本申請屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種人參皂甙Rg1在制備脊髓損傷修復(fù)藥物的作用及大鼠脊髓損傷模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

脊髓損傷(spinalcordinjury，SCI)是臨床常見的一種致殘性嚴(yán)重創(chuàng)傷，其后果是神經(jīng)元死亡及軸突斷裂、神經(jīng)支配功能的喪失，導(dǎo)致患者發(fā)生嚴(yán)重的生理、心理和社會交往的障礙，同時給社會和家庭帶來沉重負擔(dān)，其治療是醫(yī)學(xué)界長期的難題和研究熱點。傳統(tǒng)觀點認為脊髓損傷后星形膠質(zhì)細胞(astrocyte，AS)增殖、膠質(zhì)瘢痕和空洞形成是阻礙損傷脊髓軸突有效再生和生長的主要因素。而近年來隨著神經(jīng)生理學(xué)、神經(jīng)細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)飛速發(fā)展，脊髓損傷的病理生理、修復(fù)機制的研究得以不斷深入，最新研究表明脊髓損傷后AS反應(yīng)和膠質(zhì)瘢痕微環(huán)境對神經(jīng)元存活、軸突再生、連接，甚至內(nèi)源性神經(jīng)干激活、分化均有重要作用，從而是決定脊髓損傷后神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)的關(guān)鍵因素。

活化AS、膠質(zhì)瘢痕及其間促進修復(fù)和抑制性細胞因子共同構(gòu)成的微環(huán)境是決定脊髓損傷修復(fù)的關(guān)鍵因素。因此，發(fā)展更好的藥物或分子工具以合理干預(yù)脊髓損傷后AS各階段病理生理應(yīng)答并調(diào)控上述各種細胞因子分泌和表達，使之達到最佳平衡狀態(tài)，啟動內(nèi)源性修復(fù)機制，充分發(fā)揮其對神經(jīng)支持、保護作用及對軸突再生的促進作用，調(diào)控其成熟期的過度增殖，誘導(dǎo)新生的AS成線性排列，改善膠質(zhì)瘢痕結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，為軸突再生和延長提供理想的支架和通道，是當(dāng)前脊髓損傷修復(fù)研究的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)和迫切任務(wù)。

然而目前該領(lǐng)域研究大多建立在膠質(zhì)瘢痕阻礙神經(jīng)再生的理論之上，致力于單方面抑制AS活化和膠質(zhì)瘢痕形成，用藥物、體外誘導(dǎo)、基因技術(shù)等實驗手段，只取得了有限成果，且過度抑制AS活化和膠質(zhì)瘢痕形成，不利于甚至有礙脊髓損傷修復(fù)。

人參作為傳統(tǒng)中藥具有補氣安神、增強神經(jīng)系統(tǒng)功能的藥效，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有興奮和抑制雙重作用，其中植物甾醇人參皂甙Rg1(ginsenoside Rg1)是作用于神經(jīng)系統(tǒng)的主要成分之一，其神經(jīng)藥理作用包括神經(jīng)元的營養(yǎng)、保護、延緩凋亡，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)活性及抑制神經(jīng)毒性、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用，可明顯提高體外培養(yǎng)神經(jīng)元及神經(jīng)干細胞的存活率和增殖能力，并具有促進周圍神經(jīng)軸突生長作用。

雖然脊髓損傷的大體機制基本闡明，但是基于植物甾醇人參皂甙Rg1的治療脊髓損傷的病理生理機制非常復(fù)雜，人們對此認識并不全面和深入，因而導(dǎo)致了一直困擾著臨床醫(yī)師對脊髓損傷的治療，為了尋求新的、有效的治療，更透徹地闡明脊髓損傷所涉及的復(fù)雜機制，更有效地評估脊髓損傷后干預(yù)手段的效果，需要有可靠性高、重復(fù)性好的符合臨床的脊髓損傷模型，由于無法依靠臨床開展系統(tǒng)的病理學(xué)研究，通過建立動物模型進行實驗研究則顯得尤為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本申請針對上述的問題，提供了一種人參皂甙Rg1在制備脊髓損傷修復(fù)藥物的應(yīng)用及大鼠脊髓損傷模型的構(gòu)建方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本申請公開了一種人參皂甙Rg1在制備脊髓損傷修復(fù)藥物的應(yīng)用。

本申請還公開了一種用于檢測Rg1對脊髓損傷修復(fù)作用的大鼠脊髓損傷模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)將大鼠麻醉并固定：所有大鼠經(jīng)1mL/100g水合氯醛腹腔注射麻醉后取俯臥位固定于操作臺；

2)確定椎體序列：用食指沿胸椎棘突從上至下觸摸，感知一明顯增大的棘突，為T10或T11棘突；

3)胸背部備皮，碘伏消毒、鋪巾，沿T10或T11棘突上緣作一長1.5cm-2cm的后正中切口，分離深筋膜，顯露棘突，鈍性剝離雙側(cè)椎旁肌，用3-0絲線將椎旁肌向兩側(cè)牽拉固定，繼續(xù)鈍性剝離T9或T10椎板；用顯微蚊鉗咬除T9或T10棘突及兩側(cè)椎板，暴露硬脊膜并保持其完整性；

4)將動脈血管夾兩頭對稱置于暴露的脊髓兩側(cè)，并保證動脈夾頭端觸及椎體后緣，此時突然釋放動脈夾，使脊髓遭受突然的夾閉損傷，2min后將動脈夾取下，此過程中大鼠后肢痙攣性抽搐，尾巴向兩側(cè)快速擺動，持續(xù)數(shù)秒；充分止血后由內(nèi)而外逐層縫合，碘伏棉球消毒并清除切口周緣血跡；將大鼠置于恒溫臺上復(fù)溫，待麻醉清醒后，大鼠后肢及尾部出現(xiàn)軟癱，即造模成功，

