本發(fā)明提供一種竹節(jié)參皂苷Ⅳa在制備治療高脂飲食致小鼠小腸干細胞的疾病上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

竹節(jié)參屬五加科人參植物竹節(jié)干燥呈竹鞭狀根莖，參具有補虛養(yǎng)陰、活絡(luò)祛痰、活血止血、散瘀止痛等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，竹節(jié)參具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保護心肌缺血、抗衰老等多種藥理作用。皂苷類成分是其主要藥效成分和研究最多的成分，研究表明竹節(jié)參總皂苷具有一定的降血脂作用，同時，其能夠通過誘導(dǎo)細胞分化和周期組織抑制人白血病細胞HL-60的增殖。竹節(jié)參皂苷以齊墩果烷型皂苷為主，包括竹節(jié)參皂苷Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ、pjs1、pjs2、pjs4等。

高脂飲食是肥胖癥的重要誘因之一，而肥胖癥作為一種慢性代謝性疾病，會導(dǎo)致許多慢性疾病而倍受關(guān)注。越來越多的實驗和研究證明高脂飲食是許多類型腫瘤的致病因素，也有研究表明高脂飲食與腸道疾病密切相關(guān)，肥胖人群發(fā)展成為結(jié)直腸癌的風(fēng)險更高。小腸是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，黏膜柱狀上皮細胞承擔(dān)小腸主要的消化吸收功能，而小腸干細胞(Intestinal stem cells，ISCs)是小腸黏膜上皮細胞不斷更新的源泉。小腸干細胞的增殖分化和維持自身平衡由干細胞微環(huán)境通過啟動相關(guān)信號而調(diào)控，小腸干細胞所處的微環(huán)境由小腸干細胞及其周圍細胞分泌的生長因子、細胞因子和細胞外基質(zhì)等構(gòu)成。Wnt/β-catenin信號是調(diào)節(jié)小腸干細胞微環(huán)境的主要信號，在小腸干細胞數(shù)量控制中起決定性作用。β-catenin作為Wnt/β-catenin信號的核心成分，其在細胞內(nèi)水平的高低決定Wnt/β-catenin信號的傳導(dǎo)，Wnt/β-catenin信號通過磷酸化的Disheveled蛋白將信號傳至細胞內(nèi)，抑制GSK-3β功能，促進β-catenin釋放，進入細胞核進而啟動一系列與干細胞增殖相關(guān)的基因表達。小腸干細胞具有旺盛的增殖分化功能，在異常刺激下可過度增殖分化。最新研究表明高脂飲食使得小腸干細胞的數(shù)量增加，也能夠生成一群類似于干細胞的細胞，致其無限制的增殖并分化為其他類型的細胞，進而導(dǎo)致腸道腫瘤。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

竹節(jié)參皂苷Ⅳa(Chikusetsu SaponinⅣa，CSⅣa)對小腸干細胞是否有調(diào)節(jié)作用尚不清楚，本發(fā)明應(yīng)用高脂飼料建立高脂飲食小鼠模型，探討高脂飲食小鼠小腸干細胞數(shù)量及增殖分化功能的變化，并進一步研究了其微環(huán)境Wnt/β-catenin信號通路的變化及竹節(jié)參皂苷Ⅳa對上述改變的調(diào)節(jié)作用。

材料與儀器

實驗動物 雌雄各半C57BL小鼠40只，購于三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2015-0018，分籠飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。

藥物與試劑 竹節(jié)參皂苷Ⅳa購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；一抗Bmi1，Abcam公司；PCNA，蘇州睿灜生物技術(shù)有限公司；β-catenin、GSK-3β，美國Cell Signaling technology公司；羊抗兔、兔抗鼠二抗，武漢科瑞生物技術(shù)有限公司；DAB試劑盒，邁新生物。

主要儀器 LEICA TP1020自動脫水機，LEICA EG1150H石蠟包埋機，LEICA EG1150C超薄切片機，德國Leica公司；CS-V1攤片烤片機，湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司；CX41光學(xué)倒置顯微鏡，日本Olympus公司；JA2003電子分析天平，上海天平儀器廠。

