本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域。更具體地，涉及金絲桃苷在制備預防和治療酒精性肝病藥物和保健品中的應用。

背景技術：

酒精性肝病(alcoholicliverdisease，ald)是由于長期大量飲酒所致的肝臟損害，包括酒精性脂肪肝(alcoholicfattyliver,afl)、酒精性肝炎(alcoholichepatitis,ah)和酒精性肝硬化(alcoholiccirrhosis,ac)；此三者?；旌洗嬖?。肝病的發(fā)生與飲酒時間長短、飲量多少及營養(yǎng)狀態(tài)優(yōu)劣呈正相關。其中，80％～90％的肝硬化病因是由飲酒引起的。據(jù)估計，美國每年有兩萬余人死于酒精性肝硬化。近年來隨著生活條件變化，飲酒趨勢增多，由酒精所致肝損害的發(fā)病率亦呈逐年上升趨勢；酒精已成為繼病毒性肝炎后導致肝損傷的第二大病因。

基于上述原因，建立與人類酒精性肝病類似模型至關重要。過去建立的一些酒精性肝病動物模型，存在損傷輕微，誘導病理指標單一，無法模擬混合型酒精性肝病，難于操作等弊端。近期由美國國立衛(wèi)生院酒精濫用與酒精中毒研究所肝病研究室(nationalinstitutiononalcoholabuseandalcoholism,niaaa)建立的新模型(2013年發(fā)布)，即慢性酒精喂養(yǎng)加酒精灌胃的酒精性肝病小鼠模型(gao-binge模型)，更接近于人類的飲酒方式。是公認最為有效的造模方式；能造成酒精性脂肪肝合并肝炎。

另一方面，酗酒直接導致急性酒精中毒引起的肝損害和死亡率直線攀升。目前公認的模型為短期內(nèi)多次大劑量酒精灌胃，與人類急性酒精中毒情況相近；亦能造成酒精性脂肪肝。

臨床上，關于酒精性肝病的診斷標準如下：1)肝腫大；2)肝細胞發(fā)生脂肪變，依脂肪變范圍分輕、中和重度；3)肝細胞呈氣球樣變和透明性變；4)ast、alt為主的血清轉(zhuǎn)氨酶升高；5)血清和肝臟甘油三酯升高等。

雖然國際上對酒精性肝病的研究取得了一定成果，但機制尚未全部闡明；且并無特效或針對性藥物。主要以輔助和酒精戒斷療法為主；包括膽堿、蛋氨酸、谷胱甘肽和維生素等。因此，臨床上亟需尋找其它能夠預防或治療酒精性肝病的藥物。

金絲桃苷又名槲皮素-3-o-β-d-吡喃半乳糖苷，屬于黃酮醇苷類化合物，廣泛存在于植物中。是中藥山楂和連翹的有效成分之一。具有抗炎、降壓消脂、鎮(zhèn)痛和對心腦血管的保護作用；動物研究表明，還可用于緩解高脂飲食所致肥胖和二型糖尿病。

cn1493578a(申請?zhí)?2146370.0)公開了一種金絲桃苷的制備方法及藥物新用途。本發(fā)明制備方法為：將干燥的黃蜀葵花粉碎成粗粉，用親水性溶劑加熱回流提取或冷浸滲濾提取，提取液濃縮至比重1.15－1.30(70℃)的浸膏，水溶，過濾，濾液上聚酰胺為載體的柱層析，收集水一醇洗脫液，濃縮，真空干燥后得粗提取物，再用醋酸乙酯一乙醇混合溶劑提取，提取液，濃縮，真空干燥后得精制黃蜀葵花提取物；用醇復結(jié)晶，濾取結(jié)晶，得金絲桃苷。本發(fā)明方法制備的金絲桃苷原料藥純度為90－98％。還公開了金絲桃苷治療乙型肝炎的藥物新用途。但該發(fā)明主要針對疾病為乙型肝炎，對酒精性肝病或酒精性肝損傷并未探討；考察指標相對單一，對其他相關指標并未考察。使用范圍較窄，僅用于藥物，并不包含保健品或食品添加劑。