5)術(shù)后護理。

進一步地，術(shù)后護理具體為：分籠飼養(yǎng)，術(shù)后每隔8h行人工排尿一次，擠壓膀胱后及時清理會陰，保持會陰干燥，直至動物排尿反射恢復(fù)，期間觀察大鼠狀態(tài)，必要時為預(yù)防感染，每只大鼠肌注50mg/kg頭孢唑啉，持續(xù)3天。

進一步地，動脈血管夾的夾閉力量為15g。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明建立的動物模型可靠性高；非常類似于絕大多數(shù)人體脊髓損傷的實際過程；本發(fā)明建立的動物模型重復(fù)性好。

2)根據(jù)本發(fā)明的模型證實Rg1可輔助嗅鞘細胞移植對脊髓損傷有間接治療作用，而本發(fā)明的模型顯示Rg1也能對脊髓損傷直接起作用、促進神經(jīng)功能修復(fù)，因而有進一步深入研究的迫切需要。

3)本發(fā)明緊扣當(dāng)前脊髓損傷研究的一個長期熱點、難題和關(guān)鍵問題，建立“調(diào)控AS活化、平衡膠質(zhì)瘢痕微環(huán)境，啟動內(nèi)源性機制促進脊髓損傷修復(fù)”的先進理念，改進了“抑制AS活化和膠質(zhì)瘢痕增生”的傳統(tǒng)治療觀念，更符合脊髓損傷修復(fù)的病理生理過程。

4)本發(fā)明針對當(dāng)前醫(yī)學(xué)難題，用現(xiàn)代研究手段深'探索、發(fā)掘傳承數(shù)千年傳統(tǒng)中醫(yī)藥的現(xiàn)實應(yīng)用價值和機制，具有重要理論意義和現(xiàn)實價值，且Rg1作為傳統(tǒng)中藥單體成分，便于臨床應(yīng)用，前景廣闊，潛力巨大。

當(dāng)然，實施本申請的任一產(chǎn)品必不一定需要同時達到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本申請的進一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本申請14天后bcl-2，caspase-3的western檢測結(jié)果及光密度分析；

圖2是本申請14天后bcl-2，caspase-3的光密度分析；

圖3是本申請血清學(xué)SOD檢測結(jié)果；

圖4是本申請血清學(xué)MDA檢測結(jié)果；

圖5是本申請3組大鼠在3d、7d、14d時GFAP免疫染色觀察；

圖6是本申請3組大鼠在3d、7d、14d時GFAP陽性染色面積的比較。

具體實施方式

以下將配合附圖及實施例來詳細說明本申請的實施方式，藉此對本申請如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。

實施例1

一種人參皂甙Rg1在制備脊髓損傷修復(fù)藥物的應(yīng)用。

其中，具體的藥物是以人參皂甙Rg1為主成分，加入常規(guī)助劑，制備成注射液、膠囊、片劑、口服液等。

實施例2

一種用于檢測Rg1對脊髓損傷修復(fù)作用的大鼠脊髓損傷模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

所有大鼠經(jīng)10％水合氯醛腹腔注射(1mL/100g)麻醉后取俯臥位固定于操作臺，確定椎體序列：用食指沿胸椎棘突從上至下觸摸，感知一明顯增大的棘突，通常為T10或T11棘突。胸背部備皮，碘伏消毒、鋪巾，沿T10或T11棘突上緣作一長約1.5cm-2cm的后正中切口，分離深筋膜，顯露棘突，鈍性剝離雙側(cè)椎旁肌，用3-0絲線將椎旁肌向兩側(cè)牽拉固定，繼續(xù)鈍性剝離T9或T10椎板。用顯微蚊鉗咬除T9或T10棘突及兩側(cè)椎板，暴露硬脊膜并保持其完整性。將動脈血管夾(夾閉力量為15g)兩頭對稱置于暴露的脊髓兩側(cè)，并保證動脈夾頭端觸及椎體后緣，此時突然釋放動脈夾，使脊髓遭受突然的夾閉損傷，2min后將動脈夾取下，此過程中可見大鼠后肢痙攣性抽搐，尾巴向兩側(cè)快速擺動，持續(xù)數(shù)秒。充分止血后由內(nèi)而外逐層縫合，碘伏棉球消毒并清除切口周緣血跡。將大鼠置于恒溫臺上復(fù)溫，待麻醉清醒后，大鼠后肢及尾部出現(xiàn)軟癱，即造模成功。術(shù)后護理：分籠飼養(yǎng)，術(shù)后每隔8h行人工排尿一次，擠壓膀胱后及時清理會陰，保持會陰干燥，直至動物排尿反射恢復(fù)，期間觀察大鼠狀態(tài)，必要時為預(yù)防感染，每只大鼠肌注頭孢唑啉(50mg/kg)，持續(xù)3天。

基于上述用于檢測Rg1對脊髓損傷修復(fù)作用的大鼠脊髓損傷模型，采用含有人參皂甙Rg1的藥物研究人參皂甙Rg1促進大鼠急性脊髓損傷修復(fù)及相關(guān)機制，實驗結(jié)果如圖1-圖6所示，本發(fā)明研究表明Rg1顯著改善大鼠模型后肢運動功能：通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達、下調(diào)Caspase-3蛋白表達抑制神經(jīng)元凋亡；通過增強血清SOD活力、減少血清MDA含量發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用；更重要的是Rg1減少GFAP陽性染色的AS數(shù)量和膠質(zhì)瘢痕面積并減輕脊髓損傷區(qū)神經(jīng)元壞死、炎性細胞浸潤，改善了損傷局部微環(huán)境。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。