本發(fā)明涉及一種果膠組合物,以及該組合物的醫(yī)藥和食品用途,屬于醫(yī)藥食品領(lǐng)域。
背景技術(shù):
抗老化與抑制癌原發(fā)生是人們關(guān)注的熱點(diǎn),因此相關(guān)素材及產(chǎn)品研發(fā)是健康產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的亮點(diǎn)。抗老化與抗氧化活性密切相關(guān),具有優(yōu)異高抗氧化活性的天然活性成份包括酚酸類、類黃酮、萜烯類、葉綠素類、茄紅素、維生素C和E等,這些成分常見于蔬菜水果及傳統(tǒng)中草藥的提取物中。
許多體外與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果已發(fā)現(xiàn),這些具高抗氧化活性的天然成份常具有優(yōu)良的抑制癌細(xì)胞生長或促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的效果,對(duì)膳食預(yù)防腸胃相關(guān)癌癥,尤其是大腸癌相當(dāng)重要。但這些高抗氧化活性物具有含量低、化學(xué)反應(yīng)性高、穩(wěn)定性差、不容易保存等諸多缺點(diǎn)。另一問題是,這些高抗氧化活性物的常見提取方式大都是醇類水溶液萃取、層析技術(shù)配合低極性溶劑(如乙酰乙酯)沖提純化,所得產(chǎn)物并不代表原來食物中抗氧化活性成份分布,其活性功效已與天然食物復(fù)方的功效大不相同。
果膠多糖為通認(rèn)為安全(GRAS級(jí))的天然食品材料,常應(yīng)用于食品、化妝保養(yǎng)品與醫(yī)藥領(lǐng)域,具有多樣化的功能(如凝膠性、粘稠性、穩(wěn)定性性、增稠性等)及多種膳食纖維所具有的的生理活性(如降低血液中膽固醇、降血脂、降血糖、預(yù)防便秘與大腸癌發(fā)生等活性)。果膠多糖的優(yōu)點(diǎn)是具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性,應(yīng)用廣泛且量多,是膳食纖維主要成份,建議每人每日攝取膳食纖維量25-35克。但缺點(diǎn):抗氧化活性低、抑制人類腸癌細(xì)胞活性低也是很明顯的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明就是為了盡量避免單純的果膠多糖的上述缺點(diǎn),給出了一種穩(wěn)定性高的的高抗氧化活性,并且高抗人類腸腺癌細(xì)胞活性的果膠多糖組合物。
由于,直接組合天然未處理的果膠多糖及高活性植物活性成分時(shí),容易反應(yīng)不足或過度,造成組合物沉淀、溶解度不佳、活性降低的問題。本發(fā)明給出的制備上述的果膠組合物的方法的關(guān)鍵點(diǎn)在于選擇具有高活性成份、關(guān)鍵活性結(jié)構(gòu)和分子量的植物,并且建立植物提取物與果膠活性成份間的酯化反應(yīng)的技術(shù)條件,從而制備高活性果膠組合物。為此,發(fā)明人經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)探索和無數(shù)次創(chuàng)造性配方組合嘗試,最終,發(fā)現(xiàn)景天科植物提取物為最佳組合材料。
景天科(Crassulaceae)植物包括紅景天屬(Rhodiola spp.)、風(fēng)車草屬(別名石蓮花屬)(Graptopetalum spp.)、景天屬(Sedum spp.)、擬石蓮花屬(Echeveria spp.)、厚葉草屬(Pachyphytum spp.)、青鎖龍屬(別名肉葉草屬)(Crassula spp.)、蓮花掌屬(Aeonium spp.)、長生草屬(Sempervivum spp.)、伽藍(lán)菜屬(Kalanchoe spp.)、落地生根屬(Bryophyllum spp.)、銀波錦屬(Cotyledon spp.)、瓦松屬(Orostachys spp.)…等十多屬,為世界各國傳統(tǒng)草藥。其葉、根或莖部份的提取物含有豐富的酚酸類、類黃酮、萜烯類、生物堿等高抗氧化和抑制癌細(xì)胞的活性植化物、以及果膠分子。以國內(nèi)常見且研究較多如紅景天和石蓮花,其提取物的生物活性多,體外細(xì)胞、及體內(nèi)動(dòng)物或人體實(shí)驗(yàn)成果顯示,具有優(yōu)良的抗氧化、抗疲勞、激活抗氧化酶、抑制肝損傷、保肝、抗腫瘤、抑制人類腸腺癌細(xì)胞、及降血脂等活性。