cn1765912a(申請?zhí)?00510100020.7)公開了一種火棘(pyracanthafortuneana(maxim.)li)提取物，包括組分蘆丁、金絲桃苷；其制備方法包括干燥并粉碎的火棘果實中加入相當于其1～50倍重量的水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮中的一種或一種以上，提取得到提取液；提取液經(jīng)過濾，離心分離，濃縮，冷凍干燥；經(jīng)大孔樹脂、正相硅膠和反相c18填料柱層析，洗脫分離純化。火棘提取物可用于制備緩解及改善由應激反應中氧自由基引起的肝損傷等不良反應的藥物，也可用于制備緩解及改善由應激反應中氧自由基引起的肝損傷等不良反應的食品或食品添加劑。該發(fā)明有如下不足之處：1)該發(fā)明主體為火棘提取物，是一種組合物而非藥物單體，有效成分不明確；2)主要針對疾病為氧自由基導致的肝臟損傷，并非酒精性肝??；3)考察指標不全面。

cn101683411a(申請?zhí)?00910175099.8)公開了一種海棠提取物，以及該提取物在制備保肝藥物或保健食品中的用途及含有海棠提取物的藥物組合物。對各種原因引起的肝損傷均有保護作用，對因肝損傷出現(xiàn)的各種疾病均有防治作用；治療或預防急性酒精中毒效果良好，能明顯改善醉酒引起的頭暈、頭痛，乏力等各種癥狀。海棠提取物，含有下述重量百分含量的化合物：橙酮苷0.04-0.5％，金絲桃苷0.01-1％，異槲皮苷0.03-0.1％、根皮苷50-92％、化合物6：malusohupehenin0.04-0.5％。該發(fā)明有如下不足之處：1)該發(fā)明主體為海棠提取物，成分復雜，有效成分不明確；2)該發(fā)明中主要考察成分為根皮苷；3)對提取物的其它成分的探討僅限于傳代細胞系，并未對原代細胞、肝臟組織和整體動物病理學差異進行探討。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明克服現(xiàn)有酒精性肝損傷預防和治療藥物的局限，通過動物實驗揭示其具體作用，提供金絲桃苷在制備預防和治療酒精性肝病、急性酒精中毒藥物和保健品中的應用。

本發(fā)明目的在于提供金絲桃苷在制備預防和治療酒精性肝病藥物和保健品中的應用。

本發(fā)明另一目的是提供金絲桃苷在制備預防和治療急性酒精中毒藥物和保健品中的應用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)：

首先，本發(fā)明提供金絲桃苷在制備預防和/或治療酒精性肝病的藥物和/或保健品中的應用。所述應用包括：金絲桃苷在制備預防和治療酒精性肝病的藥物中的應用、金絲桃苷在制備預防或治療酒精性肝病的藥物中的應用、金絲桃苷在制備預防和治療酒精性肝病的保健品中的應用、金絲桃苷在制備預防或治療酒精性肝病的保健品中的應用；也包括上述應用中既可作為藥品也可作為保健品的應用。

本發(fā)明提供了一種用于預防和治療酒精性肝病的藥物組合物，組合物中包含金絲桃苷，以金絲桃苷為主要活性成分；并加入藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的口服制劑。所述藥學上可接受的輔料或輔助性成分包括：淀粉、改性淀粉、1％硬脂酸鎂、各種輔料用纖維素、α半乳糖和β環(huán)糊精等。

優(yōu)選的，所述用于預防和治療酒精性肝病的藥物組合物，包括金絲桃苷3-99.7％，重量百分比。

更優(yōu)選的，所述用于預防和/或治療酒精性肝病的藥物組合物，其組成選擇下列組合的一種：1)金絲桃苷98.4-99.7％、維生素b1:0.3-1.6％；2)金絲桃苷98.4-99.7％、維生素b6:0.3-1.6％；3)金絲桃苷98.4-99.7％、維生素b12:0.3-1.6％；均為重量百分比。

