本發(fā)明涉及一種脫脂米糠中多酚物質(zhì)的提取方法。

背景技術(shù)：

米糠是碾米過程中剝落下來的皮層、米胚和少量碎米的混合物，是稻米加工不可避免的副產(chǎn)物，約占稻谷谷粒質(zhì)量的5-5.5％?，F(xiàn)代流行病學(xué)研究表明，食用全粒谷物或相關(guān)產(chǎn)品對降低心腦血管等慢性疾病具有很好的效果，這主要歸功于全粒谷物中獨一無二的游離多酚類物質(zhì)。但谷物中單純的游離酚酸含量并不多，主要通過氫鍵、疏水相互作用或共價鍵與蛋白質(zhì)、糖類等結(jié)合。根據(jù)結(jié)合緊密程度，可以將稻谷中的酚酸分為游離形式、可溶性結(jié)合形式或不可溶結(jié)合三種，其中游離酚酸與其他基質(zhì)集合較為松散，用有機溶劑可以直接將其提取出來。而與纖維素、脂蛋白結(jié)合形成的不溶性多酚化合物采用一般的有機溶劑很難將其提取出來。

從目前資料分析，大多數(shù)研究者都直接利用甲醇、乙醇或丙酮對谷物中多酚物質(zhì)進行，為了提高提取得率，多采用降低顆粒度、延長提取時間或者提高提取穩(wěn)定等方法，但此類方法僅能提取出谷物中的游離多酚和可溶性結(jié)合酚酸，無法提取不溶性的結(jié)合多酚，因此提取效果均不理想。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種脫脂米糠中多酚物質(zhì)的提取方法，可獲得較高的提取率。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種脫脂米糠中多酚物質(zhì)的提取方法，包括以下步驟：

步驟一，預(yù)處理：取新鮮米糠晾干后粉碎，20-60目過篩后-20℃冷凍存儲；

步驟二，脫脂：稱取粉碎后的米糠粉，放入己烷中浸泡，抽濾后再加入己烷浸泡，重復(fù)3-5次以去除米糠中的脂肪，抽濾完成后將濾渣后放于70℃恒溫烘箱干燥；

步驟三，堿水解：稱取干燥后的脫脂米糠粉，按照料液比為1:5～1:9放入濃度為0.5～3.0mol/l的naoh溶液中進行結(jié)合酚類物質(zhì)的水解，水解1～4h后hcl調(diào)節(jié)ph至3.0-5.0；

步驟四，提?。簩⒉襟E三獲得的水解液用乙醇提取3-5次，混合提取液真空濃縮后，用乙酸乙酯萃取完全，硫酸鈉脫水后再次濃縮，用甲醇溶解并定容。

優(yōu)選地，步驟四中進行所述乙醇提取的過程中，將水解液與50-100％的乙醇混合后，放入超聲儀中超聲處理6-12min，然后再采用離心分離的方法取上清液，重復(fù)3-5次。

優(yōu)選地，步驟一中進行所述預(yù)處理時，先將新鮮米糠放入100℃烘箱中，15min后取出晾干。

優(yōu)選地，步驟一中所述米糠的粉碎粒度為60目，步驟三中所述料液比為1:8，naoh濃度為2.5mol/l、水解時間為2.0h。

優(yōu)選地，步驟四中所述超聲處理時間為11.72min、乙醇濃度為71.56％，步驟三中所述ph調(diào)節(jié)至4.56。

優(yōu)選地，步驟二中所述米糠粉和己烷的料液比為1:20，浸泡時間為60min。

本發(fā)明所達到的有益效果：

1.采用本發(fā)明所獲得的提取液，多酚提取得率高；

2.本發(fā)明采用超聲波處理方法輔助進行水解，進一步提高多酚提取率，經(jīng)含量測定檢測，提取得率均為60mg/100g以上；在將提取方法優(yōu)化為以下參數(shù)的情況下，可使提取得率提高至200mg/100g以上：米糠的粉碎粒度為60目，步驟三中所述料液比為1:8，naoh濃度為2.5mol/l、水解時間為2.0h，ph調(diào)節(jié)至4.56，步驟四中所述超聲處理時間為11.72min、乙醇濃度為71.56％；