方法

動物分組、造模及給藥取雌雄各半C57BL小鼠40只，4-6周齡，隨機分成4組，每組10只，即正常對照組，高脂飲食模型對照組，竹節(jié)參皂苷Ⅳa低(10mg/kg)、高(20mg/kg)劑量組。除正常對照組給予普通飼料外，其余各組均給予高脂飼料造模，同時竹節(jié)參皂苷Ⅳa低、高劑量組分別給予10mg/kg、20mg/kg的竹節(jié)參皂苷Ⅳa灌胃，每日一次，持續(xù)12w。

HE染色 小鼠腹腔注射給予350mg/kg水合氯醛麻醉后行心臟灌注，快速分離腸道組織截取3～5cm中段空腸，置于4％多聚甲醛固定24h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制備厚4μm連續(xù)橫斷切片，隔5張取1張。切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，伊紅染色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。每組隨機選取5只小鼠，每只小鼠小腸各取5張不連續(xù)切片，每張切片選取5根最長且柱狀細胞排列整齊的腸絨毛，光學(xué)顯微鏡下觀察不同組別小腸形態(tài)學(xué)變化，測量絨毛長度，隱窩深度，并計算絨毛/隱窩值(V/C值)。

PAS染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，1％高碘酸染色10min，schiff試劑避光反應(yīng)15min，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每組隨機選取5只小鼠，每只小鼠小腸各取5張不連續(xù)切片，每張切片中選取5根最長且柱狀細胞排列整齊的腸絨毛，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)不同組每100個腸黏膜柱狀上皮細胞間的杯狀細胞的數(shù)量。

免疫組織化學(xué)染色 從各組中分別選取三只小鼠進行免疫組化研究，快速分離腸道組織截取3～5cm中段空腸，4％多聚甲醛灌注固定后常規(guī)脫水，石蠟包埋，制備厚4μm連續(xù)橫斷切片，防脫載玻片貼片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。檸檬酸鹽緩沖液水浴修復(fù)30min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次5min，3％H₂O₂室溫孵育10min，PBS沖洗3次，每次5min，血清封閉1h，加一抗4℃冰箱孵育過夜，復(fù)溫20min，PBS沖洗3次，每次5min，加二抗室溫孵育1h，PBS沖洗3次，每次5min，DAB反應(yīng)顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察結(jié)果、拍照并用圖像分析系統(tǒng)進行分析。

統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件分析，IHC數(shù)據(jù)采用Image-Pro Plus6.0軟件分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

附圖說明

圖1為竹節(jié)參皂苷Ⅳa對小腸形態(tài)學(xué)的影響(×100)，a：正常組b：模型組c：竹節(jié)參皂苷Ⅳa低劑量組(10mg/kg)d：竹節(jié)參皂苷Ⅳa高劑量組(20mg/kg)與正常組比較，^*P﹤0.05；與模型組比較，^##P﹤0.01。

圖2為竹節(jié)參皂苷Ⅳa對小腸干細胞增殖的影響(×400)，a：正常組b：模型組c：竹節(jié)參皂苷Ⅳa低劑量組(10mg/kg)d：竹節(jié)參皂苷Ⅳa高劑量組(20mg/kg)，與正常組比較，^**P﹤0.01；與模型組比較，^##P﹤0.01。

圖3為竹節(jié)參皂苷Ⅳa對小腸杯狀細胞數(shù)量的影響(×200.)，a：正常組b：模型組c：竹節(jié)參皂苷Ⅳa低劑量組(10mg/kg)d：竹節(jié)參皂苷Ⅳa高劑量組(20mg/kg)，與正常組比較，^**P﹤0.01；與模型組比較，^#P﹤0.05,^##P﹤0.01。

圖4為竹節(jié)參皂苷Ⅳa對小腸干細胞數(shù)量的影響(×400)，a：正常組b：模型組c：竹節(jié)參皂苷Ⅳa低劑量組(10mg/kg)d：竹節(jié)參皂苷Ⅳa高劑量組(20mg/kg)，與正常組比較，^**P﹤0.01；與模型組比較，^##P﹤0.01。