以上百分比為僅考慮藥物有效成分時的百分含量。即，以藥物有效成分為100％，未計入藥學上可接受的輔料或輔助性成分的百分含量。

更優(yōu)選的，上述藥物組合物還包括藥學上可接受的輔料或輔助性成分。本領域技術人員可以根據(jù)實際需要或制劑的形式來選擇藥學上可接受的輔料或輔助性成分的含量；藥學上可接受的輔料或輔助性成分的含量一般為組合物總重量的1-97％，比如，所述用于預防和/或治療酒精性肝病的藥物組合物，其組成選擇下列組合的一種：1)金絲桃苷3-98％、維生素b1:0.02-1％，藥學上可接受的輔料或輔助性成分1-96.9％；2)金絲桃苷3-98％、維生素b6:0.02-1％，藥學上可接受的輔料或輔助性成分1-96.9％；3)金絲桃苷3-98％、維生素b12:0.02-1％，藥學上可接受的輔料或輔助性成分1-96.9％；均為重量百分比。

上述藥物組合物在制備預防和/或治療酒精性肝病藥物和/或保健品中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

上述的酒精性肝病是指長期大量飲酒導致的酒精性肝損傷。所述的長期大量飲酒指平均每天酒精攝入量超過5g/kg，時間超過10天。

上述酒精性肝病是指酒精喂養(yǎng)加酒精灌胃所誘導的酒精性肝損傷。所述的酒精喂養(yǎng)加酒精灌胃指：含5％(體積比)酒精的液體飼料喂養(yǎng)加一次或幾次5g/kg劑量的酒精灌胃。

所述的預防和治療酒精性肝病是指減輕酒精性肝病模型中肝臟體積腫大和質(zhì)量增加；降低血清中alt和ast活性，減輕肝組織脂肪聚集、氣泡樣病變和炎癥浸潤程度，降低血清和肝臟中甘油三酯(tg)含量。

本發(fā)明首先通過酒精喂養(yǎng)加酒精灌胃造成小鼠酒精性肝病模型，協(xié)同給予不同劑量的金絲桃苷(30mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg)后，能有效減輕酒精性肝病模型中肝臟體積腫大和質(zhì)量增加；降低肝內(nèi)和血清中甘油三酯(tg)水平，減輕肝組織脂肪聚集、氣泡樣病變和炎癥浸潤程度。結(jié)果表明藥物能夠預防治療酒精喂養(yǎng)加酒精灌胃所誘導的酒精性肝損傷。因此，根據(jù)本研究結(jié)果，可以將金絲桃苷用于制備臨床上預防或治療酒精性肝病的藥物或保健品。

另一方面，本發(fā)明還提供金絲桃苷在制備預防急性酒精中毒藥物及保健品中的應用。

本發(fā)明提供了一種用于預防急性酒精中毒的藥物和/或保健品組合物，該藥物組合物包含有金絲桃苷，以金絲桃苷為主要活性成分；并加入藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。

優(yōu)選的，所述用于預防急性酒精中毒的藥物和保健品組合物，包括金絲桃苷(30-75％)，重量百分比。優(yōu)選的，所述用于預防和治療急性酒精中毒的藥物和保健品組合物，包括金絲桃苷30-75％、槲皮素25-70％，均為重量百分比。

優(yōu)選的，上述藥物組合物還包括藥學上可接受的輔料或輔助性成分。本領域技術人員可以根據(jù)實際需要或制劑的形式來選擇藥學上可接受的輔料或輔助性成分的含量；藥學上可接受的輔料或輔助性成分的含量一般為組合物總重量的1-45％，比如，在包含輔料的情況下，金絲桃苷16.5-74.25％、槲皮素13.75-69.3％，藥學上可接受的輔料或輔助性成分1-45％；均為重量百分比，所有成分的總和為100％。

上述藥物組合物在制備預防急性酒精中毒藥物和保健品中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

金絲桃苷在制備預防和/或治療酒精性肝病的藥物和/或保健品中的應用，或者預防急性酒精中毒藥物和保健品中的應用，其特征在于，將金絲桃苷作為活性成分，與藥學上可接受的輔料或輔助性成分混合后，制成預防和/或治療酒精性肝病的口服制劑、注射制劑。

