合物可顯著降低金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)小鼠感染的死亡率，延長小鼠存活時間，具有一定的體內(nèi)抗菌作用。
8免疫調(diào)節(jié)作用
(1)對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實驗(mtt法)
實驗方法：取體重18～22gbalb/c小鼠(雌雄各半)，隨機分為空白對照組、模型組、市售藥物對照組(3.90g/kg)、藥物組合物高(10.96g生藥/kg)、中(5.48g生藥/kg)、低(2.74g生藥/kg)劑量組，每組20只。各給藥組按相應(yīng)藥物灌胃給藥，空白對照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水，1次/d，20ml/kg，共7天。實驗開始第5天，模型及給藥組小鼠連續(xù)腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg，1次/d，連續(xù)給予2d，空白對照組小鼠腹腔注射等量無菌生理鹽水。實驗結(jié)束后，小鼠斷頸處死，無菌取出小鼠脾臟，按小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離試劑盒操作，分離小鼠脾淋巴細(xì)胞。以完全營養(yǎng)液配成1×106個/ml的脾細(xì)胞懸液。取100μl加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔含1×105/ml個細(xì)胞，37℃，5％co2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，每孔加入10μlmtt溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加入formazan溶解液100μl，于振蕩器上充分震蕩30min。在570nm波長下用全自動酶標(biāo)儀測定吸光度a，平行檢測培養(yǎng)基a值(背景干擾)，按下列公式計算試驗組a＇值、模型組a＇值和脾淋巴細(xì)胞增值率(％)。結(jié)果見表16。
試驗組a′值＝試驗組a值－培養(yǎng)基a值
模型組a′值＝模型組a值－培養(yǎng)基a值
表16對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(
注：與空白對照組比較，△p＜0.05，△△p＜0.01；與模型組比較，※p＜0.05，※※p＜0.01；與市售藥物對照組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01
結(jié)論：本藥物組合物有較好的增強免疫作用，高、中劑量作用明顯。
(2)對體液免疫的影響—炭粒廓清法
實驗方法：取體重18～22gkm小鼠(雌雄各半)，按體重隨機分成空白對照組、模型組、市售藥物對照組(3.90g/kg)、藥物組合物高(10.96g生藥/kg)、中(5.48g生藥/kg)、低(2.74g生藥/kg)劑量組，每組10只。各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，灌胃體積為20ml/kg，1次/d，連續(xù)給藥7d，空白對照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水。分別在實驗開始第1、3、5天，模型組和給藥組腹腔注射80mg/kg的環(huán)磷酰胺，1次/d?？瞻讓φ战M給腹腔注射等量無菌生理鹽水。末次給藥前12h禁食不禁水。給藥1h后，尾靜脈注射20％印度墨汁10ml/kg。于注入墨汁后2min及10min，用特制取血吸管從小鼠眼眶后靜脈叢取血0.02ml，立刻吹入2ml0.1％na2co3溶液中，吸管于該液中吸入、吹出數(shù)次，以充分洗出吸管壁附著的血液，充分混勻。于分光光度計上680nm處測定吸光度a，0.1％na2co3溶液作為空白調(diào)零。取血完畢后，立即處死小鼠，分別取出肝、脾和胸腺并稱重。按下式計算廓清指數(shù)k、吞噬系數(shù)(校正吞噬指數(shù))α及免疫臟器指數(shù)。結(jié)果見表17。
