本發(fā)明屬于植物活性物質(zhì)提取、加工領(lǐng)域，具體涉及一種薏米多酚提取方法。

背景技術(shù)：

薏米是一種藥食兩用的健康食品，在中國、印度、日本等東南亞國家多有種植（LEE，2008）。作為食品，薏米營養(yǎng)豐富，易于消化，含有豐富的維生素、礦物質(zhì)等，被譽(yù)為“世界禾本科植物之王”。作為藥品，薏米可除痹止瀉，健脾滲濕，清熱排膿，許多現(xiàn)代研究表明，薏米具有降血糖、降血壓、抗腫瘤、抗敏感等藥理活性。薏米的攝入能促進(jìn)人體的健康，提高人體機(jī)能（Hidaka，1992；Huang，1999；Hsu，2003）。薏米的這些生理功能主要得益于其所含的豐富的植物化學(xué)物質(zhì)：多酚類、黃酮類、維生素、纖維素、礦物質(zhì)等（Poutanen,K（2012）Past and future of cereal grains as food for health.Trends Food Sci.Technol,25,58-62.）。植物多酚是廣泛存在于植物體內(nèi)的重要次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)肝臟等多種生理功能。研究表明薏米中多酚的含量豐富（王立峰（2012）薏米中多酚類物質(zhì)對抗氧化、抗腫瘤和降血脂作用的評價(jià)研究[D].博士論文,江南大學(xué),無錫.），如何提高薏米中多酚的提取率是值得被研究的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種以薏米為原料，通過溶劑法提取獲得薏米多酚的方法。

所述的一種薏米中多酚提取物的提取分離方法，按照下述步驟進(jìn)行：

（1）薏米仁粉碎，過60~100目篩，薏米粉經(jīng)石油醚震蕩脫脂后，用濾紙過濾除去脂類，殘?jiān)捎孟嗤姆椒ㄖ貜?fù)脫脂3次，將脫脂薏米粉烘干，保存在-20℃冰箱；

（2）用20-100%的甲醇、乙醇和丙酮溶液對上述薏米粉末進(jìn)行浸提，浸提樣品和溶液的質(zhì)量體積比為1:10-30（g/mL），用恒溫?fù)u床避光，40~80℃勻速浸提，每次浸提時(shí)間為20-100分鐘，提取次數(shù)為1-5次，用離心機(jī)離心后分離出上清液即為薏米多酚提取液。

（3）將離心后的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。用蒸餾水溶解旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的多酚粗提液，在冷凍干燥機(jī)里凍干12~24h，溫度為-70~-90℃，得到薏米多酚粉末。

所述的步驟（2）中：優(yōu)選80%濃度的丙酮溶劑對薏米多酚進(jìn)行提取。

所述的步驟（2）中：優(yōu)選60℃恒溫?fù)u床浸提對薏米多酚進(jìn)行提取。

所述的步驟（2）中：優(yōu)選樣品溶液的質(zhì)量體積比（料液比）為1：25（g/mL）對薏米多酚進(jìn)行提取。

所述的步驟（2）中：優(yōu)選浸提時(shí)間80分鐘對薏米多酚進(jìn)行提取。

按照本發(fā)明方法獲得的薏米多酚的含量為30-40mg/100g。

本發(fā)明還公開了通過上述提取方法制備得到的薏米多酚提取物，其中包含質(zhì)量分?jǐn)?shù)如下的酚類化合物：

N1,N5-雙(對香豆酰)亞精胺，1.01%；

對香豆酸，0.17%；

阿魏酸，0.21%；

蘆丁，0.12%。

其中所述的，N1,N5-雙(對香豆酰)亞精胺的結(jié)構(gòu)式為：

其中所述的，對香豆酸的結(jié)構(gòu)式為：

其中所述的，阿魏酸的結(jié)構(gòu)式為：

其中所述的，蘆丁的結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明制備的薏米多酚為天然提取物，是天然的抗氧化劑，具有增強(qiáng)免疫功能，降血壓降血脂，抗腫瘤抗炎等功效。

2.利用80%濃度的丙酮溶劑提取，其薏米多酚的濃度較大，即提取效率高。

3.利用凍干將薏米多酚粗提液制成粉末，低溫凍干有利于提高薏米多酚的活性以及后續(xù)保存，并且有利于稱取以及實(shí)驗(yàn)定量的需求。

4.本方法操作簡單，適合提升薏米的綜合利用率，提升其附加價(jià)值，將其生產(chǎn)鏈延長，具有廣闊的市場前景。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1通過冷凍干燥所得薏米多酚粉末進(jìn)樣液相圖；

