本發(fā)明屬于生物復(fù)合材料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于修復(fù)骨損傷的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的制備方法。

背景技術(shù)：

我國是一個擁有13億以上人口的大國，每年由于交通、體育運動事故造成的骨損傷患者每年達到百萬人以上，且隨著人口老齡化引起的骨質(zhì)疏松、骨組織壞死等疾病日益增多。盡管骨組織具有一定的自我修復(fù)能力，但自我修復(fù)只能在缺損較小的情況下進行，目前的主要治療方法是通過在病變區(qū)植入骨修復(fù)材料，促進骨組織的再生和修復(fù)。因此，骨修復(fù)材料是目前需求量最大的生物醫(yī)用材料之一。

根據(jù)來源不同，骨修復(fù)材料主要包括自體骨、同種異體骨和異種骨、人工合成骨材料等。自體骨是最為最理想的骨修復(fù)材料，但是因其取材有限且會對患者造成二次損傷而大大影響了其應(yīng)用；同種異體骨和異種骨容易引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，而且有傳播疾病的風(fēng)險；因此，研究和開發(fā)能夠修復(fù)骨損傷并重建其功能的人工骨材料受到了廣泛重視，也取得了顯著的進展，但與理想的人工骨材料相比仍存在一些不足。比如：人工骨材料的力學(xué)性能與原骨組織不匹配，可能會導(dǎo)致植入材料與植入環(huán)境以及新生骨不能很好地結(jié)合；在材料的孔隙率、孔隙聯(lián)通、孔徑大小調(diào)控方面仍然存在困難，影響成骨細胞的生長增殖以及骨組織的形成等。

機械性能、孔特性以及生物功能性是人工骨材料設(shè)計時需要重點考慮的三個方面。我們知道天然骨材料主要由膠原纖維羥基磷灰石組成，但通過人工仿生 制備很難獲得如此復(fù)雜而精致的結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的機械性能，因此在有機生物分子和羥基磷灰石之外復(fù)合其它組分成為強化人工骨材料的重要手段。理想的骨修復(fù)材料應(yīng)具有多級孔結(jié)構(gòu)和較高的孔隙率，研究表明，材料的多級孔結(jié)構(gòu)有利于控制細胞行為，大孔結(jié)構(gòu)則有利于成骨細胞的分化、神經(jīng)化和血管化，另外多級微孔結(jié)構(gòu)則有利于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的輸送(Moutos F T等，《自然材料》2007,6,162-167)。因此在保持其機械強度和生物活性的前提下改善材料孔隙率、孔徑、孔形貌、孔分布成為改善其骨修復(fù)功能的重要途徑之一。目前主要制備方法包括顆粒堆積燒結(jié)法、添加造孔劑法、發(fā)泡法、溶膠-凝膠法、相分離法、3D打印法和電化學(xué)法等。但是這些方法或者需要有機溶劑的加入，或者需要高溫高壓等苛刻的條件，并且所制備的多孔材料孔結(jié)構(gòu)分布不均勻，孔尺寸控制也比較困難，使得所制備材料在臨床應(yīng)用上受到較大的限制。近些年來，冰凝誘導(dǎo)法逐漸被人們所認識(Yanina Minaberry等，《化學(xué)材料》2011,23，2327-2332)，該方法無毒無害，且對于孔特性的調(diào)控具有獨特的優(yōu)勢，在骨修復(fù)領(lǐng)域具有顯著的應(yīng)用價值。將仿生礦化與冰凝誘導(dǎo)相結(jié)合，在提高其機械強度和保持生物活性的基礎(chǔ)上，大大提高了對材料孔結(jié)構(gòu)的控制性，通過組成和工藝的變化可以很容易地調(diào)控材料的機械性能和降解特性，作為支架材料在骨修復(fù)領(lǐng)域展示了良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的制備方法，可用作骨修復(fù)三維支架材料使用，具有良好的生物活性、機械性能、降解特性和易于調(diào)控的多級孔結(jié)構(gòu)，有利于提高骨修復(fù)的效果。

本發(fā)明提供了一種短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的制備方法，包括以下步驟：

將短肽分子溶于水中，超聲分散，調(diào)節(jié)至指定pH值，在一定溫度下放置使其組裝，得到含有短肽自組裝體的溶液，即短肽溶液；

將短肽溶液、硅前驅(qū)體、粘合劑混合，使硅前驅(qū)體水解并在短肽組裝體表面形成二氧化硅沉積層，繼續(xù)反應(yīng)形成短肽/二氧化硅凝膠；

將短肽/二氧化硅凝膠用超純水置換，然后利用冰凝誘導(dǎo)法，在不同的冷凍域中冷凍樣品，冷凍干燥后即可得到短肽/二氧化硅多孔材料；

利用模擬體液浸泡材料，在短肽/二氧化硅多孔材料表面沉積羥基磷灰石層，一定時間后冷凍干燥得到短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料；