圖5為竹節(jié)參皂苷Ⅳa對β-catenin表達量的影響(×400)，a：正常組b：模型組c：竹節(jié)參皂苷Ⅳa低劑量組(10mg/kg)d：竹節(jié)參皂苷Ⅳa高劑量組(20mg/kg)，與正常組比較，^**P﹤0.01；與模型組比較，^##P﹤0.01。

圖6.竹節(jié)參皂苷Ⅳa對GSK-3β表達量的的影響(×400)，注：a：正常組b：模型組c：竹節(jié)參皂苷Ⅳa低劑量組(10mg/kg)d：竹節(jié)參皂苷Ⅳa高劑量組(20mg/kg)與正常組比較，^**P﹤0.01；與模型組比較，^##P﹤0.01。

具體實施方式

竹節(jié)參皂苷Ⅳa對高脂飲食小鼠小腸形態(tài)學(xué)的影響

結(jié)果如圖1所示，正常對照組小鼠小腸絨毛呈細指狀，排列較寬松，高脂模型組小鼠小腸絨毛明顯變長變粗，排列緊密且不規(guī)則。給予竹節(jié)參皂苷Ⅳa保護后，與高脂模型組比較，小鼠絨毛長度及排布情況都有所改善。利用Image-Pro Plus 6.0軟件測量小腸絨毛長度、隱窩深度、計算V/C值。結(jié)果表明，高脂模型組與正常對照組比較，小腸絨毛長度和V/C值均增高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)，但隱窩深度無明顯變化。給予竹節(jié)參皂苷Ⅳa后，與高脂模型組比較，高劑量組和低劑量組絨毛長度均有所降低，但僅中劑量有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，V/C值有所降低，但隱窩深度無明顯變化。

竹節(jié)參皂苷Ⅳa對高脂飲食小鼠小腸增殖能力的調(diào)節(jié)作用

結(jié)果如圖2所示，與正常對照組比較，高脂模型組小腸隱窩處PCNA陽性細胞數(shù)量顯著增高(P<0.01)，給予竹節(jié)參皂苷Ⅳa保護后，與高脂模型組比較，高劑量組和低劑量組陽性細胞數(shù)量均顯著降低(P<0.01)。

竹節(jié)參皂苷Ⅳa對高脂飲食小鼠小腸杯狀細胞數(shù)量的調(diào)節(jié)作用

結(jié)果如圖3所示，與正常對照組比較，高脂模型組杯狀細胞數(shù)量顯著上升(P<0.01)。給予竹節(jié)參皂苷Ⅳa保護后，與高脂模型組比較，高劑量組杯狀細胞數(shù)量顯著降低(P<0.01)，低劑量組杯狀細胞數(shù)量有所降低且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

竹節(jié)參皂苷Ⅳa對高脂飲食小鼠小腸干細胞數(shù)量的影響

Bmi1是ISCs特異性的標(biāo)記物。結(jié)果如圖2所示，與正常對照組比較，高脂模型組小腸隱窩處Bmi1陽性細胞數(shù)量顯著增多(P<0.01)，給予竹節(jié)參皂苷Ⅳa保護后，與高脂模型組比較，高劑量組和低劑量組的Bmi1陽性細胞數(shù)量均顯著降低(P<0.01)。

竹節(jié)參皂苷Ⅳa對Wnt/β-catenin信號的調(diào)節(jié)

β-catenin免疫組化染色結(jié)果如圖5所示，與正常對照組比較，高脂飲食模型組β-catenin的表達量顯著增高(P<0.01)，給予竹節(jié)參皂苷Ⅳa保護后，與高脂模型組比較，高劑量組和低劑量組的表達量均顯著降低(P<0.01)。GSK-3β免疫組化染色結(jié)果如圖6所示，與正常對照組比較，高脂飲食模型組GSK-3β的表達量顯著降低(P<0.01)給予竹節(jié)參皂苷Ⅳa保護后，與高脂模型組比較，高劑量組和低劑量組的表達量均顯著增高(P<0.01)。