本發(fā)明涉及多肽水凝膠材料，具體涉及pH調(diào)控的短鏈多肽水凝膠及其制備和應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

多肽分子因其序列可調(diào)，合成方便，能夠響應(yīng)外界刺激而自發(fā)自組裝成水凝膠，最近二十年逐漸發(fā)展為流行的藥物載體材料。Schneider課題組在2004年報(bào)道了光敏水凝膠系列MAX7兩親多肽，在光催化作用下自組裝成凝膠。該方法制得的多肽水凝膠機(jī)械強(qiáng)度適中，抗外力干擾能力強(qiáng)，凝膠態(tài)穩(wěn)定，是良好的載藥材料。Castelletto等人研究了一種多肽凝膠體的穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)該凝膠體系可以緩慢而可逆地吸收和釋放小分子藥物。然而，多數(shù)報(bào)道中的兩親多肽序列等同度高，其凝膠態(tài)調(diào)控機(jī)制的可逆性差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種pH調(diào)控的短鏈多肽水凝膠及其制備和應(yīng)用方法，針對(duì)生理?xiàng)l件下藥物傳輸和釋放設(shè)計(jì)多肽水凝膠序列及凝膠可逆形成pH控制機(jī)制，酸性pH水凝膠提高藥物的生物利用率，降低毒副作用，對(duì)于高端昂貴藥物而言既節(jié)約成本，又提高經(jīng)濟(jì)效益。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：首先合成多肽單體序列，再以稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)體系pH以得到多肽水凝膠；該pH調(diào)控的短鏈多肽水凝膠的單體序列為：E（EVVE）_nEEEEE-NH₂，其中E = 谷氨酸，V= 纈氨酸，n =1, 2, 3；序列C端以氨基保護(hù)。

其中，所說(shuō)的單體序列反平行排列，以主鏈及側(cè)鏈多中心氫鍵連接反平行排列為纖維束狀β₂-折疊聚集態(tài)結(jié)構(gòu)；EEVVEEEEEE-NH₂的一維鏈狀結(jié)構(gòu)（a）及β₂ -折疊聚集態(tài)結(jié)構(gòu)（b）如下：

。

其中，pH調(diào)控的短鏈多肽水凝膠的制備方法，它包括下述步驟：

（1）凝膠初始化：向初始pH=7的1-1.5%wt的E（EVVE）_nEEEEE-NH₂多肽水溶液中緩慢滴加0.01M HCl溶液，容器放置于搖床上，振搖速度控制在100rpm以下，距離凝膠初始化pH 0.1時(shí)停止振搖，繼續(xù)滴加稀鹽酸溶液，并控制滴加速度為每次加入稀鹽酸導(dǎo)致的pH變化為0.01，直至到達(dá)凝膠初始化pH值；

（2）凝膠化完成：將上述到達(dá)凝膠初始化pH值的多肽溶液放置于37^oC培養(yǎng)箱中靜置，多肽自發(fā)自組裝成凝膠將于1-2小時(shí)內(nèi)完成，呈無(wú)色透明膠狀固體，在該溫度和pH條件下穩(wěn)定，冷凍干燥后得白色或淡黃色粉末；

（3）凍干粉的凝膠恢復(fù)：步驟（2）所得白色或淡黃色粉末，以對(duì)應(yīng)凝膠pH值的稀鹽酸或緩沖溶液快速溶解，并超聲波或者振搖，在37^oC靜置1-2小時(shí)，恢復(fù)凝膠態(tài)。