3.本發(fā)明預(yù)處理工藝中，新鮮米糠自工廠取樣后迅速放入100℃烘箱中，可消除內(nèi)源脂肪酶活性，避免了新鮮米糠因組織破壞而游離出來的脂肪酶水解脂肪產(chǎn)生惡臭的游離脂肪酸。

因此，本發(fā)明所提供的一種脫脂米糠中多酚物質(zhì)的提取方法，多酚提取得率高、對多酚提取物的活性破壞小，可應(yīng)用到脫脂米糠中多酚物質(zhì)的提取生產(chǎn)中，為脫脂米糠的資源開發(fā)應(yīng)用提供較好的途徑。

附圖說明

圖1是阿魏酸與提取液紫外掃描光譜圖；

圖2是阿魏酸標準曲線；

圖3是粉碎粒度對多酚提取得率的影響；

圖4是料液比對多酚提取得率的影響；

圖5是naoh溶液濃度對多酚提取得率的影響；

圖6是水解時間對多酚提取得率的影響；

圖7是超聲作用時間對多酚提取得率的影響；

圖8是乙醇濃度對多酚提取得率的影響；

圖9是ph值對多酚提取得率的影響；

圖10是時間與濃度對提取得率影響等高線；

圖11是時間與濃度對提取得率影響三維圖；

圖12是時間與ph值對提取得率影響等高線；

圖13是時間與ph值對提取得率影響三維圖；

圖14是濃度與ph值對提取得率影響等高線；

圖15是濃度與ph值對提取得率影響三維圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例一

一種脫脂米糠中多酚物質(zhì)的提取方法，包括以下步驟：

步驟一，預(yù)處理：取新鮮米糠放入100℃烘箱中，15min后取出晾干，晾干后用萬能粉碎機粉碎，20目過篩后-20℃冷凍存儲；

步驟二，脫脂：準確稱取10g粉碎后的米糠粉樣品，放入200ml己烷中浸泡60min，抽濾后再加入200ml己烷浸泡60min，重復(fù)3次以去除米糠中的脂肪，抽濾完成后將濾渣后放于70℃恒溫烘箱干燥4h；

步驟三，堿水解：稱取干燥后的脫脂米糠粉，按照料液比為1:5放入濃度為0.5mol/l的naoh溶液中進行結(jié)合酚類物質(zhì)的水解，水解1h后hcl調(diào)節(jié)ph至3.0；

步驟四，提取：將步驟三獲得的水解液與50％的乙醇混合后，放入超聲儀中超聲處理6min，然后再采用離心分離的方法取上清液，重復(fù)3次，混合提取液真空濃縮后，用乙酸乙酯萃取完全，硫酸鈉脫水后再次濃縮，用甲醇溶解并定容至10ml。

優(yōu)選地，步驟一中所述米糠的粉碎粒度為60目，步驟三中所述料液比為1:8，naoh濃度為2.5mol/l、水解時間為2.0h。

優(yōu)選地，步驟四中所述超聲處理時間為11.72min、乙醇濃度為71.56％，步驟三中所述ph調(diào)節(jié)至4.56。

實施例二

一種脫脂米糠中多酚物質(zhì)的提取方法，包括以下步驟：

步驟一，預(yù)處理：取新鮮米糠放入100℃烘箱中，15min后取出晾干，晾干后用萬能粉碎機粉碎，60目過篩后-20℃冷凍存儲；

步驟二，脫脂：準確稱取10g粉碎后的米糠粉樣品，放入200ml己烷中浸泡60min，抽濾后再加入200ml己烷浸泡60min，重復(fù)3次以去除米糠中的脂肪，抽濾完成后將濾渣后放于70℃恒溫烘箱干燥4h；

步驟三，堿水解：稱取干燥后的脫脂米糠粉，按照料液比為1:9放入濃度為3.0mol/l的naoh溶液中進行結(jié)合酚類物質(zhì)的水解，水解4h后hcl調(diào)節(jié)ph至5.0；

步驟四，提?。簩⒉襟E三獲得的水解液與100％的乙醇混合后，放入超聲儀中超聲處理12min，然后再采用離心分離的方法取上清液，重復(fù)3次，混合提取液真空濃縮后，用乙酸乙酯萃取完全，硫酸鈉脫水后再次濃縮，用甲醇溶解并定容至10ml。

