本發(fā)明涉及醫(yī)療器械領(lǐng)域，具體涉及一種人工皮膚及其制備方法。
背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，可保護(hù)身體免受外界有害物質(zhì)的侵入，防止體內(nèi)水分、電解質(zhì)等丟失，維持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，并參與人體的免疫和代謝過(guò)程。全球每年皮膚缺損患者超過(guò)1億人次，我國(guó)皮膚缺損患者達(dá)1500萬(wàn)人/年。皮膚受到損傷后，主要依靠血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的遷移、增殖、上皮組織和結(jié)蹄組織的形成完成自我修復(fù)。由于燒燙傷、皮膚潰瘍等事故或疾病引起皮膚大面積或嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，皮膚無(wú)法自我修復(fù)，需通過(guò)皮片移植手術(shù)完成修復(fù)。治療皮膚缺損的關(guān)鍵是促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，防止內(nèi)環(huán)境的紊亂及微生物感染造成并發(fā)癥的危險(xiǎn)。
目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化的人工皮膚產(chǎn)品以及處于研發(fā)階段的人工皮膚產(chǎn)品有很多。產(chǎn)品多為異體或異種天然真皮（脫細(xì)胞處理）、人工真皮或組織工程活性真皮。異體或異種天然真皮存在成本高，免疫排斥及病毒感染等問(wèn)題。組織工程活性真皮存在制備成本高，周期相對(duì)較長(zhǎng)及細(xì)胞來(lái)源等問(wèn)題。而人工真皮易于保存運(yùn)輸，技術(shù)可靠，可成批生產(chǎn)，且生產(chǎn)、安全及質(zhì)量控制趨于成熟，占據(jù)市場(chǎng)發(fā)展的主流。能否促進(jìn)傷口快速愈合，防止創(chuàng)面感染，將影響人工真皮修復(fù)的成功率。但是目前現(xiàn)有的人工皮膚尚不能很好地防止創(chuàng)面感染、促進(jìn)傷口愈合，所以需要提供一種新的人工皮膚。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有生物活性和抗菌功能的人工皮膚及其制備方法。
本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
一種人工皮膚，包括相互粘合的上下兩層膜，上層膜為表面修飾有納米銀的硅橡膠膜，下層膜為膠原復(fù)合物膜，所述膠原復(fù)合物包括膠原、粘多糖和負(fù)載VEGF的脂質(zhì)體。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述上層膜和所述下層膜采用硅凝膠粘合在一起。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述粘多糖為硫酸軟骨素或透明質(zhì)酸。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述下層膜具有三維多孔結(jié)構(gòu)。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述下層膜的厚度為1-3 mm。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述上層膜的厚度為0.2-0.3 mm。
本發(fā)明還提供了一種如上所述的人工皮膚的制備方法，包括以下步驟：
制備硅橡膠膜；
硅橡膠膜表面修飾納米銀：在所述硅橡膠膜上沉積一層聚丙烯酸薄膜，將其浸泡在硝酸銀溶液中，再取出浸泡在還原劑溶液中，洗滌，得到表面修飾有納米銀的硅橡膠膜；
制備負(fù)載有VEGF的脂質(zhì)體：制備脂質(zhì)體膜，將其放入水溶液中，溶脹，水合，加入VEGF和凍干保護(hù)劑，攪拌，粉碎，得到負(fù)載有VEGF的脂質(zhì)體；
制備膠原復(fù)合物膜：取粘多糖溶液加入膠原溶液中，攪拌，加入負(fù)載有VEGF的脂質(zhì)體，攪拌，得到膠原復(fù)合液，將膠原復(fù)合液倒入模具中，預(yù)凍，冷凍干燥，得到膠原復(fù)合物膜；
采用硅凝膠將所述表面修飾有納米銀的硅橡膠膜和所述膠原復(fù)合物膜粘合，得到雙層結(jié)構(gòu)；
