本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，具體涉及一種糖-血紅蛋白納米粒子的制備方法及用途，特別是涉及通過(guò)單糖或者雙糖的糖醛基和血紅蛋白肽鏈上的氨基酸殘基之間的偶聯(lián)反應(yīng)制備出生物相容性好、穩(wěn)定性高的糖-血紅蛋白納米粒子，以及此糖-血紅蛋白納米粒子在藥物遞送和血漿擴(kuò)容領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生物醫(yī)學(xué)材料(Biomedical Materials)是用于診斷、治療、修復(fù)或替換人體組織、器官或增進(jìn)其功能的一類(lèi)高技術(shù)新材料。醫(yī)用高分子材料是生物醫(yī)學(xué)材料中發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛、用量最大的材料，它既可以來(lái)源于天然產(chǎn)物，又可以人工合成。按照不同的性質(zhì)，醫(yī)用高分子材料可分為非降解型和可降解型兩類(lèi)。前者在生物環(huán)境中能長(zhǎng)期保持穩(wěn)定，不發(fā)生降解、交聯(lián)或物理磨損等，且本身和少量的降解產(chǎn)物不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生明顯的毒副作用，主要包括聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、芳香聚酯、聚硅氧烷、聚甲醛等，主要用作人體軟、硬組織修復(fù)體、人工器官、人造血管、接觸鏡、膜材、粘接劑和管腔制品等。后者可在生物環(huán)境作用下發(fā)生結(jié)構(gòu)破壞和性能蛻變，其降解產(chǎn)物能通過(guò)正常的新陳代謝被機(jī)體吸收利用或排出體外，主要包括蛋白質(zhì)、線性脂肪族聚酯、甲殼素、纖維素、聚氨基酸、聚乙烯醇、聚己丙酯等，主要用于藥物釋放和送達(dá)載體以及非永久性植入裝置。

納米藥物遞送系統(tǒng)是醫(yī)用高分子材料發(fā)展的一個(gè)重要分支，其在提高藥物的治療指數(shù)以及安全性等方面頗具潛力，可以通過(guò)改善藥物的水溶性或穩(wěn)定性，增強(qiáng)藥物療效、降低藥物毒性、延長(zhǎng)藥物處于穩(wěn)態(tài)血藥濃度的時(shí)間。此外，納米藥物遞送系統(tǒng)還可用于腫瘤的靶向治療。

血紅蛋白來(lái)源于動(dòng)物血液，其產(chǎn)量高，生物相容性好，在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域具有潛在價(jià)值。作為一種蛋白質(zhì)材料，其具有以下優(yōu)勢(shì)：①?gòu)碾逆溄Y(jié)構(gòu)分析可知，血紅蛋白具有極強(qiáng)的可修飾性，其分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，如-NH₂，-COOH，-OH，-SH等，可在其內(nèi)部或者表面引入多種活性小分子或者大分子，選擇性的提高血紅蛋白的穩(wěn)定性、靶向性以及體內(nèi)滯留時(shí)間。②血紅蛋白具有多樣性的藥物負(fù)載方式，其肽鏈中含有多個(gè)帶電荷的氨基酸殘基(如賴(lài)氨酸、精氨酸、谷氨酸等)，可作為不同藥物的結(jié)合位點(diǎn)、實(shí)現(xiàn)不同方式的藥物負(fù)載。同時(shí)血紅蛋白具有不同于其他蛋白質(zhì)的立體空間結(jié)構(gòu)，其立體構(gòu)型中包含有四個(gè)疏水性“口袋”，可實(shí)現(xiàn)對(duì)疏水性藥物(如紫杉醇、長(zhǎng)春新堿等)的高包封率負(fù)載。③血紅蛋白是體內(nèi)生物活性肽的“肽庫(kù)”，分子中存在多種生物活性肽片段，如抗菌肽(α1-23，α107-136，β126-145)、血啡肽(β31-41)、ACE抑制肽(α34-39，β130-135，β64-69)等。