實施例三

一種脫脂米糠中多酚物質(zhì)的提取方法，包括以下步驟：

步驟一，預(yù)處理：取新鮮米糠放入100℃烘箱中，15min后取出晾干，晾干后用萬能粉碎機粉碎，60目過篩后-20℃冷凍存儲；

步驟二，脫脂：準確稱取10g粉碎后的米糠粉樣品，放入200ml己烷中浸泡60min，抽濾后再加入200ml己烷浸泡60min，重復(fù)3次以去除米糠中的脂肪，抽濾完成后將濾渣后放于70℃恒溫烘箱干燥4h；

步驟三，堿水解：稱取干燥后的脫脂米糠粉，按照料液比為1:8放入濃度為2.5mol/l的naoh溶液中進行結(jié)合酚類物質(zhì)的水解，水解2h后hcl調(diào)節(jié)ph至4.56；

步驟四，提取：將步驟三獲得的水解液與71.56％的乙醇混合后，放入超聲儀中超聲處理11.72min，然后再采用離心分離的方法取上清液，重復(fù)3次，混合提取液真空濃縮后，用乙酸乙酯萃取完全，硫酸鈉脫水后再次濃縮，用甲醇溶解并定容至10ml。

提取工藝的優(yōu)化

1材料與儀器

1.1實驗材料

新鮮米糠由江蘇淮安禾香源米廠提供；

阿魏酸(ferulicacid)、folin-ciocalteu試劑：中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W(xué)試劑公司；

無水乙醇、乙酸乙酯、己烷等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗儀器

wf180萬能粉碎機：上海光學(xué)儀器廠；

re-2000a旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；

bs-1e振蕩培養(yǎng)箱：蘇州威爾實驗用品有限公司；

tu-1900紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

vf203真空抽濾裝置：北京桑翌實驗儀器研究所；

ja1003a電子精密天平：上海倫捷機電儀表有限公司；

phs-3c酸度計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

se-2334恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；

jy92–dn超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

2實驗方法

2.1樣品處理

2.1.1預(yù)處理

為避免新鮮米糠因組織破壞而游離出來的脂肪酶水解脂肪產(chǎn)生惡臭的游離脂肪酸，米糠自工廠取樣后迅速放入100℃烘箱中以消除內(nèi)源脂肪酶活性，15min后取出晾干，萬能粉碎機粉碎，過篩后置于-20℃條件下冷凍儲存。

2.1.2脫脂

準確稱取10.00g粉碎后的米糠粉樣品，放入200ml己烷中浸泡60min，抽慮后再加入200ml己烷浸泡60min，重復(fù)3次以去除米糠中的脂肪，抽濾完成后將濾渣后放于70℃恒溫烘箱干燥4h。

2.2堿水解工藝條件的研究

準確稱取10.00g干燥后的脫脂米糠粉樣品，放入一定濃度的naoh溶液中進行結(jié)合酚類物質(zhì)的水解，水解結(jié)束后hcl調(diào)節(jié)ph，用足量75％乙醇提取3次?；旌咸崛∫赫婵諠饪s后，用足量乙酸乙酯萃取完全，硫酸鈉脫水后再次濃縮，用甲醇溶解并定容至10ml，采用folin-ciocalteu法進行多酚提取得率測定。以多酚提取得率為指標，采用單因素和正交試驗設(shè)計考察顆粒度、料液比、naoh溶液和水解時間對水解效果的影響。

2.3超聲波提取工藝條件的研究

在最佳水解工藝條件下獲取水解液，hcl調(diào)節(jié)ph后，加入100ml一定濃度的乙醇溶液浸泡并放于超聲細胞粉碎機中超聲處理，離心機分離取上清液，重復(fù)3次。混合提取液真空濃縮后，用足量乙酸乙酯萃取完全，硫酸鈉脫水后再次濃縮，用甲醇溶解并定容至10ml，采用folin-ciocalteu法進行多酚提取得率測定。以多酚提取得率為指標，采用單因素和box-benhnken響應(yīng)面設(shè)計考察超聲波處理時間、乙醇濃度和溶液ph溶液和水解時間對萃取效果的影響。