優(yōu)選的，所述口服制劑為片劑、膠囊劑或顆粒劑。注射制劑為注射液。

優(yōu)選地，上述的急性酒精中毒是指短期大量飲酒導致的酒精性肝損傷。所述短期大劑量指2-5天內(nèi)大于等于6g/kg/天的酒精攝取量。

更優(yōu)選地，上述急性酒精中毒是指短期大劑量酒精灌胃所誘導的酒精性肝損傷。

同時，上述的預防急性酒精中毒是指降低模型血清中alt和ast活性，減輕急性酒精灌胃模型中肝臟體積腫大和質(zhì)量增加；降低肝內(nèi)和血清中甘油三酯(tg)水平，減輕肝組織脂肪聚集和氣泡樣病變程度。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明克服了現(xiàn)有酒精性肝損傷預防和治療藥物的局限，提供金絲桃苷及以其為主要活性成分在制備預防和治療酒精性肝病、急性酒精中毒藥物(或保健食品)中的應用。發(fā)現(xiàn)了金絲桃苷能夠預防治療長期酒精喂養(yǎng)加酒精灌胃、或短期大劑量酒精灌胃所誘導的酒精性肝損傷。

首先通過酒精喂養(yǎng)加酒精灌胃造成小鼠慢性酒精性肝病模型，協(xié)同給予不同劑量的金絲桃苷(30mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg)后，能有效減輕肝臟損傷和降低脂質(zhì)病變水平，具體表現(xiàn)為小鼠肝臟的體積、重量和肝重比明顯下調(diào)，血清中alt和ast活性顯著降低，血清和肝臟內(nèi)tg含量明顯減少，肝組織脂肪聚集、空泡樣病變和炎癥浸潤程度顯著減輕。

另一方面，采用短期大劑量小鼠酒精灌胃模型，協(xié)同給予不同劑量的金絲桃苷(30mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg)后，能有效緩解急性酒精中毒導致的肝臟重量增加；降低血清中ast和alt活性；減少血清和肝臟中tg含量。改善肝組織脂肪聚集和空泡樣病變程度。

因此，根據(jù)本研究的結(jié)果，可以將金絲桃苷用于臨床上酒精性肝病和急性酒精中毒的預防或治療，且療效好、無明顯毒副作用，同時金絲桃苷來源廣，成本低，易獲得，具有很好的推廣應用價值。

結(jié)合目前對于金絲桃苷的研究，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢：

(1)槲皮素是金絲桃苷的有效活性基團，并已證實能緩解化學或機械原因?qū)е碌母螕p傷。然而，槲皮素具有消化道刺激性；不適用于開發(fā)大劑量的口服或其他制劑。相反，金絲桃苷作用溫和等效，且無吞咽毒性，口服及注射給藥皆可；更有利于開發(fā)實用制劑。

(2)金絲桃苷廣泛存在于各種植物體內(nèi)，如金絲桃科、薔薇科、桔?？频裙麑嵟c全草中。提取工藝簡單，也可以化學合成；適應于大批量制備。

(3)雖然對于金絲桃苷鎮(zhèn)痛、消炎、緩解心腦血管和肥胖等疾病的藥理作用已有報導；目前對于金絲桃苷能否預防和治療酒精性肝病尚未有研究。

顯然，根據(jù)上述內(nèi)容，結(jié)合本領域普通技術和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述技術思想的前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述內(nèi)容范圍僅限于以下實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明：

圖1為不同劑量的金絲桃苷減輕niaaa模型所致肝臟腫大的結(jié)果圖。

圖2為不同劑量的金絲桃苷逆轉(zhuǎn)niaaa模型所致肝臟重量升高的結(jié)果圖。ns表示無顯著性差異，p<0.05被認為有顯著性差異。其中*表示與對比組比較p<0.05，**表示與對比組比較p<0.01，***表示與對比組比較p<0.001。