糖是人體必需的一種營(yíng)養(yǎng)素，提供人體生命活動(dòng)必需的能量。在整個(gè)人體系統(tǒng)中，不同部位對(duì)于糖的吸收和利用存在一定的差異。由于腫瘤細(xì)胞存在異于正常細(xì)胞的糖代謝途徑，造成腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的過(guò)度吞噬現(xiàn)象。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面存在特異性的受體蛋白，能特異性的識(shí)別含有乳糖基或者半乳糖基的分子；而存在于肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞、脾臟內(nèi)皮細(xì)胞的甘露糖受體能識(shí)別以甘露糖、巖藻糖以及N-乙酰葡萄糖胺為終端的糖類(lèi)分子。因此，用糖分子修飾載體體系，不但能提高其生物相容性，而且可以賦予載體系統(tǒng)不同的靶向性能。

本發(fā)明立足于體內(nèi)遞送系統(tǒng)理論，基于血紅蛋白和小分子糖，利用化學(xué)工程的方法構(gòu)建了一種糖-血紅蛋白納米粒子，評(píng)價(jià)了其作為藥物載體系統(tǒng)的可行性。結(jié)果表明，這種糖-血紅蛋白納米粒子具有很好的生物相容性，生物降解性以及體內(nèi)靶向性，在藥物遞送方面具有廣泛的應(yīng)用前景。同時(shí)，該體系亦表現(xiàn)出良好的膠體特性，具有一定的膠體滲透壓，且在體毒性低，血漿擴(kuò)容效果好，能夠作為血漿擴(kuò)容劑使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有良好生物相容性和可降解性的糖-血紅蛋白納米粒子。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種糖-血紅蛋白納米粒子的制備方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種糖-血紅蛋白納米粒子在藥物遞送方面的用途。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種糖-血紅蛋白納米粒子作為血漿擴(kuò)容劑的用途。

本發(fā)明的目的主要通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種糖-血紅蛋白納米粒子，其特征是通過(guò)糖分子上的末端醛基和血紅蛋白肽鏈上的氨基酸殘基之間的偶聯(lián)反應(yīng)制備，所述的血紅蛋白為來(lái)源于哺乳動(dòng)物血液的血紅蛋白或血紅蛋白脫血紅素后得到的珠蛋白，所述的糖為核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖或乳糖中的任意一種。

本發(fā)明所述的糖-血紅蛋白納米粒子可通過(guò)疏水作用和靜電作用負(fù)載抗腫瘤藥物紫杉醇、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、甲氨蝶呤、順鉑。

本發(fā)明所述的糖-血紅蛋白納米粒子可在糖-血紅蛋白納米粒子中以共價(jià)鍵的方式引入熒光素，或者利用京尼平交聯(lián)的方式在其內(nèi)引入自熒光發(fā)色團(tuán)。

一種糖-血紅蛋白納米粒子的制備方法，其特征是將摩爾比為10：1～200：1的糖和血紅蛋白溶解于pH＝9～13的緩沖溶液中，37℃攪拌反應(yīng)30小時(shí)，然后加入還原劑終止反應(yīng)，體系透析、冷凍干燥，即得。所述的還原劑為硼氫化鈉或抗壞血酸。

一種負(fù)載親水性抗腫瘤藥物的糖-血紅蛋白納米粒子的制備方法，其特征是將糖-血紅蛋白納米粒子分散在pH＝9的緩沖溶液中，加入抗腫瘤藥物(阿霉素、順鉑)的水溶液，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，體系透析，冷凍干燥，即得。

一種負(fù)載疏水性抗腫瘤藥物的糖-血紅蛋白納米粒子的制備方法，其特征是將糖-血紅蛋白納米粒子分散在pH＝9的緩沖溶液中，加入少量二甲基亞砜及疏水性抗腫瘤藥物(紫杉醇、甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿)的二甲基亞砜溶液，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，體系透析、離心除去不溶物、冷凍干燥，即得。

一種鍵合熒光素的糖-血紅蛋白納米粒子的制備方法，其特征是將糖-血紅蛋白納米粒子分散在pH＝9的緩沖溶液中，加入異硫氰酸熒光素(FITC)的二甲基亞砜溶液，4℃攪拌過(guò)夜，體系透析、冷凍干燥，即得。

一種京尼平交聯(lián)的糖-血紅蛋白納米粒子的制備方法，其特征是將糖-血紅蛋白納米粒子分散在pH＝9的緩沖溶液中，選擇性加入含有游離氨基的氨基酸溶液，然后加入1～100mM的京尼平溶液，37℃震蕩反應(yīng)24小時(shí)，體系透析，冷凍干燥，即得。