2.4多酚物質(zhì)含量的測定

2.4.1測定波長的確定

準確量取阿魏酸標準溶液、米糠多酚甲醇溶解液各1.0ml于50ml比色管中，分別加入20％的folin-ciocalteu試劑各1ml，混勻后靜置5min，再分別加入7.5％na2co3溶液4ml，振搖1min后，用純水定容至50ml，然后用錫紙包裹，在30℃下靜置30min。以純水做基線，用紫外-可見分光光度計在600～850nm范圍內(nèi)進行掃描，得到阿魏酸標準品與folin-ciocalteu試劑顯色反應(yīng)后的吸收光譜，與米糠多酚溶液吸收光譜進行比較，確定最大吸收波長。

2.4.2標準曲線的繪制

準確量取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml1.00mg/ml阿魏酸標準溶液于50ml比色管中，分別加入20％folin-ciocalteu試劑1ml，混勻后靜置5min，再分別加入7.5％na2co3溶液4ml，振搖1min后，用純水定容至50ml，然后用錫紙包裹，在30℃下靜置30min。以純水做基線，在768nm波長下測吸光度。以阿魏酸標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

2.4.3多酚物質(zhì)含量測定方法

精確量取多酚提取液1.0ml于50ml比色管中，按照2.3.1方法進行吸光度值測定，根據(jù)標準曲線和計算提取液中多酚物質(zhì)濃度，然后根據(jù)公式計算樣品中多酚提取得率。

式中：c-提取液多酚濃度(mg/ml)；v-提取液體積(ml)；m-樣品質(zhì)量(g)。

3結(jié)果與分析

3.1波長的確定

由圖1所示的紫外掃描光譜圖可知，阿魏酸(光譜圖a)和米糠提取物(光譜圖b)均能與folin-ciocalteu試劑反應(yīng)，這主要是因為阿魏酸和米糠中的多酚物質(zhì)均含有酚羥基基團，能與folin-ciocalteu試劑中的鎢鉬酸相互反應(yīng)，生成藍色絡(luò)合物。由圖1可知，阿魏酸和米糠提取物在600-850nm范圍內(nèi)光譜圖趨勢基本一致，兩者的最大吸收波長也非常相近，其中阿魏酸為768nm，而米糠提取物為755nm。這說明用阿魏酸作為參比對米糠中多酚物質(zhì)進行測定的選擇是正確的，這一結(jié)果與廖律所得結(jié)論相一致。同時一定程度上說明了阿魏酸可能是米糠多酚物質(zhì)中最主要的組成部分。因此本實驗選擇阿魏酸作為標準品在768nm條件下進行吸光度測定。

3.2標準曲線的繪制

由圖2可知，在0-70μg/ml^a范圍內(nèi)，阿魏酸標準溶液濃度和吸光度的關(guān)系符合線性回歸方程y＝0.0082x-0.0015，線性相關(guān)度較高(r²＝0.9991)，符合朗伯比爾定律，可用于多酚含量測定。

3.3堿水解工藝條件的確定

3.3.1粉碎粒度對水解效果的影響

準確稱取粒度分別為20目、30目、40目、50目、60目、70目的干燥脫脂米糠粉樣品各10.00g，分別放入100ml濃度為2.0mol/l的naoh溶液水解4.0h。按照操作步驟2.3進行多酚物質(zhì)的萃取，以多酚提取得率為評價指標，考察粉碎粒度對多酚提取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著目數(shù)的逐漸增大，多酚提取得率先增加后降低。這主要是因為目數(shù)越大，米糠粒度越小，單位重量的比表面積越大，與堿性na+離子接觸的面積越大，酯鍵、糖苷鍵、醚苷鍵等越有機會接觸na+離子而被分解，因此在20-50目時分解速度逐漸加快。但當目數(shù)超過50后，提取得率反而下降，這可能是因為米糠粉碎過細，容易在水溶液中沉積形成大的絮狀團，進而產(chǎn)生沉淀，阻礙了堿液與不溶性多酚的接觸。另外，米糠中殘留的淀粉類物質(zhì)也會增加溶液的粘度，造成乙酸乙酯萃取困難。因此粉碎粒度以50左右為宜。