可選的，短肽為兩親性陽離子短肽，疏水部分由3-10個甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸組成，親水部分由1-3個賴氨酸、精氨酸或組氨酸構(gòu)成，疏水部分和親水部分通過肽鍵連接；

優(yōu)選的，將短肽溶解于水后，調(diào)節(jié)至pH 3-9，使其在溫度15-50℃的水溶液中放置，最終能夠自組裝成納米纖維；

可選的，硅前驅(qū)體為正硅酸乙酯或正硅酸甲酯，粘合劑為聚乙烯醇、殼聚糖、海藻酸鈉中的一種，濃度分別為短肽1-10mM、硅前驅(qū)體50-500mM、粘合劑1-3wt％；

優(yōu)選的，將形成的凝膠置于大量超純水中進行置換，每4-12小時換一次水，目的是為了除去在二氧化硅形成過程中生成的少量乙醇或甲醇；

可選的，所述的冰凝誘導(dǎo)法是以凝膠在冷凍過程中形成的冰晶為模板驅(qū)動溶質(zhì)組裝，然后除去冰晶得到多孔材料的方法；

優(yōu)選的，冰凝誘導(dǎo)的溫度在-196-0℃之間，樣品首先在冷凍源中冷凍10-60分鐘，然后在-80℃冰箱中熟化10-30分鐘；

優(yōu)選的，將短肽/二氧化硅多孔材料在37℃的SBF模擬體液中浸泡3-6天， 每12-48小時更換一次模擬體液；

本發(fā)明的另一方面提供了如上述技術(shù)方案中任一項所述的一種短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的制備方法所制備得到的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料；

本發(fā)明的再一方面提供了如上述技術(shù)方案所述的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料作為三維支架材料在骨修復(fù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明將仿生礦化方法與冰凝誘導(dǎo)技術(shù)相結(jié)合，制備出短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料具有良好生物活性，且強度可控、孔特性可控的多級孔材料。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：1)得到的是具有納米孔、微米孔等多級孔結(jié)構(gòu)的多孔材料；2)多孔材料中孔的尺寸、孔的方向、孔的連通性易于調(diào)控，例如孔的尺寸能從幾百納米到幾百微米變化；3)多孔材料的形狀由冰凝誘導(dǎo)的模具決定，易于得到具有不同形狀的多孔材料，從而滿足不同部位的特殊需求；4)具有可調(diào)控的機械性能和降解特性，易于通過二氧化硅和羥基磷灰石組成和分布的變化調(diào)控其機械性能和降解性質(zhì)；5)良好的生物活性，所制備多孔材料由無毒的短肽、二氧化硅、羥基磷灰石組成，表面羥基磷灰石和硅羥基的存在以及材料所具有的多級孔結(jié)構(gòu)賦予其良好的生物活性，有助于骨細胞的粘附增殖，促進受損骨組織的修復(fù)；6)簡單、環(huán)境友好的制備工藝，冰凝誘導(dǎo)是以水作為溶劑，以冰晶作為模板制備多孔材料，未引入其它雜質(zhì)，并且除冰晶模板也比較方便；整個過程不需要復(fù)雜的設(shè)備，成本較低且容易實現(xiàn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例2所制備得到的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料2的數(shù)碼照片；

圖2A為本發(fā)明實施例2所制備得到的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合 材料2垂直于冰晶生長方向截面的掃描電子顯微鏡照片；

圖2B為本發(fā)明實施例2所制備得到的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料2平行于冰晶生長方向截面的掃描電子顯微鏡照片；

圖2C為本發(fā)明實施例2所制備得到的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料2孔壁的掃描電子顯微鏡照片；

圖3為本發(fā)明實施例2所制備得到的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料2的壓汞孔分布測試曲線；

圖4為本發(fā)明實施例2所制備得到的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料2的EDS能譜；

圖5為本發(fā)明實施例2所制備得到的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料2的細胞毒性圖。

具體實施方式

下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，以下實例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明。應(yīng)當指出的是，所描述的僅僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明實施例提供了一種短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的制備方法，包括：

S1：將短肽分子溶于水中，超聲分散，調(diào)節(jié)至指定pH值，在一定溫度下放置使其組裝，得到含有短肽自組裝體的溶液，即短肽溶液。

本步驟中，利用兩親性短肽分子間的非共價相互作用構(gòu)建具有礦化活性的短肽自組裝體。具體的，將稱量的短肽粉末溶解于超純水中，超聲助其分散， 調(diào)節(jié)到指定pH值后靜置使其組裝，在下一步使用前要保證其充分組裝，可以利用利用原子力顯微鏡或透射電子顯微鏡觀察其組裝情況。通過本步驟，可以得到陽離子分布在表面的短肽自組裝體。