其中，步驟（1）中，對(duì)于n=1的單體序列，凝膠初始化pH=4.15。

其中，步驟（1）中，對(duì)于n=2的單體序列，凝膠初始化pH=4.30。

其中，步驟（1）中，對(duì)于n=3的單體序列，凝膠初始化pH=4.45。

其中，將一定比例的凝膠凍干粉和藥物分子混勻，以對(duì)應(yīng)凝膠pH值的稀鹽酸溶液快速溶解，并超聲波或者振搖，在37^oC靜置1-2小時(shí)，得到包結(jié)藥物水凝膠；在包結(jié)藥物水凝膠中加入pH 7.40的20 mM磷酸鹽緩沖溶液，37^oC恒溫培養(yǎng)箱中靜置，凝膠緩慢溶解2-4小時(shí)，得無(wú)色透明溶液。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明的制備工藝方法簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)，一方面通過(guò)序列中谷氨酸和纈氨酸親水疏水的片段誘發(fā)水凝膠的形成，另一方面通過(guò)谷氨酸殘基中羧基與主鏈肽鍵羰基的多中心氫鍵穩(wěn)定酸性pH下的凝膠結(jié)構(gòu)，增敏pH響應(yīng)性，得到可逆凝膠新結(jié)構(gòu)及對(duì)藥物分子的控釋新功能。

2、本發(fā)明選用含有谷氨酸和纈氨酸的親水疏水殘基片段的多肽序列通過(guò)多肽分子的自組裝制備了具有一定規(guī)則納米結(jié)構(gòu)并且響應(yīng)pH控制的可逆水凝膠材料，該材料在pH=4時(shí)為無(wú)色透明膠狀固體，微觀結(jié)構(gòu)為多中心氫鍵穩(wěn)定的β₂ -條帶結(jié)構(gòu)，該固體凍干后可快速恢復(fù)為凝膠，中性pH時(shí)凝膠溶解為無(wú)色或微黃色溶液，這樣的結(jié)構(gòu)及功能特性的新穎材料在藥物包結(jié)和pH調(diào)控藥物釋放和注射凍干劑型方面等藥物制劑科學(xué)領(lǐng)域?qū)?huì)到廣泛的應(yīng)用。

3、本發(fā)明可控多肽納米水凝膠材料成功地將微觀上具有β₂結(jié)構(gòu)的富含谷氨酸多肽序列的聚集行為與兩親多肽序列的凝膠行為結(jié)合在一起，制備了生物友好的pH調(diào)控納米水凝膠系列材料；多肽水凝膠材料的序列中，采用“兩親頭，雙氫鍵尾”的創(chuàng)新設(shè)計(jì)，利用谷氨酸和纈氨酸親水疏水的兩親排列構(gòu)成了多肽聚集體的蓄水凝膠核心，同時(shí)借助谷氨酸側(cè)鏈羧基對(duì)多肽主鏈的多中心氫鍵體系，進(jìn)一步穩(wěn)定了凝膠中多肽的β₂致密排列，完善了凝膠材料的pH響應(yīng)性。

4、本發(fā)明所得水凝膠材料可在生理pH條件下進(jìn)行控制溶膠，不僅生物友好性高于一般凝膠材料，且有作為藥物控釋載體的極大潛力，此特點(diǎn)奠定了這種多肽水凝膠材料在藥物傳輸和釋放技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。

5、凝膠凍干粉中多肽單體和藥物分子（替莫唑胺）物質(zhì)的量比為10:1，不同的藥物比例需要調(diào)整，這種多肽序列制得的凝膠是特別針對(duì)酸性pH下穩(wěn)定、生理?xiàng)l件下不穩(wěn)定的藥物分子的傳輸而設(shè)計(jì)的。

附圖說(shuō)明

圖1為兩親多肽序列及微觀排列結(jié)構(gòu)圖；

圖2為多肽水凝膠紅外譜圖及振動(dòng)圓二色譜圖；

圖3為多肽水凝膠TEM圖像和宏觀展示；

圖4為多肽水凝膠釋放替莫唑胺動(dòng)力學(xué)曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但不能理解為是對(duì)技術(shù)方案的限制。