將所述雙層結(jié)構(gòu)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，清洗，得到人工皮膚。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)體膜是通過(guò)下列步驟制備得到：取卵磷脂和膽固醇溶于有機(jī)溶劑中，恒溫水浴中蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，抽干，得到脂質(zhì)體膜。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述交聯(lián)反應(yīng)是將雙層結(jié)構(gòu)浸泡在戊二醇-醋酸溶液中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述硝酸銀溶液的濃度為8-11 mmol/L。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述還原劑溶液為濃度為0.8-1.1 mmol/L的NaBH4溶液。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述VEGF的加入量為5-10 ng/mg脂質(zhì)體。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述凍干保護(hù)劑為蔗糖。所述蔗糖的加入量為3-4.5 g/g脂質(zhì)體。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述預(yù)凍是在-50~-70℃下冷凍1.5~3 h。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述戊二醇-醋酸溶液中戊二醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-0.3%，醋酸的濃度為0.03-0.05 mol/L。
本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明提供了一種人工真皮及其制備方法，人工真皮包括相互粘合的上下兩層膜，上層膜為表面修飾有納米銀的硅橡膠膜，下層膜為膠原復(fù)合物膜，所述膠原復(fù)合物包括膠原、粘多糖和負(fù)載VEGF的脂質(zhì)體；上層膜通過(guò)等離子聚合+化學(xué)還原法在硅橡膠膜上修飾納米銀，使得上層膜具有抗菌抗感染的功能，而且納米銀顆粒不易從上層膜脫落，銀直接與細(xì)胞接觸具有毒性，上層膜和下層膜之間的粘合層可以作為障礙層，可防止銀釋放過(guò)多，還可防止銀直接與細(xì)胞接觸；下層膜引入了活性印子VEGF，具有促進(jìn)血管生成和創(chuàng)面愈合的功能，制備得到的人工皮膚具有良好的生物相容性和降解性，而且兼具生物活性和抗菌性能。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：
制備硅橡膠膜：將硅橡膠的A、B組分按1:1的比例混合在一起，300 rpm下攪拌10 min，脫泡。倒入聚四氟乙烯模具中，流平，置于真空干燥箱中，150℃固化2 h，得到硅橡膠薄膜。
硅橡膠膜表面修飾納米銀：將所得硅橡膠膜表面采用等離子聚合技術(shù)沉積一層厚度約10 nm的聚丙烯酸薄膜。然后將其浸泡在濃度為8 mmol/L的AgNO3溶液中1h，使Ag+與聚丙烯酸分子鏈上的羧基結(jié)合。然后浸泡在0.8 mmol/L的NaBH4溶液中1 h，不斷攪拌，使Ag+還原成納米Ag粒子。再用純化水清洗6次，得到表面修飾納米銀的硅橡膠膜。
負(fù)載VEGF的脂質(zhì)體制備：稱(chēng)取0.2 g卵磷脂、0.1 g膽固醇溶于12 mL氯仿中，轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，30℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，并抽干。加入10 mL磷酸鹽緩沖液，使瓶?jī)?nèi)壁的脂質(zhì)體膜轉(zhuǎn)移入水相，放置2 h，使其充分溶脹、水合，在超聲波清洗機(jī)中超聲3 min后，按5 ng/mg脂質(zhì)體的投加量加入濃度為5 ng/mL的VEGF溶液，及0.6 mL濃度為1.5 g/mL的蔗糖溶液，攪拌5 min。然后采用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲處理，得到粒徑為300-500 nm負(fù)載VEGF的脂質(zhì)體。
制備膠原復(fù)合物膜：稱(chēng)取膠原和硫酸軟骨素分別溶于0.03mol/L的醋酸溶液中。將膠原溶液、硫酸軟骨素溶液及負(fù)載VEGF的脂質(zhì)體混合在一起，使膠原濃度為0.4%，硫酸軟骨素濃度為0.05%，脂質(zhì)體濃度為0.004%，攪拌均勻，得到膠原復(fù)合液。將膠原復(fù)合液倒入聚四氟乙烯模具中，-50℃下預(yù)凍1.5 h，冷凍干燥24 h，得到膠原復(fù)合海綿支架；
上層和下層粘合：在硅橡膠膜表面涂覆一層硅凝膠，將膠原海綿復(fù)合物膜粘結(jié)在硅橡膠膜表面，得到雙層結(jié)構(gòu)。
交聯(lián)處理：將所得雙層人工皮膚浸泡在戊二醛-醋酸溶液中，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，所述戊二醛-醋酸溶液中戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為0.1%，醋酸的濃度為0.03 moL/L。浸泡48 h后取出，用純化水清洗7次，再用磷酸鹽緩沖液清洗2次，保存在磷酸鹽緩沖液中，即得雙層人工皮膚。
實(shí)施例2：
制備硅橡膠膜：將硅橡膠的A、B組分按1:1的比例混合在一起，300 rpm下攪拌10 min，脫泡。倒入聚四氟乙烯模具中，流平，置于真空干燥箱中，150℃固化2 h，得到硅橡膠薄膜。