圖3為不同劑量的金絲桃苷逆轉(zhuǎn)niaaa模型所致肝臟的肝重比升高的結(jié)果圖。所述肝重比為：肝臟除以體重的比值。在小鼠實驗中，4.5-5％即可成為脂肪肝的輔助判斷條件。

圖4為不同劑量的金絲桃苷減輕niaaa模型所致肝組織脂肪聚集的結(jié)果圖。圖中顏色較深為脂肪染色后效果。

圖5為不同劑量的金絲桃苷減輕niaaa模型所致肝組織空泡樣病變的結(jié)果圖。圖中箭頭所示。

圖6為不同劑量的金絲桃苷逆轉(zhuǎn)niaaa模型所致小鼠血清ast指標升高的結(jié)果圖。ast是天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的縮寫，舊稱谷草轉(zhuǎn)氨酶(got)，是肝功能檢查的一項重要指標，用來判斷肝臟是否受到損害。谷草轉(zhuǎn)氨酶正常值是4-40u/l(單位每升)。

圖7為不同劑量的金絲桃苷逆轉(zhuǎn)niaaa模型所致小鼠血清alt指標升高的結(jié)果圖。alt，肝功能的一種，即“谷丙轉(zhuǎn)氨酶”。

圖8為不同劑量的金絲桃苷逆轉(zhuǎn)niaaa模型所致小鼠血清tg含量升高的結(jié)果圖。甘油三酯(triglyceride，縮寫tg)是長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子。

圖9為不同劑量的金絲桃苷逆轉(zhuǎn)niaaa模型所致小鼠肝臟內(nèi)tg含量升高的結(jié)果圖。

圖10為金絲桃苷組合物減輕niaaa模型所致肝臟腫大的結(jié)果圖。

圖11為金絲桃苷組合物減輕niaaa模型所致所致肝組織脂肪聚集的結(jié)果圖。

圖12為金絲桃苷組合物減輕niaaa模型所致肝組織空泡樣病變的結(jié)果圖。

圖13為不同劑量的金絲桃苷逆轉(zhuǎn)急性酒精中毒模型所致肝臟重量升高的結(jié)果圖。

圖14為不同劑量的金絲桃苷逆轉(zhuǎn)急性酒精中毒模型所致肝臟的肝重比升高的結(jié)果圖。

圖15為不同劑量的金絲桃苷減輕急性酒精中毒模型所致肝組織脂肪聚集的結(jié)果圖。

圖16為不同劑量的金絲桃苷減輕急性酒精中毒模型所致肝組織空泡樣病變的結(jié)果圖。

圖17為不同劑量的金絲桃苷逆轉(zhuǎn)急性酒精中毒模型所致小鼠血清ast指標升高的結(jié)果圖。

圖18為不同劑量的金絲桃苷逆轉(zhuǎn)急性酒精中毒模型所致小鼠血清alt指標升高的結(jié)果圖。圖19為不同劑量的金絲桃苷逆轉(zhuǎn)急性酒精中毒模型所致小鼠血清tg含量升高的結(jié)果圖。

圖20為不同劑量的金絲桃苷逆轉(zhuǎn)急性酒精中毒模型所致小鼠肝臟內(nèi)tg含量升高的結(jié)果圖。

具體實施方式

以下通過藥效學試驗證明本發(fā)明的有效效果。

實施例1不同劑量的金絲桃苷用于預防和治療niaaa模型所致的酒精性脂肪肝

1、儀器與材料

(1)主要儀器：全波長酶標儀(美國thermo公司)。

(2)藥品和試劑：液體飼料(lieber-decarlidietadlibitum)和液體酒精飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)；酒精(burdick&jackson)；金絲桃苷(≥98％，成都曼思特生物科技有限公司)；alt、ast、tg檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；其它試劑均為分析純級別。