3.3.2料液比對水解效果的影響

準確稱取粒度為50目的干燥脫脂米糠粉樣品各10.00g，分別放入50、60、70、80、90、100、110、120ml(料液比分別為1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12)濃度為2.0mol/l的naoh溶液水解4.0h。按照操作步驟2.3進行多酚物質(zhì)的萃取，以多酚提取得率為評價指標，考察料液比對多酚提取效果的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當料液比為1：5時，多酚提取得率最低(19.12mg/100g)，這主要是因為1：5的情況下，米糠粉末溶液呈粘稠狀態(tài)，每個米糠小顆粒周圍堿離子的濃度過低，因此分解速度很慢。同時米糠中少量的淀粉也使得溶液粘度增大，阻礙了分子的運動速度，降低了反應(yīng)速度。隨著料液比的逐漸增大，多酚提取得率逐漸增大，當料液比為1：8時，提取得率達到最高值(145.35mg/100g)。當料液比超過1：8時，多酚提取得率逐漸下降。這可能是因為過多的水造成多酚溶液濃度降低，即降低了乙醇溶液與乙酸乙酯兩相中多酚濃度差，動態(tài)平和點增加，萃取變得不徹底。因此選擇料液比為1：8為宜，即naoh的添加量為80ml。

3.3.3naoh溶液濃度對水解效果的影響

準確稱取粒度為50目的干燥脫脂米糠粉樣品各10.00g，分別放入80ml濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mol/l的naoh溶液水解4.0h。按照操作步驟2.3進行多酚物質(zhì)的萃取，以多酚提取得率為評價指標，考察naoh溶液濃度對多酚提取效果的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當不加入naoh(cnaoh＝0)時，米糠中多酚物質(zhì)提取得率非常低(僅為19.13mg/100g)，這主要是因為谷物中多酚物質(zhì)主要以結(jié)合形式存在，游離的只有15-20％。隨著naoh濃度的不斷增加，多酚提取得率先快速增加后緩慢降低。這主要是因為naoh是解離復(fù)合鍵最主要的物質(zhì)，只有足夠多的naoh分子，才能與結(jié)合鍵相互反應(yīng)生產(chǎn)游離的多酚。當naoh濃度達到2.0mol/l時，多酚提取得率達到最高點(179.52mg/100g)，之后，隨naoh濃度的逐漸增加，多酚提取得率反而下降，這主要是因為酚類物質(zhì)在酸性條件下比較穩(wěn)定，而在強堿作用下會因分子斷裂而分解成其他物質(zhì)。同時強堿也加速了淀粉、纖維素等物質(zhì)的水解，使溶液粘稠度增加，增加了萃取的難度。因此naoh濃度為2.0mol/l比較適合實驗需要。

3.3.4堿水解時間對水解效果的影響

準確稱取粒度為50目的干燥脫脂米糠粉樣品各10.00g，分別放入80ml濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mol/l的naoh溶液水解4.0h。按照操作步驟2.3進行多酚物質(zhì)的萃取，以多酚提取得率為評價指標，考察naoh溶液濃度對多酚提取效果的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，多酚提取得率受水解時間的影響較大，在開始的0.5h，水解效果很差。隨著時間的延長，提取得率快速上升，并在2h時達到最高點(提取得率達到190.54mg/100g)。但超過2h后提取得率又出現(xiàn)較大幅度的下降。這可能是因為堿液長時間與多酚物質(zhì)接觸會致其分解導(dǎo)致的。因此選擇2h的水解時間較好。

3.3.5最佳堿水解條件的確定

在單因素的基礎(chǔ)上，以多酚提取得率為評價指標，以粉碎粒度、料液比、naoh濃度和水解時間為因素，采用l9(34)四因素三水平正交試驗確定堿水解的最佳條件。因素水平見表1。正交試驗結(jié)果見表2。

表1堿水解因素水平表

表2堿水解正交實驗結(jié)果

由表2中極差r值可以看出各因素對提取得率的影響次序為：c＞b＞d＞a，即naoh濃度對提取得率的影響最大，料液比次之，粉碎粒度對提取得率的影響最小。由表2中提取得率水平對應(yīng)的k值可以看出，本實驗的最佳組合a3b2c3d2，即預(yù)估最佳堿水解條件為：粉碎粒度60目、料液比1：8、naoh濃度2.5mol/l、水解時間2.0h。