一種糖-血紅蛋白納米粒子在藥物遞送領(lǐng)域的應(yīng)用。

一種糖-血紅蛋白納米粒子在制備血漿擴(kuò)容劑中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的糖-血紅蛋白納米粒子具有如下的優(yōu)勢(shì)：

①本發(fā)明的糖-血紅蛋白納米粒子通過(guò)糖分子的糖醛基和血紅蛋白肽鏈上的氨基酸殘基之間的偶聯(lián)反應(yīng)制備，一方面保留了血紅蛋白自身的生物特性，具有良好的生物相容性和生物可降解性；另一方面其表面的糖分子殘基可以選擇性的被腫瘤細(xì)胞識(shí)別，通過(guò)改變糖分子的種類(lèi)可以選擇性的調(diào)節(jié)納米粒子的腫瘤識(shí)別性，特異性識(shí)別不同種類(lèi)的腫瘤細(xì)胞。

②本發(fā)明的糖-血紅蛋白納米粒子可以通過(guò)疏水作用和靜電作用負(fù)載紫杉醇、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、甲氨蝶呤、順鉑等抗腫瘤藥物，實(shí)現(xiàn)藥物的有效負(fù)載和體內(nèi)遞送。

③本發(fā)明的糖-血紅蛋白納米粒子表現(xiàn)出良好的膠體性質(zhì)，具有一定的膠體滲透壓和擴(kuò)充血容量作用。

④本發(fā)明的糖-血紅蛋白納米粒子制備方法簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和，且安全無(wú)損，提供了一種新的體內(nèi)遞送體系類(lèi)型以及合成方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3葡萄糖-珠蛋白納米粒子的原子力顯微鏡形貌圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例7核糖-珠蛋白納米粒子的原子力顯微鏡形貌圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例11乳糖-珠蛋白納米粒子的原子力顯微鏡形貌圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例16糖-珠蛋白納米粒子的體外細(xì)胞存活率。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例17負(fù)載阿霉素的葡萄糖-珠蛋白納米粒子的體外細(xì)胞存活率。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例18肝癌細(xì)胞和肝細(xì)胞對(duì)鍵合熒光素FITC的葡萄糖-珠蛋白納米粒子的細(xì)胞吞噬速度。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例19肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素和負(fù)載阿霉素的葡萄糖-珠蛋白納米粒子的吞噬速度。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，其目的僅在于更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍：

實(shí)施例1葡萄糖-血紅蛋白納米粒子的制備

將摩爾比為100：1的葡萄糖和血紅蛋白溶解于pH＝12的緩沖溶液中，37℃攪拌反應(yīng)30小時(shí)，然后加入硼氫化鈉終止反應(yīng)，體系透析、冷凍干燥，得到葡萄糖-血紅蛋白納米粒子。馬爾文粒度儀測(cè)量：粒徑為173.1nm，粒徑分布為0.168。

實(shí)施例2葡萄糖-血紅蛋白納米粒子的制備

將摩爾比為20：1的葡萄糖和血紅蛋白溶解于pH＝13的緩沖溶液中，37℃攪拌反應(yīng)30小時(shí)，然后加入硼氫化鈉終止反應(yīng)，體系透析、冷凍干燥，得到葡萄糖-血紅蛋白納米粒子。馬爾文粒度儀測(cè)量：粒子粒徑為220.2nm，粒徑分布為0.264。

實(shí)施例3葡萄糖-珠蛋白納米粒子的制備

將摩爾比為120：1的葡萄糖和珠蛋白溶解于pH＝13的緩沖溶液中，37℃攪拌反應(yīng)30小時(shí)，然后加入硼氫化鈉終止反應(yīng)，體系透析、冷凍干燥，得到葡萄糖-珠蛋白納米粒子。馬爾文粒度儀測(cè)量：粒子粒徑為309.9nm，粒徑分布為0.216。原子力顯微鏡檢測(cè)：形狀為球形，粒徑范圍為90～120nm，見(jiàn)圖1。

實(shí)施例4甘露糖-血紅蛋白納米粒子的制備

將摩爾比為200：1的甘露糖和血紅蛋白溶解于pH＝13的緩沖溶液中，37℃攪拌反應(yīng)30小時(shí)，然后加入硼氫化鈉終止反應(yīng)，體系透析、冷凍干燥，得到甘露糖-血紅蛋白納米粒子。馬爾文粒度儀測(cè)量：粒子粒徑為197.4nm，粒徑分布為0.134。