2、實驗動物及給藥方案

c57bl/6小鼠，雄性，周齡8～9周，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，根據(jù)不同組別采用對照液體飼料或液體酒精飼料喂養(yǎng)。采用對照液體飼料(lieber-decarlidietadlibitum)喂養(yǎng)小鼠5天；使其適應液體飼料。此后，將小鼠隨機分成6組，每組6只，組別為空白對照液體飼料組(lieber-decarlidietadlibitum)、酒精造模組(lieber-decarlidietadlibitum加入酒精；終濃度為5％(體積/體積))、金絲桃苷+酒精造模組；共喂養(yǎng)10天。其中金絲桃苷+酒精造模組為金絲桃苷(30/50/75/100mg/kg)，隨酒精造模灌胃給藥。10天后一次性酒精灌胃(5g/kg)或等熱量糊精；并在此后9h處理解剖小鼠，解剖后對離體肝臟形態(tài)進行拍照，收集血清以及肝臟，每組取三只小鼠部分肝臟置于10％(v/v)甲醛中固定，其它樣本在-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

3、肝組織與血清化學檢測

肝組織切片、h&e和油紅染色由武漢塞維爾生物科技有限公司完成，血清中的alt、ast、tg檢測方法按照試劑盒的說明書來完成。

4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計

各組實驗數(shù)據(jù)均以mean±s.e.m.表示，采用graphpadprism5軟件進行統(tǒng)計分析，采用unpairedstudent’sttest進行兩組間比較，p<0.05被認為有顯著性差異。其中*表示與對比組比較p<0.05，**表示與對比組比較p<0.01，***表示與對比組比較p<0.001。

5、實驗結(jié)果：

一般情況：酒精組小鼠食欲變差、進食減少、體重下降、皮毛光澤差；解刨后肉眼可明顯觀察到肝臟體積變大、表面粗糙、顏色改變。陰性對照組和給藥組上述病理反應明顯改善；肝臟腫大顯著緩解。見圖1。

肝臟重量變化：造模后酒精組肝臟質(zhì)量明顯高于對照組和給藥組(p<0.05)。小鼠肝重比酒精組最高，給藥組次之；對照飼料組最低；且存在統(tǒng)計學差異。見表1和圖2-3。

表1

其中*表示與對比組比較p<0.05，**表示與對比組比較p<0.01，***表示與對比組比較p<0.001。

組織病理學切片：油紅染色病理切片證實，對照組細胞內(nèi)脂肪滴少見；酒精組胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴(黑白圖片為灰黑色斑點)。給藥后脂滴形狀明顯縮小。蘇木伊紅(hematoxylinandeosin；h&e)染色病理切片顯示：正常組小鼠肝小葉清晰，細胞索排列整齊，胞內(nèi)無病變。與陰性對照組相比，酒精組的肝臟病理切片能明顯觀察到組織病變；肝細胞出現(xiàn)散在和片狀氣球樣病變(箭頭所示)，可見炎癥細胞浸潤，肝細胞腫脹，胞漿內(nèi)出現(xiàn)彌漫性脂滴，胞核模糊不清。給藥組能顯著減輕小鼠肝組織脂肪聚集和細胞病變。見圖4-5。

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)和門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)：和對照組相比，酒精造模組血清的氨基轉(zhuǎn)移酶(ast和alt)升高近三倍(p<0.05)。其中，ast/alt明顯大于1。給藥后上述病理指標大幅度改善并與酒精組比較具有顯著性差異(p<0.05)；在給藥50mg/kg、100mg/kg時ast/alt<1。見表2和圖6-7。

表2

其中*表示與對比組比較p<0.05，**表示與對比組比較p<0.01，***表示與對比組比較p<0.001。

血清和肝臟甘油三酯(tg)水平變化：和對照飼料組相比，血清甘油三酯(tg)升高兩倍；肝臟內(nèi)tg顯著升高近5倍(p<0.05)。給藥后上述病理指標大幅度改善并與酒精組比較具有顯著性差異(p<0.05)；在給藥50mg/kg時病理指標的改善程度最高。見表3和圖8-9。