正交試驗推算最佳水解條件不在9個實驗序列表中，為驗證結(jié)果正確性，按推算提取條件補做3次驗證實驗，結(jié)果見表3。

由表3可知，在預(yù)估的提取條件下，多酚的提取得率均高于正交試驗和前期單因素實驗結(jié)果(208.73mg/100g)，且數(shù)據(jù)相對穩(wěn)定，因此此條件可以作為水解的最佳條件。

表3驗證實驗結(jié)果

3.4提取工藝條件的確定

3.4.1超聲波作用時間對提取效果的影響

準確稱取10.00g干燥脫脂米糠粉樣品各7份，在最佳水解工藝條件下獲取水解液，hcl調(diào)節(jié)ph至3.0，加入100ml濃度為70％的乙醇溶液，分別置于超聲細胞粉碎機中處理1、3、5、7、9、11、13、15min，重復(fù)3次。濃縮后用足量乙酸乙酯萃取完全，硫酸鈉脫水后再次濃縮，用甲醇溶解并定容至10ml，采用folin-ciocalteu法進行多酚提取得率測定。以多酚提取得率為指標，考察超聲波處理時間對萃取效果的影響，實驗結(jié)果見圖7。

由圖7可知，多酚提取得率隨著超聲波作用時間的延長先快速增加，后緩慢降低?？焖僭黾拥脑蛑饕牵撼暡ㄌ幚頃r產(chǎn)生的聲場會在極短的時間內(nèi)在乙醇溶液和細胞內(nèi)部形成空化泡，并瞬間脹大隨后破裂，釋放出巨大能量，提高乙醇溶液溫度，加快分子運動速度；在釋放能量的同時也會產(chǎn)生強大的沖擊波和微聲流，造成細胞內(nèi)部壓力瞬間提升，局部細胞壁快速破裂，加快多酚物質(zhì)的溶出。同時超聲波通過獨特的機械振動作用使得多酚等有效成分和乙醇溶液分子快速進入振動狀態(tài)，增加分子動態(tài)能量，進而提高提取得率，縮短提取時間。但由圖也可以看出，當超聲波作用時間超過10min后，多酚提取得率略有下降，這主要是因為超聲波可以產(chǎn)生較高的熱效應(yīng)，溶液溫度增加，部分不穩(wěn)定多酚出現(xiàn)轉(zhuǎn)化或分解。因此選擇超聲波作用時間為10min為宜。

3.4.2乙醇濃度對提取效果的影響

準確稱取10.00g干燥脫脂米糠粉樣品各6份，在最佳水解工藝條件下獲取水解液，hcl調(diào)節(jié)ph至3.0，加入100ml濃度分別為40、50、60、70、80、90、100％的乙醇溶液，置于超聲細胞粉碎機中超聲處理5min，重復(fù)3次。濃縮后用足量乙酸乙酯萃取完全，硫酸鈉脫水后再次濃縮，用甲醇溶解并定容至10ml，采用folin-ciocalteu法進行多酚提取得率測定。以多酚提取得率為指標，考察乙醇濃度對萃取效果的影響，實驗結(jié)果見圖8。

根據(jù)相似相溶原理可知，溶質(zhì)和提取劑極性越相近，提取效果越好。但米糠中多酚是以環(huán)木菠蘿醇類為主體阿魏酸酯與甾醇類阿魏酸酯組成一種天然混合物，包含阿魏酸、對香豆酸、原兒茶酸、沒食子酸、咖啡酸，芥子酸單體及其結(jié)合酚酸等，極性各不相同，因此提取過程中應(yīng)盡量選擇與混合多酚極性最相近的提取溶劑。

由圖8可知，在較低的乙醇濃度(40％)時，米糠中多酚物質(zhì)的提取得率很低(僅為110.76mg/100g)，隨著乙醇濃度的加大，提取得率逐漸增大，這主要是因為米糠中的多酚主要以阿魏酸、咖啡酸等極性較弱的物質(zhì)組成，增加極性較小的乙醇比例勢必降低極性，與多酚的極性越接近，因此提取效果較好。當乙醇濃度大于70％以后，溶液極性變得很小，部分水溶性的極性酚酸反而析出。因此確定乙醇濃度為70％進行提取處理。