另外,本發(fā)明還提供了一種含有上述的果膠組合物的抗大腸腺細(xì)胞的藥物和含有果膠組合物的保健食品。
一種果膠組合物,其特征在于,包括果膠多糖和景天科植物提取物,景天科植物提取物為水的提取物或水/醇類混合溶劑的提取物。
本發(fā)明的果膠組合物,還可以具有這樣的特征,其特征在于還包括:任意一種或多種的強(qiáng)化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、調(diào)整劑、水活性控制劑。
本發(fā)明的果膠組合物,還可以具有這樣的特征,其特征在于:其中,強(qiáng)化劑為沒食子酸、阿魏酸、異抗壞血酸、氨基酸中的任意一種,穩(wěn)定劑為葡萄糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇、木糖醇、海藻糖、葡萄糖脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯中的任意一種或多種的混合物,分散劑為麥芽糊精、淀粉水解物、阿拉伯膠、多糖、食用級(jí)硅化合物中的任意一種或多種的混合物,調(diào)整劑為氯化鹽類、磷酸鹽類、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣中的任意一種或多種的混合物,水活性控制劑為醇類、糖醇類、氨基酸類、脂肪酸類中的任意一種或多種的混合物。
本發(fā)明的果膠組合物,還可以具有這樣的特征,其特征在于:其中,果膠多糖為高甲氧基果膠多糖、低甲氧基果膠多糖、熱處理的高甲氧基果膠多糖、熱處理的低甲氧基果膠多糖、經(jīng)酸或堿處理的高甲氧基果膠多糖、經(jīng)酸或堿處理的低甲氧基果膠多糖、經(jīng)超聲波處理的高甲氧基果膠多糖、經(jīng)超聲波處理的低甲氧基果膠多糖、經(jīng)微波處理的高甲氧基果膠多糖、經(jīng)微波處理的低甲氧基果膠多糖、酶修飾的高甲氧基果膠多糖、酶修飾的低甲氧基果膠多糖中的任意一種或多種的混合物。
本發(fā)明的果膠組合物,還可以具有這樣的特征,其特征在于:其中,果膠多糖的分子量為1kDa~10kDa或大于10kDa,景天科植物提取物的分子量為200Da~10kDa或大于10kDa。
本發(fā)明的果膠組合物,還可以具有這樣的特征,其特征在于:其中,果膠多糖與景天科植物提取物的質(zhì)量比為100:1~1:100。
本發(fā)明還提供一種制備上述的果膠組合物的方法,其特征在于,包括以下步驟:
步驟一,配制果膠多糖和景天科植物提取物的混合水溶液;
步驟二,50-130℃加熱混合水溶液1分鐘至12小時(shí)得到反應(yīng)物;
步驟三,收集反應(yīng)物并干燥,所得干燥物即為果膠組合物。
本發(fā)明的果膠組合物的制備方法,還可以具有這樣的特征,其特征在于:其中,步驟一中的混合溶液是經(jīng)過pH調(diào)整的,pH調(diào)整后的pH值為2-5為9-13,步驟二中混合水溶液添加有任意一種或多種的強(qiáng)化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、調(diào)整劑、水活性控制劑。
本發(fā)明還提供一種抗腸腺癌細(xì)胞的藥物,其特征在于含有上述的果膠組合物。
本發(fā)明還提供一種食品,其特征在于含有上述的果膠組合物和膳食纖維。
發(fā)明作用與效果