表3

其中*表示與對比組比較p<0.05，**表示與對比組比較p<0.01，***表示與對比組比較p<0.001。

實施例2金絲桃苷藥物組合物用于預防和治療niaaa模型所致的酒精性脂肪肝

1、儀器與材料

同實施例1。

2、實驗動物與給藥方案

小鼠隨機分成8組，每組6只，組別為空白對照液體飼料組、酒精造模組、酒精造模協(xié)同給藥組：30mg/kg金絲桃苷+100μg/kg維生素b1、30mg/kg金絲桃苷+500μg/kg維生素b1、30mg/kg金絲桃苷+100μg/kg維生素b6、30mg/kg金絲桃苷+500μg/kg維生素b6、30mg/kg金絲桃苷+100μg/kg維生素b12、30mg/kg金絲桃苷+500μg/kg維生素b12；其余同實施例1。

3、肝組織與血清化學檢測

同實施例1。

4、實驗結(jié)果

一般情況：與對照液體飼料組相比，酒精造模組解刨后肉眼可明顯觀察到肝臟體積變大、表面粗糙、顏色改變。協(xié)同給于各種藥物組合物后上述病理反應明顯改善；肝臟腫大顯著緩解。見圖10。

組織病理學切片：油紅染色病理切片顯示，酒精造模后肝細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴(黑白圖片為灰黑色斑點)。協(xié)同給予藥物組合物后脂滴形狀明顯縮小。與陰性對照組相比，酒精組的肝臟病理切片能明顯觀察到氣球樣病變(箭頭所示)，以及炎癥細胞浸潤，胞漿內(nèi)出現(xiàn)彌漫性脂滴，胞核模糊不清。給予藥物組合物后小鼠肝組織內(nèi)脂肪聚集和細胞病變程度大幅度減輕。見圖11-12。

實施例3不同劑量的金絲桃苷用于預防急性酒精中毒模型所致的肝損傷

1、儀器與材料

同實施例1。

2、實驗動物及給藥方案

昆明小鼠，雄性，周齡8～9周，重24-26g。由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，造模共需2天。將小鼠隨機分成6組，每組6只。酒精造模組每12h灌服酒精溶液6g/kg；共三次。溶劑對照組灌胃等熱量的糊精，給藥組在酒精造模時協(xié)同給于不同劑量的金絲桃苷(30/50/75/100mg/kg)。最后一次6h后收樣。后續(xù)處理方式同實施例1。

3、肝組織與血清化學檢測

同實施例1。

4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計

同實施例1。

5、實驗結(jié)果：

肝臟質(zhì)量變化：與溶劑對照組相比，急性造模后小鼠肝臟質(zhì)量明顯增加(p<0.05)。協(xié)同給予不同劑量的金絲桃苷后能逐步緩解急性酒精中毒導致的小鼠肝臟腫大(p<0.05)；在75mg/kg時效果最佳。小鼠肝重比給藥組明顯低于酒精造模組(p<0.05)；在給藥100mg/kg時效果最好。見表4和圖13-14。

表4

其中*表示與對比組比較p<0.05，**表示與對比組比較p<0.01，***表示與對比組比較p<0.001。

組織病理學切片：油紅染色病理切片證實，酒精中毒后肝細胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴(黑白圖片為灰黑色斑點)。給藥后脂滴形狀明顯縮小。h&e染色病理切片顯示：酒精組肝臟內(nèi)能明顯觀察到組織和細胞病變；出現(xiàn)散在和片狀氣球樣病變，可見炎癥細胞浸潤，肝細胞腫脹，胞漿內(nèi)出現(xiàn)彌漫性脂滴，胞核模糊不清。給藥組能顯著減輕小鼠肝組織脂肪聚集和細胞病變。見圖15-16。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)和門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)水平變化：和溶劑對照組相比，急性酒精中毒后血清的氨基轉(zhuǎn)移酶ast水平升高四倍倍(p<0.05)，alt升高8倍；ast/alt＞1。給藥后上述病理指標大幅改善，與酒精組比較具有顯著性差異(p<0.05)；其中50mg/kg和75mg/kg改善幅度最大。見表5和圖17-18。

表5

其中*表示與對比組比較p<0.05，**表示與對比組比較p<0.01，***表示與對比組比較p<0.001。

血清和肝臟甘油三酯(tg)水平變化：和溶劑對照組相比，急性酒精中毒后血清和肝臟內(nèi)tg含量升高兩倍(p<0.05)；給予藥物后逐步恢復到正常水平，與造模組存在顯著性差異(p<0.05)。其中，50mg/kg和75mg/kg劑量組改善效果最為明顯。見表6和圖19-20。