硅橡膠膜表面修飾納米銀：將所得硅橡膠膜表面采用等離子聚合技術(shù)沉積一層厚度約10 nm的聚丙烯酸薄膜。然后將其浸泡在濃度為10 mmol/L的AgNO3溶液中1 h，使Ag+與聚丙烯酸分子鏈上的羧基結(jié)合。然后浸泡在1 mmol/L的NaBH4溶液中1 h，不斷攪拌，使Ag+還原成納米Ag粒子。再用純化水清洗6次，得到表面修飾納米銀的硅橡膠膜。
負(fù)載VEGF的脂質(zhì)體制備：稱(chēng)取0.2 g卵磷脂、0.1g膽固醇溶于12 mL氯仿中，轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，30℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，并抽干。加入10 mL磷酸鹽緩沖液，使瓶?jī)?nèi)壁的脂質(zhì)膜轉(zhuǎn)移入水相，放置2.5 h，使其充分溶脹、水合，在超聲波清洗機(jī)中超聲5 min后，按8 ng/mg脂質(zhì)體的投加量加入濃度為5 ng/mL的VEGF溶液，及0.8 mL濃度為1.5 g/mL的蔗糖溶液，攪拌5 min。然后采用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲處理，得到粒徑為300-500 nm負(fù)載VEGF的脂質(zhì)體。
制備膠原復(fù)合物膜：稱(chēng)取膠原和硫酸軟骨素分別溶于0.05 moL/L的醋酸溶液中。將膠原溶液、硫酸軟骨素溶液及負(fù)載VEGF的脂質(zhì)體混合在一起，使膠原濃度為0.6%，硫酸軟骨素濃度為0.075%，脂質(zhì)體濃度為0.006%，攪拌均勻，得到膠原復(fù)合液。將膠原復(fù)合液倒入聚四氟乙烯模具中，-60℃下預(yù)凍2 h，冷凍干燥24 h，得到膠原復(fù)合海綿支架；
上層和下層粘合：在硅橡膠膜表面涂覆一層硅凝膠，將膠原海綿復(fù)合物膜粘結(jié)在硅橡膠膜表面，得到雙層結(jié)構(gòu)。
交聯(lián)處理：將所得雙層人工皮膚浸泡在戊二醛-醋酸溶液中，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，所述戊二醛-醋酸溶液中戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為0.25%，醋酸的濃度為0.03 moL/L。浸泡48 h后取出，用純化水清洗7次，再用磷酸鹽緩沖液清洗2次，保存在磷酸鹽緩沖液中，即得雙層人工皮膚。實(shí)施例3：
制備硅橡膠膜：將硅橡膠的A、B組分按1:1的比例混合在一起，300 rpm下攪拌10 min，脫泡。倒入聚四氟乙烯模具中，流平，置于真空干燥箱中，150℃固化2 h，得到硅橡膠薄膜。
硅橡膠膜表面修飾納米銀：將所得硅橡膠膜表面采用等離子聚合技術(shù)沉積一層厚度約10 nm的聚丙烯酸薄膜。然后將其浸泡在濃度為11 mmol/L的AgNO3溶液中1 h，使Ag+與聚丙烯酸分子鏈上的羧基結(jié)合。然后浸泡在1.1 mmol/L的NaBH4溶液中1 h，不斷攪拌，使Ag+還原成納米Ag粒子。再用純化水清洗6次，得到表面修飾納米銀的硅橡膠膜。
負(fù)載VEGF的脂質(zhì)體制備：稱(chēng)取0.2 g卵磷脂、0.1g膽固醇溶于12 mL氯仿中，轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，30℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，并抽干。加入10 mL磷酸鹽緩沖液，使瓶?jī)?nèi)壁的脂質(zhì)膜轉(zhuǎn)移入水相，放置3 h，使其充分溶脹、水合，在超聲波清洗機(jī)中超聲5 min后，按10 ng/mg脂質(zhì)體的投加量加入濃度為5 ng/mL的VEGF溶液，及0.9 mL濃度為1.5 g/mL的蔗糖溶液，攪拌10 min。然后采用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲處理，得到粒徑為300-500 nm負(fù)載VEGF的脂質(zhì)體。
制備膠原復(fù)合物膜：稱(chēng)取膠原和透明質(zhì)酸分別溶于0.05 mol/L的醋酸溶液中。將膠原溶液、硫酸軟骨素溶液及負(fù)載VEGF的脂質(zhì)體混合在一起，使膠原濃度為1%，硫酸軟骨素濃度為0.15%，脂質(zhì)體濃度為0.01%，攪拌均勻，得到膠原復(fù)合液。將膠原復(fù)合液倒入聚四氟乙烯模具中，-60℃下預(yù)凍3 h，冷凍干燥24 h，得到膠原復(fù)合海綿支架；
上層和下層粘合：在硅橡膠膜表面涂覆一層硅凝膠，將膠原海綿復(fù)合物膜粘結(jié)在硅橡膠膜表面，得到雙層結(jié)構(gòu)。
交聯(lián)處理：將所得雙層人工皮膚浸泡在戊二醛-醋酸溶液中，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，所述戊二醛-醋酸溶液中戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為0.3%，醋酸的濃度為0.05 moL/L。浸泡48 h后取出，用純化水清洗7次，再用磷酸鹽緩沖液清洗2次，保存在磷酸鹽緩沖液中，即得雙層人工皮膚。