本發(fā)明所提供的果膠組合物,使用天然食品的安全制備的條件,在食品加工過程原位狀態(tài)下,制備得到了具有高抗人類腸腺癌細(xì)胞的活性,且穩(wěn)定的的果膠多糖與景天科植物提取物的組合物。
本發(fā)明所提供的果膠組合物的制備方法,制備得到了天然具有高抗人類腸腺癌細(xì)胞的果膠多糖組合物,該組合物克服了原來果膠多糖及植物提取物在物理化學(xué)及功能性上的缺點(diǎn),更適合于使用。
本發(fā)明所提供的果膠組合物的制備方法,避免傳統(tǒng)有機(jī)化學(xué)反應(yīng)技術(shù)的許多缺點(diǎn):不易控制反應(yīng)程度、使用有毒溶劑、反應(yīng)產(chǎn)物不可于食品加工、對(duì)生態(tài)環(huán)境有污染危害、化學(xué)反應(yīng)設(shè)備不能利用食品加工設(shè)備須另行設(shè)置、化學(xué)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)場所須特別設(shè)置與嚴(yán)格規(guī)范、較高的制備成本等缺點(diǎn),因而具有制備過程安全無毒、產(chǎn)物為食品級(jí)產(chǎn)物、較低制備成本、可應(yīng)用食品加工過程原位狀態(tài)下進(jìn)行組合反應(yīng),制備高抗人類腸腺癌細(xì)胞的活性的果膠多糖組合物。
附圖說明
圖1為石蓮花葉熱水提取物的照片;
圖2為石蓮花葉42%乙醇水溶液提取物的照片
圖3是石蓮大分子提取物GWE、高甲氧基果膠HMP、經(jīng)果膠酶處理的果膠與石蓮的中分子提取物的組合物HMP-EF1的抗人類腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)的抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
一種具有高抗人類腸腺癌活性的果膠多糖組合物,該組合物由果膠多糖和景天科植物提取物組成,其中,
果膠多糖采用各種來源的高、低甲氧基果膠多糖及其熱、化學(xué)性(酸、堿)、物理性(超聲波、微波處理等)和酶等修飾的制備物或某分子量區(qū)段的混合物及純化物。
景天科植物采用景天科植物的葉、莖及根的總提取物或某分子量區(qū)段的混合物。
上述組合物在進(jìn)行原位標(biāo)靶式反應(yīng)時(shí),按照果膠多糖和景天科植物提取物的質(zhì)量比范圍為100:1至1:100進(jìn)行投料混合。
具有高抗人類腸腺癌活性的果膠多糖組合物的制備方法,其特征在于包括以下步驟:
1)制備不同分子量和結(jié)構(gòu)特征的果膠多糖。
2)制備景天科植物的提取物、或進(jìn)一步從提取物中分離得到某分子量區(qū)段的混合物。
3)將果膠多糖與景天科植物提取物組合物,在溶液狀態(tài)、膠態(tài)及固態(tài)下,不添加或添加強(qiáng)化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、調(diào)整劑、水活性控制劑等任一情況下,施予反應(yīng)條件(包括加熱、加酸、加堿、超音波、微波、酶及發(fā)酵處理等任一項(xiàng)),收集并干燥得到制備物,該制備物經(jīng)過均質(zhì)或不均質(zhì)處理。
強(qiáng)化劑包括沒食子酸、阿魏酸、異抗壞血酸、胺基酸類等任一項(xiàng)。
穩(wěn)定劑包括葡萄糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇、木糖醇、海藻糖、葡萄糖脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯及其他相關(guān)他合物等任一種或多種。
分散劑包括麥芽糊精、淀粉水解物、阿拉伯膠及其他多糖、食用級(jí)硅化合物等任一種或多種。
調(diào)整劑包括:氯化鹽類、磷酸鹽類、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、鉀、鈣等任一種或多種。
水活性控制劑:醇類(乙醇或丙醇)、糖醇類、胺基酸類、脂肪酸類等及其衍生物。