實(shí)施例1：依以下步驟制備pH調(diào)控短鏈多肽水凝膠

（1）凝膠初始化：向初始pH=7的1.0%wt的E（EVVE）_nEEEEE-NH₂多肽水溶液中緩慢滴加0.01M HCl溶液，容器放置于搖床上，振搖速度控制在100rpm以下，距離凝膠初始化pH=4.15還有 0.1時(shí)停止振搖，繼續(xù)滴加稀鹽酸溶液，并控制滴加速度為每次加入稀鹽酸導(dǎo)致的pH變化為0.01，直至到達(dá)凝膠初始化pH=4.15；

（2）凝膠化完成：將上述到達(dá)凝膠初始化pH=4.15的多肽溶液放置于37^oC培養(yǎng)箱中靜置，多肽自發(fā)自組裝成凝膠將于1小時(shí)內(nèi)完成，呈無(wú)色透明膠狀固體，在37^oC和pH=4.15條件下穩(wěn)定，冷凍干燥后得白色粉末；

（3）凍干粉的凝膠恢復(fù)：步驟（2）所得白色粉末，以pH=4.15的稀鹽酸溶液快速溶解，超聲波輔助，在37^oC靜置1小時(shí)，恢復(fù)凝膠態(tài)。

實(shí)施例2：依以下步驟制備pH調(diào)控短鏈多肽水凝膠

（1）凝膠初始化：向初始pH=7的1.25%wt的E（EVVE）_nEEEEE-NH₂多肽水溶液中緩慢滴加0.01M HCl溶液，容器放置于搖床上，振搖速度控制在100rpm以下，距離凝膠初始化pH=4.30還有 0.1時(shí)停止振搖，繼續(xù)滴加稀鹽酸溶液，并控制滴加速度為每次加入稀鹽酸導(dǎo)致的pH變化為0.01，直至到達(dá)凝膠初始化pH=4.30；

（2）凝膠化完成：將上述到達(dá)凝膠初始化pH=4.30的多肽溶液放置于37^oC培養(yǎng)箱中靜置，多肽自發(fā)自組裝成凝膠將于1.5小時(shí)內(nèi)完成，呈無(wú)色透明膠狀固體，在37^oC和pH=4.30條件下穩(wěn)定，冷凍干燥后得淡黃色粉末；

（3）凍干粉的凝膠恢復(fù)：步驟（2）所得淡黃色粉末，以pH=4.30的緩沖溶液快速溶解，并振搖，在37^oC靜置1.5小時(shí)，恢復(fù)凝膠態(tài)。

實(shí)施例3：依以下步驟制備pH調(diào)控短鏈多肽水凝膠

（1）凝膠初始化：向初始pH=7的1.5%wt的E（EVVE）_nEEEEE-NH₂多肽水溶液中緩慢滴加0.01M HCl溶液，容器放置于搖床上，振搖速度控制在100rpm以下，距離凝膠初始化pH=4.45還有 0.1時(shí)停止振搖，繼續(xù)滴加稀鹽酸溶液，并控制滴加速度為每次加入稀鹽酸導(dǎo)致的pH變化為0.01，直至到達(dá)凝膠初始化pH=4.45；

（2）凝膠化完成：將上述到達(dá)凝膠初始化pH=4.45的多肽溶液放置于37^oC培養(yǎng)箱中靜置，多肽自發(fā)自組裝成凝膠將于2小時(shí)內(nèi)完成，呈無(wú)色透明膠狀固體，在37^oC和pH=4.45條件下穩(wěn)定，冷凍干燥后得白色粉末；

（3）凍干粉的凝膠恢復(fù)：步驟（2）所得白色粉末，以pH=4.45的稀鹽酸溶液快速溶解，并超聲波，在37^oC靜置2小時(shí)，恢復(fù)凝膠態(tài)。