式中a表示0.1％na2co3血溶液的吸光度，t表示時間，w表示小鼠體重，wls表示肝脾合重量，免疫臟器質(zhì)量分別為脾或胸腺的質(zhì)量。
表17對免疫抑制小鼠非特異性免疫功能和免疫臟器指數(shù)的影響(
注：與空白對照組比較，△p＜0.05，△△p＜0.01；與模型組比較，※p＜0.05，※※p＜0.01；與市售藥物對照組比較，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01。
結(jié)論：本藥物組合物有促進(jìn)免疫作用，并優(yōu)于市售藥物對照組。
試驗例2
本發(fā)明的急性毒性試驗。
試驗方法：
由于km小鼠灌胃最大給藥量的藥物組合物2次，未見動物死亡，故測定該藥的最大給藥量。選取健康合格km小鼠30只，雌雄各半(雄鼠體重19.0～21.9g，雌鼠體重18.5～21.9g)，隨機分為2組，分別為藥物組(n＝20)和空白對照組(n＝10)，藥物組灌胃藥物組合物105.6g生藥/kg，空白對照組給予等體積純化水。24小時內(nèi)灌胃2次(間隔時間不少于4小時)，每次給藥體積為0.25ml/10g體重。給藥當(dāng)天持續(xù)觀察至藥后4小時，之后每天觀察1次，連續(xù)14天觀察動物的一般狀況和死亡情況；藥后第1、2、3、7和14天測定動物體重，并計算其體重增長；觀察結(jié)束后，所有受試動物進(jìn)行大體解剖觀察。
結(jié)果：
(1)對一般狀況的影響
km小鼠24小時內(nèi)2次灌胃藥物組合物后，連續(xù)觀察14天，動物的外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、排泄物和飲食等一般狀況均未見明顯異常，也未見動物死亡。
(2)對體重及體重增長的影響
km小鼠24小時內(nèi)2次灌胃藥物組合物后，對小鼠體重和體重增長未見明顯影響。
(3)解剖觀察
試驗結(jié)束后，km小鼠脫頸椎處死，解剖，肉眼觀察各主要臟器均未見明顯異常。
結(jié)論：在本試驗研究條件下，km小鼠24小時內(nèi)2次灌胃藥物組合物，其最大給藥量為105.6g生藥/kg(相當(dāng)于臨床劑量0.7g生藥/kg的151倍)。給藥后，未見明顯的急性毒性反應(yīng)。
試驗例3
本發(fā)明的急性毒性試驗。
方法：選取健康合格sd大鼠128只，隨機區(qū)組分為4組(n＝32，雌雄各半)，分別為藥物組合物高、中、低劑量組和空白對照組，即藥物組合物32.0、12.0和6.0g生藥/kg，相當(dāng)于臨床劑量的46、17和8倍，空白對照組給予等體積的純化水，給藥濃度為2.11、0.80和0.40g生藥/ml，其中2.11g生藥/ml為最大給藥濃度。每天灌胃1次，灌胃體積為1.5ml/100g體重，連續(xù)給藥3個月，停藥恢復(fù)1個月，每天觀察動物外觀體征、行為活動、呼吸、排泄物等一般狀況；每周測定體重和攝食量1次；每組于給藥結(jié)束和恢復(fù)期結(jié)束處理動物數(shù)分別為20只和12只，并對每只處理動物的眼科、尿液、血液學(xué)、血液生化學(xué)等指標(biāo)進(jìn)行觀察和檢測，解剖大體觀察及臟器組織病理學(xué)檢查。
結(jié)果：
(1)一般狀況
整個試驗期間，所有動物未見瀕死或死亡。
sd大鼠連續(xù)灌胃藥物組合物3個月和停藥恢復(fù)1個月，藥物組合物32.0g生藥/kg組動物給藥后出現(xiàn)流涎或口周毛潮濕、唾液分泌過多，其持續(xù)時間最長19分鐘，停藥(星期天)或恢復(fù)期均未見該現(xiàn)象，且唾液腺組織病理學(xué)檢查未見改變，提示該現(xiàn)象為一過性流涎，本試驗劑量下不會引起動物的明顯毒性反應(yīng)。
動物其余外觀體征、行為活動、呼吸、排泄物等一般狀況均未見明顯異常反應(yīng)。
(2)體重及體重增長
sd大鼠連續(xù)灌胃藥物組合物3個月和停藥恢復(fù)1個月，藥物組合物各劑量組動物的體重和體重增長與同期空白對照組相比均未見明顯差異。
(3)攝食量
sd大鼠連續(xù)灌胃藥物組合物3個月和停藥恢復(fù)1個月，藥物組合物各劑量組動物的攝食量與同期空白對照組相比均未見明顯差異。
(4)尿液