對(duì)富集目標(biāo)功能活性的組合物的分離、純化得到某分子量區(qū)段的混合物及純化物的方法包括醇類溶劑沉降、鹽類沉降、離子層析、親水性或疏水性層析、膠濾層析、分子篩層析、活性碳吸附性層析、膜分離、膜透析。
果膠多糖的制備
高甲氧基果膠多糖、低甲氧基果膠多糖可提取自天然蔬菜水果,或購買自市售多糖膠質(zhì)商品。其中,凡分子量太高或粘度太高或凝膠性太高、溶易沉淀不易進(jìn)行反應(yīng)者,須進(jìn)行特定改質(zhì)、某分子量區(qū)段的混合物分離及富集處理。
本發(fā)明所采果膠多糖,改質(zhì)目標(biāo)為控制多糖分子量在1000-100k范圍,依不同果膠多糖種類而異。改質(zhì)方法可采用的降解包括熱降解、酸降解、超聲波及微波降解、以及酶降解法中的任意一種,根據(jù)需要而定。
景天科植物的提取物制備
取景天科植物材料,使用水和醇類混合溶液(醇類濃度為0-95%)提取,不加熱或加熱,收集提取液不經(jīng)或經(jīng)下列分離純化工藝處理得到總提取物、某分子量區(qū)段的混合物或純化物。處理純化方法包括醇類溶劑沉降法、鹽類離子性沉降法、離子吸附或交換層析法。膠體過濾層析法、分子篩析層析法、活性炭吸附性層析法、膜分離法、電氣泳動(dòng)法、膜透析法。
下面的實(shí)施例以高甲氧基果膠多糖、石蓮提取物為例來具體說明。
步驟1果膠多糖改質(zhì)物的制備
高甲氧基果膠多糖購買自市售多糖膠質(zhì)商品,并通過下列的方法進(jìn)行改質(zhì)出來:
1)熱降解法:取果膠多醣樣品100g溶于10公升去離子水中(即重量百分比為1%w/w),加熱攪拌至完全溶解(70℃,2小時(shí)),加熱(90-130℃,10分鐘至6小時(shí)),流水冷卻、經(jīng)膜分離技術(shù)收集特定分子量區(qū)段的混合物、真空干燥或冷凍干燥而得。
2)酸降解法:取果膠多醣樣品100g溶于10公升去離子水中(1%w/w),加熱攪拌至完全溶解(70℃、2小時(shí)),加入10公升0.001-2mol/L鹽酸或硫酸溶液,水解1分鐘至12小時(shí)后,加入10公升0.001-2mol/L氫氧化鈉或氫氧化鉀水溶液中和,經(jīng)膜分離技術(shù)脫鹽并收集特定目標(biāo)分子量區(qū)段的混合物、真空干燥或冷凍干燥而得。
3)酶降解法:針對(duì)果膠類分子進(jìn)行酶修飾,選擇性制備具有特定的第一類的鼠李糖半乳糖醛酸結(jié)構(gòu)片段(簡稱為RG1),具有抑制人類腸腺癌細(xì)胞活性的活性鏈段。取高甲氧基果膠30g溶于3公升去離子水中(1%w/w),加熱攪拌至完全溶解(60℃,400rpm,1h),加入果膠內(nèi)切酶(1U/mL),50℃下作用1小時(shí)(溫和攪拌150rpm)后,加熱(95℃,20分鐘)使酵素失活,冷卻、離心(4500g,10分鐘)去除酵素蛋白,所收集的上清液即為酶降解物,經(jīng)膜分離技術(shù)收集特定目標(biāo)分子量區(qū)段的混合物、真空干燥或冷凍干燥而得。
步驟2果膠多糖特定分子量區(qū)段的混合物的制備
將果膠多糖修飾物溶液,經(jīng)離心(10000g,15min)后,收集上清液進(jìn)行抽氣過濾(Whatman No.4濾紙及0.22μm濾膜)以除去雜質(zhì),再以切向流超過濾膜(Millipore TFF系統(tǒng),分子量切(MWCO)),收集大分子(分子量>10kDa)及中分子(分子量1kDa-10kDa)的混合物,經(jīng)真空濃縮,真空干燥或冷凍干燥后用。
步驟3.景天科植物提取物的制備
采用景天科植物食用部位,例如石蓮花葉子和紅景天根。本實(shí)施例以石蓮葉的提取物為例,說明提取制備過程。
將石蓮葉洗凈,新鮮葉加水于果汁機(jī)打汁,或凍干葉后以粉碎機(jī)打碎后,加1-10倍水或乙醇水溶液(3-70%)混合,加熱提取1-6小時(shí),冷卻后去渣(以Whatman No.4濾紙過濾、或用濾布或壓榨過濾),不經(jīng)或再經(jīng)精濾處理,得粗提取液,直接真空濃縮后冷凍干燥,為石蓮總提取物(GWt)。