實(shí)施例4：EEVVEEEEEE-NH₂多肽水凝膠包結(jié)替莫唑胺

取實(shí)施例1所得凝膠凍干粉，將摩爾比為10:1的凝膠凍干粉和藥物分子混合后，以對(duì)應(yīng)凝膠pH=4.15的稀鹽酸溶液快速溶解，并超聲波或者振搖，在37^oC靜置1小時(shí)，得到包結(jié)藥物水凝膠；此包結(jié)藥物水凝膠中加入pH 7.40的20 mM磷酸鹽緩沖溶液，37^oC恒溫培養(yǎng)箱中靜置，凝膠緩慢溶解2小時(shí)，得無(wú)色透明溶液。

實(shí)施例5：EEVVEEEEEE-NH₂多肽水凝膠包結(jié)替莫唑胺

取實(shí)施例2所得凝膠凍干粉，將摩爾比為10:1的凝膠凍干粉和藥物分子混合后，以對(duì)應(yīng)凝膠pH=4.30的稀鹽酸溶液快速溶解，并超聲波或者振搖，在37^oC靜置1.5小時(shí)，得到包結(jié)藥物水凝膠；此包結(jié)藥物水凝膠中加入pH 7.40的20 mM磷酸鹽緩沖溶液，37^oC恒溫培養(yǎng)箱中靜置，凝膠緩慢溶解3小時(shí)，得無(wú)色透明溶液。

實(shí)施例6：EEVVEEEEEE-NH₂多肽水凝膠包結(jié)替莫唑胺

取實(shí)施例3所得凝膠凍干粉，將摩爾比為10:1的凝膠凍干粉和藥物分子混合后，以對(duì)應(yīng)凝膠pH=4.45的稀鹽酸溶液快速溶解，并超聲波或者振搖，在37^oC靜置2小時(shí)，得到包結(jié)藥物水凝膠；此包結(jié)藥物水凝膠中加入pH 7.40的20 mM磷酸鹽緩沖溶液，37^oC恒溫培養(yǎng)箱中靜置，凝膠緩慢溶解4小時(shí)，得無(wú)色透明溶液。

多肽水凝膠的表征：

（1）實(shí)施例1-3所得多肽水凝膠的多肽序列及微觀排列結(jié)構(gòu)如圖1所示。

（2）EEVVEEEEEE-NH2多肽水凝膠的紅外及圓二色光譜表征：多肽水凝膠的構(gòu)象由Bruker-80 IR紅外光譜儀和色散型振動(dòng)圓二色譜儀測(cè)定（自制VCD，A. Lakhani, P. Malon, and T. A. Keiderling, Appl. Spectrosc. 63, 775 (2009).），如圖2所示，紅外譜圖中1730cm^-1峰代表谷氨酸側(cè)鏈羧基的規(guī)則排列，而1600 cm^-1的尖峰代表多肽鏈按β₂-折疊結(jié)構(gòu)反平行排列；振動(dòng)圓二色光譜的峰型（從低波數(shù)到高波數(shù)先正后負(fù)）證實(shí)了反平行排列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)高的峰強(qiáng)度表明多肽水凝膠高度聚集。

（3）EEVVEEEEEE-NH₂多肽水凝膠的顯微圖像測(cè)定：顯微結(jié)構(gòu)測(cè)定采用JEM 1220型透射電子顯微鏡，其透射電子顯微鏡圖如圖3所示，其顯示出規(guī)則的層疊納米條帶結(jié)構(gòu)。

（4）EEVVEEEEEE-NH₂多肽水凝膠包結(jié)替莫唑胺的溶膠動(dòng)力學(xué)表征：通過(guò)紫外光譜（Cary-300）跟蹤替莫唑胺在250 nm處的吸光度值，同時(shí)以熒光光譜（Fluoromax3）跟蹤水凝膠的溶解；如圖4所示，替莫唑胺的吸光度緩慢升高，表示藥物分子脫離凝膠體系進(jìn)入水溶液態(tài)，在~4h達(dá)到最大釋放度；而以ThT（硫黃素T）跟蹤多肽聚集過(guò)程，其熒光強(qiáng)度的降低表明多肽β₂-折疊聚集度的降低即水凝膠的溶解，該過(guò)程與替莫唑胺的釋放基本同步。