實(shí)施例5半乳糖-血紅蛋白納米粒子的制備

將摩爾比為100：1的甘露糖和血紅蛋白溶解于pH＝12的緩沖溶液中，37℃攪拌反應(yīng)30小時(shí)，然后加入硼氫化鈉終止反應(yīng)，體系透析、冷凍干燥，得到半乳糖-血紅蛋白納米粒子。馬爾文粒度儀測(cè)量：粒子粒徑為151.7nm，粒徑分布為0.101。

實(shí)施例6核糖-血紅蛋白納米粒子的制備

將摩爾比為100：1的核糖和血紅蛋白溶解于pH＝12的緩沖溶液中，37℃攪拌反應(yīng)30小時(shí)，然后加入抗壞血酸終止反應(yīng)，體系透析、冷凍干燥，得到核糖-血紅蛋白納米粒子。馬爾文粒度儀測(cè)量：粒子粒徑為175.8nm，粒徑分布為0.089。

實(shí)施例7核糖-珠蛋白納米粒子的制備

將摩爾比為120：1的核糖和珠蛋白溶解于pH＝12的緩沖溶液中，37℃攪拌反應(yīng)30小時(shí)，然后加入硼氫化鈉終止反應(yīng)，體系透析、冷凍干燥，得到核糖-珠蛋白納米粒子。馬爾文粒度儀測(cè)量：粒子粒徑為162.8nm，粒徑分布為0.189。原子力顯微鏡檢測(cè)：形狀為球形，粒徑范圍為100～130nm，見(jiàn)圖2。

實(shí)施例8阿拉伯糖-血紅蛋白納米粒子的制備

將摩爾比為150：1的阿拉伯糖和血紅蛋白溶解于pH＝9的緩沖溶液中，37℃攪拌反應(yīng)30小時(shí)，然后加入抗壞血酸終止反應(yīng)，體系透析、冷凍干燥，得到阿拉伯糖-血紅蛋白納米粒子。馬爾文粒度儀測(cè)量：粒子粒徑為277.2nm，粒徑分布為0.186。

實(shí)施例9木糖-血紅蛋白納米粒子的制備

將摩爾比為100：1的木糖和血紅蛋白溶解于pH＝12的緩沖溶液中，37℃攪拌反應(yīng)30小時(shí)，然后加入抗壞血酸終止反應(yīng)，體系透析、冷凍干燥，得到木糖-血紅蛋白納米粒子。馬爾文粒度儀測(cè)量：粒子粒徑為244.5nm，粒徑分布為0.048。

實(shí)施例10乳糖-血紅蛋白納米粒子的制備

將摩爾比為100：1的乳糖和血紅蛋白溶解于pH＝11的緩沖溶液中，37℃攪拌反應(yīng)30小時(shí)，然后加入硼氫化鈉終止反應(yīng)，體系透析、冷凍干燥，得到乳糖-血紅蛋白納米粒子。馬爾文粒度儀測(cè)量：粒子粒徑為172.9nm，粒徑分布為0.106。

實(shí)施例11乳糖-珠蛋白納米粒子的制備

將摩爾比為120：1的乳糖和珠蛋白溶解于pH＝11的緩沖溶液中，37℃攪拌反應(yīng)30小時(shí)，然后加入硼氫化鈉終止反應(yīng)，體系透析、冷凍干燥，得到乳糖-珠蛋白納米粒子。馬爾文粒度儀測(cè)量：粒子粒徑為182.7nm，粒徑分布為0.053。原子力顯微鏡檢測(cè)：形狀為球形，粒徑范圍為80～120nm，見(jiàn)圖3。

實(shí)施例12負(fù)載阿霉素的葡萄糖-珠蛋白納米粒子的制備

將實(shí)施例3制備的葡萄糖-珠蛋白納米粒子分散在pH＝9的緩沖溶液中，加入一定量的阿霉素水溶液，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，調(diào)節(jié)pH11，攪拌2小時(shí)，體系透析，冷凍干燥，得到負(fù)載阿霉素的葡萄糖-珠蛋白納米粒子。馬爾文粒度儀測(cè)量：粒子粒徑為234.5nm，粒徑分布為0.225，藥物負(fù)載量為84.93±5.74μg/mg。