3.4.3溶液ph值對提取效果的影響

準確稱取10.00g干燥脫脂米糠粉樣品各7份，在最佳水解工藝條件下獲取水解液，分別用hcl調(diào)節(jié)ph至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，然后分別加入100ml濃度為70％的乙醇溶液，置于超聲細胞粉碎機中超聲處理3次。

濃縮后用足量乙酸乙酯萃取完全，硫酸鈉脫水后再次濃縮，用甲醇溶解并定容至10ml，采用folin-ciocalteu法進行多酚提取得率測定。以多酚提取得率為指標，考察溶液ph溶液對萃取效果的影響，實驗結(jié)果見圖9。

由圖9可知，當溶液ph值逐漸增加時，多酚物質(zhì)提取得率逐漸增加，這主要是因為ph值能夠酚類物質(zhì)的極性，ph值越高，多酚極性越低，從強極性水溶液中越容易被弱極性乙醇溶液提取出來。當溶液ph值達到4.5時，多酚提取得率達到最大(223.08mg/100g)。當溶液ph值大于4.5時，多酚提取得率略有下降。因此選擇ph值為4.5進行下一步試驗。

3.4.4最佳提取條件的確定

3.4.4.1設(shè)計方案及實驗結(jié)果

表4box-benhnken實驗設(shè)計因素水平編碼表

表5box-benhnken實驗設(shè)計方案與結(jié)果

在前期單因素實驗的基礎(chǔ)上，以超聲波作用時間、乙醇濃度和溶液ph值為自變量，多酚提取得率為評價指標，采用box-benhnken中心組合設(shè)計原理設(shè)計三因素三水平共15個實驗點的響應(yīng)面分析實驗，其中12個為析因?qū)嶒灒詈笕齻€為中心實驗。因素水平分見表4，實驗方案與結(jié)果見表5。

3.4.4.2回歸方程結(jié)果與分析

采用sas8.01軟件對box-benhnken實驗結(jié)果(表5)進行二次多項回歸分析和響應(yīng)面分析，并建立二次響應(yīng)面回歸方程。

表6方差分析表

注：*p<0.05顯著差異；**p值<0.01極顯著差異。

表7回歸方程二次回歸方程參數(shù)

注：*p<0.05顯著差異；**p值<0.01極顯著差異。

從相應(yīng)面方程模型的方差分析(表6)可知，回歸方程的一次項、二次項和總和的f值均極顯著(p值<0.01)，失擬項對應(yīng)的p值為0.0446<0.05，凈sas計算得到方程的總決定系數(shù)r2＝0.9541，表明此模型擬合度良好，能較好的超聲波提取條件對提取得率影響的規(guī)律。

由各項決定系數(shù)數(shù)據(jù)(表6)可知，一次項的決定系數(shù)(0.4477)和二次項的決定系數(shù)(33.8925)均大于交互項決定系數(shù)(0.0364)，說明響應(yīng)面分析所選用的這三個因素的交互效應(yīng)較小。

由表7可知，sas擬合得到的二次多項回歸方程為：提取得率＝222.84+33.8925×?xí)r間+1.2325×濃度-8.5525×ph-31.8225×?xí)r間×?xí)r間-1.915×?xí)r間×濃度-36.9525×?xí)r間×ph-2.025×濃度×濃度+13.82×濃度×ph-28.6925×ph×ph。

根據(jù)表7中超聲波處理時間、乙醇濃度和ph值對應(yīng)的參數(shù)估計(依次分別為222.84、1.2325和-8.5525)可知，三因素對多酚提取得率影響到次序超聲波處理時間>ph值>乙醇濃度，且超聲波處理時間、乙醇濃度對提取得率為正效應(yīng)影響，而ph值是負效應(yīng)影響。

3.4.4.3響應(yīng)面分析及提取工藝優(yōu)化

為了考察超聲波作用時間、乙醇濃度和ph值這三個因素的協(xié)同作用對脫脂米糠中多酚物質(zhì)提取得率的影響，對所得二次回歸方程進行降維分析。即固定其中一個變量在“0”水平，用sas軟件，根據(jù)回歸方程作響應(yīng)面圖。