圖2為對比例1通過熱風(fēng)干燥所得薏米多酚粉末進(jìn)樣液相圖；

圖3為N1,N5-雙(對香豆酰)亞精胺的液相圖；

圖4為N1,N5-雙(對香豆酰)亞精胺的質(zhì)譜圖；

圖5為對香豆酸的液相圖；

圖6為對香豆酸的質(zhì)譜圖；

圖7為阿魏酸的液相圖；

圖8為阿魏酸的質(zhì)譜圖；

圖9為蘆丁的液相圖；

圖10為蘆丁的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：

1）原料預(yù)處理：薏米仁粉碎，過60~100目篩，薏米粉經(jīng)石油醚震蕩脫脂后，用濾紙過濾除去脂類，殘?jiān)捎孟嗤姆椒ㄖ貜?fù)脫脂3次，將脫脂薏米粉烘干，保存在-20℃冰箱中；2)加入浸提溶劑：按料液比1：25加入體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮溶液與薏米粉末混合；3)振蕩提取：將混合漿液置于60℃的恒溫振蕩箱浸提80分鐘，提取1-5次；4)離心；5)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)：將離心后的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。6）凍干：用蒸餾水溶解旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的多酚粗提液，在冷凍干燥機(jī)里凍干12h，溫度為-90℃，得到薏米多酚粉末。測量其多酚濃度為36.52mg/100g。

所述的測多酚含量的方法為福林酚法：取1mg樣品溶于1mL 70%的甲醇水溶液；取100μL樣品溶液 (或沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液) 與400μL去離子水混合，接著與0.1mL的福林酚溶液混合，在避光條件下放置5-8分鐘；再與1 mL 7%的碳酸鈉溶液和0.8mL的去離子水混合，在室溫下避光反應(yīng)90min。將200μL最終反應(yīng)溶液添加到96孔板中，使用酶標(biāo)儀在760nm處測定吸光度。計(jì)算多酚含量。

對比例1：

采用與實(shí)施例1相同的方法提取薏米多酚，僅將冷凍干燥改變?yōu)闊犸L(fēng)干燥。測量其多酚濃度為26.22mg/100g。

實(shí)施例2：

1)原料預(yù)處理：磨粉，脫脂；2)加入浸提溶劑：按料液比1：10加入體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液與薏米粉末混合；3)振蕩提?。簩⒒旌蠞{液置于40℃的恒溫振蕩箱浸提100分鐘；4)離心；5)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)：將離心后的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。6）凍干：用蒸餾水溶解旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的多酚粗提液，在冷凍干燥機(jī)里凍干24h，溫度為-70℃，得到薏米多酚粉末。測量其多酚濃度為32.08mg/100g。

對比例2：

采用與實(shí)施例2相同的方法提取薏米多酚，僅將冷凍干燥改變?yōu)闊犸L(fēng)干燥。測量其多酚濃度為23.25mg/100g。

實(shí)施例3：

1)原料預(yù)處理：磨粉，脫脂；2)加入浸提溶劑：按料液比1：30加入體積分?jǐn)?shù)為60%的丙酮溶液與薏米粉末混合；3)振蕩提?。簩⒒旌蠞{液置于80℃的恒溫振蕩箱浸提20分鐘；4)離心；5)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)：將離心后的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。6）凍干：用蒸餾水溶解旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的多酚粗提液，在冷凍干燥機(jī)里凍干18h，溫度為-80℃，得到薏米多酚粉末。測量其多酚濃度為32.34mg/100g。

對比例3：

采用與實(shí)施例3相同的方法提取薏米多酚，僅將冷凍干燥改變?yōu)闊犸L(fēng)干燥。測量其多酚濃度為23.92mg/100g。

實(shí)施例4：

1)原料預(yù)處理：磨粉，脫脂；2)加入浸提溶劑：按一定的料液比1：25加入體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇溶液與薏米粉末混合；3)振蕩提?。簩⒒旌蠞{液置于40℃的恒溫振蕩箱浸提80分鐘；4)離心；5)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)：將離心后的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。6）凍干：用蒸餾水溶解旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的多酚粗提液，在冷凍干燥機(jī)里凍干15h，溫度為-90℃，得到薏米多酚粉末。測量其多酚濃度為33.29mg/100g。

對比例4：

采用與實(shí)施例4相同的方法提取薏米多酚，僅將冷凍干燥改變?yōu)闊犸L(fēng)干燥。測量其多酚濃度為24.51mg/100g。

實(shí)施例5：

1)原料預(yù)處理：磨粉，脫脂；2)加入浸提溶劑：按料液比1：15加入體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮溶液與薏米粉末混合；3)振蕩提?。簩⒒旌蠞{液置于60℃的恒溫振蕩箱浸提80分鐘；4)離心；5)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)：將離心后的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。6）凍干：用蒸餾水溶解旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的多酚粗提液，在冷凍干燥機(jī)里凍干20h，溫度為-70℃，得到薏米多酚粉末。測量其總酚濃度為35.13mg/100g。