S2：將短肽溶液、硅前驅(qū)體、粘合劑混合，使硅前驅(qū)體水解并在短肽組裝體表面形成二氧化硅沉積層，繼續(xù)反應(yīng)形成短肽/二氧化硅凝膠。

本步驟中，利用陽離子短肽自組裝體作為模板并誘導(dǎo)二氧化硅在其表面沉積，并成為凝膠的三維骨架。具體的，首先把聚乙烯醇溶解到組裝好的短肽溶液中并混合均勻，然后按照比例與硅前驅(qū)體混合，攪拌均勻后放置于恒溫箱中放置成膠。

S3：將短肽/二氧化硅凝膠用超純水置換，然后利用冰凝誘導(dǎo)法，在不同的冷凍域中冷凍樣品，冷凍干燥后即可得到短肽/二氧化硅多孔材料。

本步驟中，為克服乙醇(甲醇)的存在對冰凝誘導(dǎo)過程以及對多孔材料生物活性的影響，需要采用純水置換的手段除去。具體的，待混合溶液成膠后，直接在容器中加入大量的超純水置換，待乙醇基本除盡后再進行冰凝誘導(dǎo)處理。

S4：利用模擬體液浸泡材料，在短肽/二氧化硅多孔材料表面沉積羥基磷灰石層，一定時間后冷凍干燥得到短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料

本步驟中，復(fù)合羥基磷灰石層的目的有兩個：一是為了增加該多孔材料的生物活性以及骨細胞的生長增殖活性；二是通過二氧化硅層和羥基磷灰石層的比例以及分布調(diào)節(jié)其降解性質(zhì)。二氧化硅層的存在一方面可以提高復(fù)合材料的機械強度，另一方面硅羥基的存在也為羥基磷灰石的形成提供了成核位點，有助于促進其沉積。具體的，將短肽/二氧化硅多孔材料直接浸泡在配置好的模擬體液中，放置于恒溫水浴鍋中反應(yīng)一定時間，取出凍干即可。

在本發(fā)明的一實施例中，所述的短肽為兩親性陽離子短肽，疏水部分由3-10 個甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸組成，親水部分由1-3個賴氨酸、精氨酸或組氨酸構(gòu)成，疏水部分和親水部分通過肽鍵連接。兩親性陽離子短肽通過分子間非共價作用在水溶液中形成組裝體，親水的賴氨酸、精氨酸或組氨酸在非堿性溶液中容易質(zhì)子化而使組裝體表面帶有正電荷，通過親疏水單元組成的變化可以調(diào)控其組裝體形態(tài)和帶電性質(zhì)，以及作為模板誘導(dǎo)二氧化硅形成的能力。

在本發(fā)明的一實施例中，將短肽溶解于水后，調(diào)節(jié)至pH 3-9，使其在溫度15-50℃的水溶液中放置，最終能夠自組裝成納米纖維。短肽的組裝依賴于分子間的弱相互作用，包括氫鍵、靜電、疏水相互作用等，因此環(huán)境對于組裝結(jié)果具有一定影響。例如溶液pH值決定了短肽分子的質(zhì)子化程度，因此對分子間靜電作用和氫鍵有重要影響，而溫度主要影響的是氫鍵作用，在短肽的組裝體系中，氫鍵是驅(qū)動短肽分子形成一維組裝體的關(guān)鍵因素，因此在這里要加以控制。可以理解的是可將pH值調(diào)節(jié)到3、4、5、6、7、8、9不等或上述范圍內(nèi)的其它任何一點均可，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實際情況調(diào)節(jié)。

在本發(fā)明的一實施例中，所采用的硅前驅(qū)體為正硅酸乙酯或正硅酸甲酯，粘合劑為聚乙烯醇、殼聚糖、海藻酸鈉中的一種，濃度分別為短肽1-10mM、硅前驅(qū)體50-500mM、粘合劑1-3wt％。在本實施例中由于不同的二氧化硅前驅(qū)體具有不同的水解速率，因此通過一種或者多種前驅(qū)體間的調(diào)節(jié)，可以控制礦化反應(yīng)速率以及短肽組裝體表面二氧化硅層的厚度。所采用的粘合劑為聚乙烯醇、殼聚糖、海藻酸鈉中的一種，目的是為了調(diào)控材料的機械強度?？梢岳斫獾氖?，在上述范圍內(nèi)所配制的溶液均可制備凝膠，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要在上述范圍內(nèi)進行調(diào)節(jié)，例如短肽濃度為1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM或之間的任一值，硅前驅(qū)體濃度為50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM或之間的任一值，粘合劑濃度為1wt％、2wt％、3wt％ 或之間的任一值。