(1)超聲作用時間與乙醇濃度協(xié)同作用分析

固定ph值為4.5，采用sasadx程序繪制超聲作用時間與乙醇濃度對提取得率影響的響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖10、11。

由等高線圖(圖10)可以看出多酚提取得率等高線以弧形分布，而不是線形分布，這說明超聲波作用時間和乙醇濃度之間有一定的相互作用。由三維立體圖(圖11)可知，圖形上凸，證明超聲波作用時間和乙醇濃度對多酚提取得率具有較高的協(xié)同作用，即乙醇濃度的增加有利于超聲波處理效果。另外由圖11立面可知，隨著乙醇濃度的增大，提取得率先增加后降低，超聲波作用時間對提取得率的影響趨勢同于乙醇濃度。

(2)超聲時間與ph值協(xié)同作用分析

固定乙醇濃度為80％，采用sasadx程序繪制超聲作用時間與ph值對提取得率影響的響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖12、13。

由等高線圖(圖12)可以看出多酚提取得率等高線以弧形分布，而不是線形分布，這說明超聲波作用時間和乙醇濃度之間有一定的相互作用。由三維立體圖(圖13)可知，圖形上凸，證明超聲波作用時間和ph值對多酚提取得率具有較高的協(xié)同作用，即ph值的增加有利于超聲波處理效果。另外由圖13立面可知，隨著乙醇濃度的增大，提取得率先增加后降低，ph值時間對提取得率的影響趨勢同于乙醇濃度。

(3)乙醇濃度與ph值協(xié)同作用分析

固定超聲波處理時間為10min，采用sasadx程序繪制超聲作用時間與料液比對提取得率影響的響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖14、15。

由等高線圖(圖14)可以看出多酚提取得率等高線以弧形分布，而不是線形分布，這說明ph值和乙醇濃度之間有一定的相互作用。由三維立體圖(圖15)可知，圖形上凸，證明ph值和乙醇濃度對多酚提取得率具有較高的協(xié)同作用，即ph值的增加有利于乙醇提取效果。另外由圖15立面可知，隨著乙醇濃度的增大，提取得率先增加后降低，ph值時間對提取得率的影響趨勢同于乙醇濃度。

(4)最佳提取條件的確定

由sas軟件擬合二次回歸模型得出最優(yōu)條件和最優(yōu)值，見表8。

表8提取條件、最優(yōu)結(jié)果及驗證試驗結(jié)果

分析方程模擬最優(yōu)值(表8)可知，當提取得率最大時，x1、x2、x3的最優(yōu)編碼值為0.548632、-0.03026、-0.127493，經(jīng)編碼換算后預(yù)計最佳提取條件為：超聲波作用時間11.72min、乙醇濃度71.56％、ph為4.56，預(yù)計最大提取得率為232.705mg/100g。

為驗證方程與實際情況的吻合程度，進行最佳提取條件驗證實驗，驗證實驗結(jié)果230.64mg/100g，與模擬結(jié)果基本符合。因此確定最佳提取條件為超聲波作用時間11.72min、乙醇濃度71.56％、ph為4.56，此條件下預(yù)計最大提取得率為232.705mg/100g。

4小結(jié)

以粉碎后的脫脂米糠為原料，采用堿水解的方法使得結(jié)合酚類物質(zhì)分解為游離多酚，然后以乙醇水溶液為提取劑，采用超聲波輔助的方法對脫脂米糠中多酚物質(zhì)進行提取。以多酚提取得率為評價指標，重點考察了顆粒度、料液比、naoh溶液和水解時間對堿水解效果的影響和超聲波處理時間、乙醇濃度和溶液ph溶液和水解時間對提取效果的影響。通過單因素試驗、正交試驗和box-benhnken響應(yīng)面分析法得到堿水解的最佳條件為：粉碎粒度60目、料液比1：8、naoh濃度2.5mol/l、水解時間2.0h；超聲波提取最佳工藝條件為：超聲波作用時間11.72min、乙醇濃度71.56％、ph為4.56。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和變形，這些改進和變形也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。