sd大鼠連續(xù)灌胃藥物組合物3個月和停藥恢復(fù)1個月，藥物組合物各劑量組動物的尿液與同期空白對照組相比未見明顯差異。
(5)眼科
sd大鼠連續(xù)灌胃藥物組合物3個月和停藥恢復(fù)1個月，藥物組合物各劑量組和空白對照組動物的眼瞼、眼眶、眼球、淚腺、結(jié)膜、角膜和玻璃體等均未見異常改變。
(6)血液學(xué)指標(biāo)
sd大鼠連續(xù)灌胃藥物組合物3個月和停藥恢復(fù)1個月，藥物組合物各劑量組動物的白細(xì)胞計數(shù)(wbc)及分類、紅細(xì)胞(rbc)、血紅蛋白(hgb)、紅細(xì)胞壓積(hct)、紅細(xì)胞平均體積(mcv)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白(mch)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(mchc)、紅細(xì)胞分布寬度(rdw-s)、血小板(plt)、血小板平均體積(mpv)、血小板壓積(pct)、血小板分布寬度(pdw)、大型血小板比率(p-lcr)、網(wǎng)織紅細(xì)胞、凝血酶原時間(pt)和部分活化凝血時間(aptt)等血液學(xué)指標(biāo)與同期空白對照組比較，均未見與供試品相關(guān)的異常改變。
(7)血液生化學(xué)指標(biāo)
sd大鼠連續(xù)灌胃藥物組合物3個月和停藥恢復(fù)1個月，藥物組合物各劑量組動物的總蛋白(tp)、白蛋白(alb)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(ggt)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)、堿性磷酸酶(alp)、肌酸激酶(ck)、尿素(urea)、肌酐(cera)、血糖(glu)、總膽固醇(chol)、甘油三脂(tg)、總膽紅素(tbil)和電解質(zhì)(k+、na+、cl-)等血液生化學(xué)指標(biāo)與同期空白對照組比較，均未見與供試品相關(guān)的異常改變。
(8)臟器重量和臟器系數(shù)(臟體比和臟腦比)
sd大鼠連續(xù)灌胃藥物組合物3個月和停藥恢復(fù)1個月，藥物組合物各劑量組動物的心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、腦、睪丸、附睪、子宮、卵巢、胸腺等主要臟器重量及臟器系數(shù)均未見與供試品相關(guān)的改變。
(9)大體解剖觀察
sd大鼠連續(xù)灌胃藥物組合物3個月和停藥恢復(fù)1個月，解剖大體觀察各動物心、肝、脾、肺、腎、生殖系統(tǒng)、胃腸道等消化系統(tǒng)等各臟器或組織大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地均未見異常改變。
(10)組織病理學(xué)
sd大鼠連續(xù)灌胃藥物組合物3個月和停藥恢復(fù)1個月，各組動物的心、肝、脾、肺(附主支氣管)、腎(雙側(cè))、胸腺、腎上腺(雙側(cè))、甲狀腺(雙側(cè))、腦、垂體、子宮(雙側(cè))和子宮頸、卵巢(雙側(cè))和輸卵管、陰道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、乳腺、腸系膜淋巴結(jié)、主動脈弓、坐骨神經(jīng)、胰腺、食管、氣管、頜下腺、腮腺、舌下腺、脊髓(頸、胸、腰椎)、眼、哈氏腺、骨(股骨和胸骨)、淋巴結(jié)(給藥局部淋巴和腸系膜淋巴)和骨骼肌(股)等臟器組織均未見與藥物相關(guān)的病理學(xué)改變。
結(jié)論：綜上所述，如表18所示，在本試驗研究條件下，sd大鼠灌胃藥物組合物3個月多次給藥毒性試驗的安全劑量為32.0g生藥/kg(該劑量為最大給藥濃度2.11g生藥/ml，最大給藥體積1.5ml/100g)，相當(dāng)于臨床成人劑量46倍，在本試驗劑量范圍內(nèi)，未見明顯的由供試品引起的毒性靶組織和器官。
表18藥物組合物毒理學(xué)試驗研究總結(jié)
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。