表6

其中*表示與對比組比較p<0.05，**表示與對比組比較p<0.01，***表示與對比組比較p<0.001。

實施例4金絲桃苷藥物組合物用于預防急性酒精中毒模型所致的肝損傷

1、儀器與材料

同實施例1。

2、實驗動物與給藥方案

小鼠隨機分成6組，每組6只，組別為溶劑對照組、酒精造模組、酒精造模協(xié)同給藥組：30mg/kg金絲桃苷+10mg/kg槲皮素、30mg/kg金絲桃苷+25mg/kg槲皮素、30mg/kg金絲桃苷+50mg/kg槲皮素、30mg/kg金絲桃苷+70mg/kg槲皮素；其余同實施例3。

3、肝組織與血清化學檢測同實施例1。

4、實驗結(jié)果

與對照液體飼料組相比，酒精造模組解刨后肉眼可明顯觀察到肝臟體積變大、表面粗糙、顏色改變。協(xié)同給于上述藥物組合物后上述病理反應明顯改善；肝臟腫大顯著緩解。肝臟病理切片顯示，酒精造模后肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴；油紅染色可見大小不一的深紅色液滴(黑白圖片為灰黑色斑點)；給予藥物組合物后數(shù)量減少；面積縮小。h&e病理切片顯示，酒精造模組肝組織內(nèi)出現(xiàn)明顯的空泡樣病變(箭頭表示)；協(xié)同給于藥物組合物后病變程度顯著減輕。

實施例5金絲桃苷及其藥物組合物用于制備預防和治療酒精性肝病的制劑

根據(jù)實施例1-4，可制備如下口服制劑；所用方法均為常規(guī)制備方法。

1、制備包含30-99％金絲桃苷的片劑：取金絲桃苷(或金絲桃苷藥物組合物)干燥粉末，過60-100目篩備用。加入片劑常用輔料的一種或幾種；經(jīng)壓片機壓制成片。使每片含金絲桃苷300-750mg，片重0.5-1g。所用輔料可以是：淀粉、改性淀粉、1％硬脂酸鎂、微晶纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素等。

2、制備包含30-99％金絲桃苷的膠囊劑：取金絲桃苷(或包含金絲桃苷藥物組合物)干燥粉末，過60-100目篩備用。加入膠囊劑常用輔料一種或幾種，制粒，整粒，裝膠囊。每粒膠囊中含金絲桃苷300-750mg，膠囊重0.5-1g。所用輔料可以是：改性淀粉、微晶纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素等。

3、制備包含3-40％金絲桃苷的顆粒劑：取金絲桃苷(或包含金絲桃苷藥物組合物)干燥粉末，過60-100目篩備用。加入顆粒劑常用輔料的一種或幾種，制粒，整粒，裝袋。每袋含金絲桃苷300-2000mg，每袋重5-10g?？捎?5℃以下水混懸服用。所用輔料可以是：α半乳糖和β環(huán)糊精等。

根據(jù)動物實驗劑量推導出制劑含量的表格如表7-9：

表7-以金絲桃苷為例

百分比(重量)含量：最低3％，最高＞100％(以99％計)。

表8-以維生素b類為例

百分比(重量)含量：最低0.01％，最高2％；可選用范圍是0.01-2％。

根據(jù)實施例中藥物組合物劑量，考慮到金絲桃苷的波動范圍3-99％(見表7)；

維生素b類最終選擇范圍為0.02-1％。

表9-以槲皮素為例

由于槲皮素具有吞咽毒性，不考慮顆粒劑。

百分比(重量)含量：最低10％，最高≥100％(以99％計)；可選用范圍是10-99％根據(jù)實施例中藥物組合物劑量，考慮到金絲桃苷在片劑和膠囊劑的含量需≥30％(見表7)；槲皮素最終選擇范圍為10-69％。