對比例5：

采用與實(shí)施例5相同的方法提取薏米多酚，僅將冷凍干燥改變?yōu)闊犸L(fēng)干燥。測量其多酚濃度為25.45mg/100g。

實(shí)施例6：

1)原料預(yù)處理：磨粉，脫脂；2)加入浸提溶劑：按料液比1：20加入體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇溶液與薏米粉末混合；3)振蕩提?。簩⒒旌蠞{液置于60℃的恒溫振蕩箱浸提50分鐘；4)離心；5)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)：將離心后的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，除去溶劑，得到多酚粗提液。6）凍干：用蒸餾水溶解旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的多酚粗提液，在冷凍干燥機(jī)里凍干22h，溫度為-90℃，得到薏米多酚粉末。測量其總酚濃度為30.87mg/100g。

對比例6：

采用與實(shí)施例6相同的方法提取薏米多酚，僅將冷凍干燥改變?yōu)闊犸L(fēng)干燥。測量其多酚濃度為21.78mg/100g。

對上述制備得到的薏米多酚進(jìn)行測試：將相同質(zhì)量的實(shí)施例1和對比例1制備得到的薏米多酚粉末溶于甲醇，過膜后分別進(jìn)樣，以甲醇和水作為洗脫劑。冷凍干燥的液相圖見附圖圖1，熱風(fēng)干燥的液相圖見附圖圖2。通過對比可知，冷凍干燥所得的薏米多酚種類多且濃度高，而通過熱風(fēng)干燥所得薏米多酚品質(zhì)不如前者。說明通冷凍干燥法所得薏米多酚品質(zhì)更好。

通過上述實(shí)例可知，實(shí)施例1方法提取的薏米多酚其多酚濃度高，有利于薏米多酚的充分提取。以下將對實(shí)施例1中獲得的薏米多酚粗提物進(jìn)行分離純化，并鑒定各純化物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以便進(jìn)一步研究各純化物的生理活性。

將上述實(shí)施例制備得到的薏米多酚粉末溶于去離子水中，先后用石油醚和正丁醇分別萃取三次，凍干，得正丁醇相和水相。

正丁醇相溶于80%的乙醇溶液，過0.45 μm濾膜。洗脫液為80%的乙醇溶液，恒流泵的流速為40 mL/h，紫外吸收波長為280 nm，用自動(dòng)收集器每10ml收集一管餾分。將所需餾分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥得三種薏米多酚純化物亞組分（亞組分一、亞組分二和亞組分三），亞組分一主要為雜質(zhì)，不再純化。

亞組分二和亞組分三采用半制備RP-HPLC進(jìn)一步分離純化。制備柱采用Waters C18 制備柱(10 μm，19 mm×250 mm)，柱溫為30℃。流動(dòng)相A相為水溶液，B相為乙腈，進(jìn)行梯度洗脫。樣品溶于甲醇，進(jìn)樣前需過0.22 μm濾膜，濃度為10 mg/ml，單次進(jìn)樣100 μL，最佳吸收波長設(shè)置為280 nm。制得四種薏米多酚純化物。

液質(zhì)聯(lián)用結(jié)合核磁共振譜的手段測定這四種化合物的結(jié)構(gòu)。四種酚類化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)鑒定分別是N1,N5-雙(對香豆酰)亞精胺、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁。四種酚類化合物的液相圖、質(zhì)譜圖如附圖3~10所示。值得注意的是，N1,N5-雙(對香豆酰)亞精胺首次在薏米中分離并鑒定。

功效實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充：分別測試四種純化酚類化合物對人體肝癌HepG2腫瘤細(xì)胞、人體乳腺癌MCF-7腫瘤細(xì)胞和人體結(jié)腸癌Caco-2腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤能力采用MTT法分析。薏米多酚純化物對HepG-2，MCF-7和CaCo-2三種腫瘤細(xì)胞的抑制作用見表1。

表1 薏米多酚純化合物對HepG-2，MCF-7和CaCo-2三種腫瘤細(xì)胞的抑制作用

表1顯示了N1,N5-雙(對香豆酰)亞精胺、對香豆酸、阿魏酸和蘆丁的抗腫瘤IC50值，從結(jié)果可以看出，N1,N5-雙(對香豆酰)亞精胺對三種腫瘤細(xì)胞的抗增殖能力均高于其他三種化合物，IC50值分別為46.34±3.99，61.52±6.02和92.69±5.63 μg/mL。其他依次為對香豆酸（IC50值分別為105.06 ± 7.64，118.84 ± 10.86和131.06 ± 9.07 μg/mL），阿魏酸（IC50值分別為126.60 ± 10.86，147.38 ± 14.04和192.76 ± 11.80 μg/mL），而蘆丁沒有展現(xiàn)出抗腫瘤能力。N1,N5-雙(對香豆酰)亞精胺、對香豆酸和阿魏酸對三種腫瘤細(xì)胞均呈現(xiàn)出抗增殖的量效關(guān)系。此外，對于三種腫瘤細(xì)胞而言，HepG2 肝癌細(xì)胞比MCF-7乳腺癌細(xì)胞和Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞對薏米多酚更為敏感。因此，N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺、對香豆酸和阿魏酸是薏米多酚提取物中主要的抗腫瘤成分。