實(shí)施例13負(fù)載紫杉醇的核糖-珠蛋白納米粒子的制備

將實(shí)施例7制備的核糖-珠蛋白納米粒子20mg分散在4mL pH＝9的緩沖溶液中，加入2mL二甲基亞砜，室溫?cái)嚢?小時(shí)，使其充分溶脹，再加入一定量的紫杉醇的二甲基亞砜溶液，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，體系透析、離心除去不溶物、冷凍干燥，得到負(fù)載紫杉醇的核糖-珠蛋白納米粒子。馬爾文粒度儀測(cè)量：粒子粒徑為256.8nm，粒徑分布為0.289，藥物負(fù)載量為64.93±6.84μg/mg。

實(shí)施例14鍵合熒光素FITC的葡萄糖-珠蛋白納米粒子的制備

將實(shí)施例3制備的葡萄糖-珠蛋白納米粒子分散在pH＝9的緩沖溶液中，按照熒光素FITC：納米粒子質(zhì)量比為0.15：1，加入異硫氰酸熒光素(FITC)的二甲基亞砜溶液，4℃攪拌過(guò)夜，再加入5mol/L的氯化銨溶液至其終濃度為50mmol/L，4℃攪拌2小時(shí)，終止反應(yīng)。體系透析、冷凍干燥，得到呈黃綠色的鍵合熒光素FITC的葡萄糖-珠蛋白納米粒子。

實(shí)施例15京尼平交聯(lián)的葡萄糖-珠蛋白納米粒子的制備

將實(shí)施例3制備的葡萄糖-珠蛋白納米粒子分散在pH＝9的緩沖溶液中，加入1％(w/w)的京尼平溶液使反應(yīng)體系中京尼平的濃度為0.2％，37℃震蕩反應(yīng)24小時(shí)，得藍(lán)色溶液，體系透析，冷凍干燥，得到京尼平交聯(lián)的葡萄糖-珠蛋白納米粒子。

實(shí)施例16糖-珠蛋白納米粒子的體外細(xì)胞存活率

細(xì)胞培養(yǎng)：選擇L-O2細(xì)胞(人肝細(xì)胞)和Hep G2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，培養(yǎng)基使用含有10％(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清以及雙抗(100單位/mL)的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％二氧化碳的無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞。

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，加入利用無(wú)糖或者4.5g/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基配置的糖-珠蛋白納米粒子溶液(實(shí)施例3葡萄糖-珠蛋白納米粒子、實(shí)施例7核糖-珠蛋白納米粒子、實(shí)施例11乳糖-珠蛋白納米粒子)，每組樣品重復(fù)5個(gè)孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，吸出孔中液體，加入0.1mL MTS檢測(cè)試劑，培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490nm波長(zhǎng)處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

實(shí)施例17負(fù)載阿霉素的葡萄糖-珠蛋白納米粒子的體外細(xì)胞存活率

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，加入阿霉素溶液和利用含有不同濃度葡萄糖(0，2.5g/L或4.5g/L)的DMEM培養(yǎng)基配置的負(fù)載阿霉素的葡萄糖-珠蛋白納米粒子溶液(實(shí)施例12)，每組樣品重復(fù)5個(gè)孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，吸出孔中液體，加入0.1mL MTS檢測(cè)試劑，培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490nm波長(zhǎng)處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

實(shí)施例18肝癌細(xì)胞和肝細(xì)胞對(duì)鍵合熒光素FITC的葡萄糖-珠蛋白納米粒子的細(xì)胞吞噬速度

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，吸出孔中液體，加入利用含有不同濃度葡萄糖(0，2.5g/L或4.5g/L)的DMEM培養(yǎng)基配置的鍵合熒光素FITC的葡萄糖-珠蛋白納米粒子溶液(實(shí)施例14)，分別于3、6、20、27小時(shí)后吸出孔中液體，細(xì)胞核染色，用高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)檢測(cè)各孔細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

實(shí)施例19肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素和負(fù)載阿霉素的葡萄糖-珠蛋白納米粒子的吞噬速度

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，吸出孔中液體，加入濃度為1μg/mL的阿霉素和利用含有不同濃度葡萄糖(0，2.5g/L或4.5g/L)的DMEM培養(yǎng)基配置的負(fù)載阿霉素的葡萄糖-珠蛋白納米粒子溶液(實(shí)施例12)，分別于3、6、18、24小時(shí)后吸出孔中液體，用高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)檢測(cè)各孔細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。