粗提取液經(jīng)切向流超過濾膜分離區(qū)分(Millipore TFF系統(tǒng),分子量切(MWCO)200Da及10kDa)區(qū)分,收集大分子(分子量>10kDa)及中分子(分子量200Da-10kDa)及小分子(分子量<200Da)的混合物,經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥后用。
另外,粗提取液加入2-3倍體積95%乙醇沉淀,以6000g離心15分鐘,收集沉淀物,經(jīng)冷凍干燥,為石蓮大分子提取物(GWE)。
石蓮花葉提取物外觀如圖1、2所示。不同景天科植物原料、不同提取條件及不同分子量區(qū)段的混合物、純化及干燥處理方法不同,所得產(chǎn)物外觀可能白色中帶淺灰、粉紅、淡黃、淡褐或淡綠,或呈褐色。
步驟4.果膠多糖-石蓮花提取物組合物的制備
采用果膠多糖特定分子量區(qū)段的混合物(分子量1kDa-10kDa或>10kDa)及景天科植物食用部位的提取物的區(qū)分物。本實(shí)施例以石蓮花葉子的提取物為例,說明組合制備過程。
果膠多糖特定分子量區(qū)段的混合物與石蓮花葉子提取物的特定分子量區(qū)段的混合物,在下列三種情況任一項(xiàng)下混合后進(jìn)行促酯化反應(yīng):
(1)提取過程中溶液狀態(tài)下混合;
(2)干燥狀態(tài)混合;
(3)干燥狀態(tài)先混合后加熱溶于水溶液中,或先各別溶于水溶液中后混合。
混合后兩者的質(zhì)量比范圍為100:1至1:100。不調(diào)整或調(diào)整pH值至2-5或9-13,進(jìn)行熱促處理(50-130℃反應(yīng)1分鐘至12小時(shí)),加熱設(shè)備可采用水浴鍋、二重釜、殺菌釜、管式加熱、微波加熱、超聲波中的任意一種,熱干燥采用烘箱、滾筒干燥、流動(dòng)床干燥、噴霧干燥中的任意一種或多種的結(jié)合,亦可利用生物反應(yīng)或發(fā)酵槽設(shè)備進(jìn)行反應(yīng)??稍诓惶砑踊虮匾獣r(shí)添加適量的強(qiáng)化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、調(diào)整劑、水活性控制劑等任一情況下施予反應(yīng)條件。最后收集產(chǎn)物并干燥,可以經(jīng)過均質(zhì)或不均質(zhì)處理。
強(qiáng)化劑為沒食子酸、阿魏酸、異抗壞血酸、氨基酸中的任意一種,穩(wěn)定劑為葡萄糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇、木糖醇、海藻糖、葡萄糖脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯中的任意一種或多種的混合物,分散劑為麥芽糊精、淀粉水解物、阿拉伯膠、多糖、食用級(jí)硅化合物中的任意一種或多種的混合物,調(diào)整劑為氯化鹽類、磷酸鹽類、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣中的任意一種或多種的混合物,水活性控制劑為醇類、糖醇類、氨基酸類、脂肪酸類中的任意一種或多種的混合物。
可對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物先行分離、按分子量大小區(qū)分及純化處理,以取得更高抗人類腸腺癌細(xì)胞或高抗氧化活性的特定分子量區(qū)段的混合物或純化物,處理技術(shù)包括醇類溶劑沉降、鹽類沉降、離子層析、親水性或疏水性層析、膠濾層析、分子篩層析、活性碳吸附性層析、膜分離、膜透析等任一項(xiàng)。其中,本實(shí)施例是采用膜分離處理,詳細(xì)條件如步驟2。
組合物作用與效果
人類大腸腺癌細(xì)胞抑制率測試:
所采人類腸腺癌(Caco-2)細(xì)胞為貼盤細(xì)胞,培養(yǎng)條件為37℃,5%CO2,以10cm培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)期間每兩天更換一次培養(yǎng)基或進(jìn)行分盤。細(xì)胞存活率分析采用MTT分析法(試劑為3-[4,5-dimethylthylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)。將人類腸腺癌(Caco-2)細(xì)胞活化后,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)器將細(xì)胞濃度調(diào)整為1x 105個(gè)/mL,取100μL細(xì)胞液加入96孔培養(yǎng)盤中,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察細(xì)胞長滿約90%(約24小時(shí)),吸除上清液(培養(yǎng)基),即可在每個(gè)孔中加入100μL的糖類樣品溶液,再于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí),加入MTT與培養(yǎng)基混合液(10μL/孔),于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中反應(yīng)4小時(shí),每孔添加0.1mL的濃溶液(solubilization solution)將藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(formazan)結(jié)晶分解,再利用酶標(biāo)儀(ELISA reader)在595nm波長下讀取吸光值(A595),得到細(xì)胞抑制率:
細(xì)胞抑制率(%)=樣品處理組A595值/控制組A595值。
每數(shù)據(jù)重復(fù)測定三次,并取平均值,得到圖3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖3是石蓮大分子提取物GWE、高甲氧基果膠HMP、經(jīng)果膠酶處理的果膠與石蓮的中分子提取物的組合物HMP-EF1的抗人類腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)的抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
圖3結(jié)果顯示果膠多糖與石蓮提取物區(qū)分物具有抗人類腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)的抑制活性,抑制率提高呈濃度一級(jí)反應(yīng)的正相關(guān)。在濃度1.0mg/mL下,高甲氧基果膠(HMP)具有抑制Caco-2細(xì)胞的活性大約34%;經(jīng)過果膠酶處理降解物、經(jīng)膜分離畫分得中分子區(qū)分物(HMP-EF1)具有特定帶有鼠李糖和阿拉伯糖分枝的聚半乳糖結(jié)構(gòu)片段,呈現(xiàn)高抑制Caco-2細(xì)胞的活性(約66%)。石蓮花葉熱水提取物中分子區(qū)分物具有更高的抑制活性83%。此抑制活性的關(guān)鍵因子是果膠特定分子結(jié)構(gòu)片段及抗氧化性植化物,包括酚酸類(尤其沒食子酸)、類黃酮、萜烯類等。將活性果膠片段和石蓮花葉活性區(qū)分子皆具有少量的羧基,在食品加工原位狀態(tài)下進(jìn)行選擇性、標(biāo)的性的酯化反應(yīng)、增加活性基團(tuán),可增加抑制Caco-2細(xì)胞的活性。
因此,本發(fā)明的組合物可以用于制備具有抑制人類腸腺癌細(xì)胞活性藥物,為此本發(fā)明還提供了一種抗大腸腺細(xì)胞的藥物,含有適量的上述果膠組合物。
另外,本發(fā)明的組合物可以用于制備具有抑制人類腸腺癌細(xì)胞活性的健康效益的膳食纖維及果膠組合物,可用于健康食品及營養(yǎng)補(bǔ)充品,該食品含有適量的果膠組合物和膳食纖維。