實(shí)施例20糖-珠蛋白納米粒子的在體毒性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)選擇體重為20±2g的BALB/c雄性裸鼠。將動(dòng)物分成四組，對(duì)照組通過(guò)尾靜脈注射0.2mL生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組注射0.2mL濃度為10mg/mL的葡萄糖-珠蛋白納米粒子(實(shí)施例3)、核糖-珠蛋白納米粒子(實(shí)施例7)、乳糖-珠蛋白納米粒子(實(shí)施例11)的生理鹽水溶液。常規(guī)飼養(yǎng)14天，觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的裸鼠死亡率。

結(jié)果顯示，觀察期內(nèi)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的裸鼠無(wú)死亡現(xiàn)象，小鼠活動(dòng)、攝食、毛發(fā)、大小便正常；體重呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明糖-珠蛋白納米粒子無(wú)嚴(yán)重急性中毒的危險(xiǎn)性。

實(shí)施例21糖-珠蛋白納米粒子的理化性能

配制不同濃度的糖-珠蛋白納米粒子溶液(實(shí)施例3、實(shí)施例7、實(shí)施例11)，觀察其理化性質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1不同濃度的糖-血紅蛋白納米粒子的理化性質(zhì)

實(shí)施例22糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品的膠體滲透壓

用生理鹽水沖洗膠體滲透壓儀滲透膜的兩側(cè)，1mL一次性注射器吸取濃度為2.5％的糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品，將其插入樣品孔，調(diào)零，按提示分步注入樣品，直至出現(xiàn)結(jié)果，每份樣品測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2三種糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品的膠體滲透壓

實(shí)施例23糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品的粘度

將糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品于37℃孵育15min，采用RM300+ST-100同軸旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)，選擇不同剪切速率測(cè)定濃度為2.5％的糖-珠蛋白血漿代用品的粘度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3三種糖-珠紅蛋白納米粒子血漿代用品的粘度

實(shí)施例24失血性休克模型的制備和血漿代用品的輸注

用2％戊巴比妥鈉(50mg/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，常規(guī)手術(shù)分離股動(dòng)脈、股靜脈和頸總動(dòng)脈并插管，靜脈輸注1000U/kg肝素鈉使全血肝素化。將頸動(dòng)脈插管與壓力傳感器相連記錄血壓，心電電極按標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)于動(dòng)物四肢記錄心電和心率，溫度傳感器插入肛門(mén)約5cm記錄直腸溫度，股動(dòng)脈插管聯(lián)于恒流泵以備放血，股靜脈用于全血回輸以及輸注糖-血紅蛋白納米粒子血漿代用品，用手術(shù)燈給動(dòng)物保溫。勻速放血15min，使平均動(dòng)脈壓MAP降至45mmHg，通過(guò)間斷放血使血壓維持在45～65mmHg約45min，制作失血性休克模型。

將模型大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、葡萄糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品給藥組(實(shí)施例3)、核糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品給藥組(實(shí)施例7)和乳糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品給藥組(實(shí)施例11)，經(jīng)股靜脈輸注生理鹽水、葡萄糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品、核糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品和乳糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品，用量為失血量的1/2，速度為0.5ml/min，檢測(cè)MAP、心電圖、肛溫和失血量，觀測(cè)動(dòng)物的存活情況。

模型大鼠失血量占總血量的百分比[總血量按照體重的6％(ml/g)計(jì)算]和血壓的結(jié)果表明，失血性休克大鼠模型制備成功，且組間不存在顯著性差異。

采用糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品對(duì)失血性休克大鼠進(jìn)行救治，可以觀測(cè)到動(dòng)物血容量擴(kuò)增。例如，給予糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品后某些時(shí)間，動(dòng)物血液中紅細(xì)胞壓積較對(duì)照組明顯下降(結(jié)果見(jiàn)表4)，血漿粘度較對(duì)照組明顯下降(結(jié)果見(jiàn)表5)。

表4失血性休克大鼠給予糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品不同時(shí)間的紅細(xì)胞壓積

表5失血性休克大鼠給予糖-珠蛋白納米粒子血漿代用品不同時(shí)間的血漿粘度