在本發(fā)明的一實施例中，將形成的凝膠置于大量超純水中進行置換，每4-12小時換一次水，目的是為了除去在二氧化硅形成過程中生成的少量乙醇(甲醇)。乙醇對冰凝誘導(dǎo)過程以及最終材料的結(jié)構(gòu)和生物相容性均有一定的影響，因此要在冰凝誘導(dǎo)之前將其除去?？梢岳斫獾氖?，在上述換水頻率范圍內(nèi)均可以有效除去乙醇(甲醇)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要在上述范圍內(nèi)進行調(diào)節(jié)，例如4小時、8小時、12小時或其間的任一時間。

在本發(fā)明的一實施例中，所述的冰凝誘導(dǎo)法是以凝膠在冷凍過程中形成的冰晶為模板驅(qū)動溶質(zhì)組裝，然后除去冰晶得到多孔材料的方法。水溶液在低溫下結(jié)冰，結(jié)冰過程中會把溶質(zhì)排擠到冰晶間并進行重新排列，經(jīng)真空冷凍干燥除去冰晶后形成多孔材料。冰凝誘導(dǎo)方法簡單易于操作，不需要復(fù)雜的設(shè)備和苛刻的條件，而且過程中沒有引入任何雜質(zhì)，保證了材料的純凈，這對于制備生物醫(yī)用材料來說尤其重要。

在本發(fā)明的一實施例中，冰凝誘導(dǎo)的溫度在-196-0℃之間，樣品首先在冷凍源中冷凍10-60分鐘，然后在-80℃冰箱中熟化10-30分鐘。冰凝誘導(dǎo)的過程是冰晶驅(qū)動溶質(zhì)組裝的過程，因此冰晶形成以及生長的速率會影響孔的尺寸及孔表面形態(tài)，合適的冷凍溫度產(chǎn)生規(guī)則的孔結(jié)構(gòu)。我們通過冷凍溫度、溫度梯度的控制制備適宜的孔尺寸，通過冷凍方向控制孔的方向和連通性，熟化的目的是為了進一步鞏固所形成的孔結(jié)構(gòu)?？梢岳斫獾氖?，在上述冷凍溫度范圍內(nèi)，均可以制備得到短肽/二氧化硅多孔材料，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要在上述范圍內(nèi)進行調(diào)節(jié)。冷凍時間和熟化時間本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在上述范圍內(nèi)自行控制，只要能保證凝膠中的水全部形成冰晶即可。

在本發(fā)明的一實施例中，將短肽/二氧化硅多孔材料在37℃的SBF模擬體液 中浸泡3-6天，每12-48小時更換一次模擬體液。在本實施例中采用37℃下礦化羥基磷灰石是因為，在該條件下礦化更快速，且形成的羥基磷灰石層更均勻。根據(jù)所需的羥基磷灰石層厚度選擇不同的礦化時間，可以是3、4、5、6天或或之間的任意時間，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要選擇合適的時間。更換模擬體液的目的是為了讓環(huán)境中有足夠的鈣離子和磷酸根離子可供使用。

本發(fā)明的另一實施例提供了一種如上述實施例中任一項所述的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的制備方法所制備得到的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料。由本發(fā)明實施例制備得到的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料具有以下特點：1)具有納米孔、微米孔等多級孔結(jié)構(gòu)的多孔材料；2)多孔材料中孔的尺寸、孔的方向、孔的連通性易于調(diào)控，例如孔的尺寸能從幾百納米到幾百微米變化；3)多孔材料的形狀由冰凝誘導(dǎo)的模具決定，易于得到具有不同形狀的多孔材料，從而滿足不同部位的特殊需求；4)具有可調(diào)控的機械性能和降解特性，易于通過二氧化硅和羥基磷灰石組成和分布的變化調(diào)控其機械性能和降解性質(zhì)；5)良好的生物活性，所制備多孔材料由無毒的短肽、二氧化硅、羥基磷灰石組成，表面羥基磷灰石和硅羥基的存在以及材料所具有的多級孔結(jié)構(gòu)賦予其良好的生物活性，有助于骨細胞的粘附增殖，促進受損骨組織的修復(fù)；6)簡單、環(huán)境友好的制備工藝，冰凝誘導(dǎo)是以水作為溶劑，以冰晶作為模板制備多孔材料，未引入其他雜質(zhì)，并且除去冰晶模板也比較方便；整個過程不需要復(fù)雜的設(shè)備，成本較低且容易實現(xiàn)。

本發(fā)明的再一實施例提供了一種如上述實施例中任一項所述的一種短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料作為三維支架材料在骨修復(fù)中的應(yīng)用。由本發(fā)明實施例制備得到的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料具有良好的機械性能和生物學(xué)功能，可調(diào)控的孔結(jié)構(gòu)特性降解特性，可作為骨修復(fù)的三維支架 材料使用，有望提高缺損或病變骨部位的修復(fù)效果。

為了更清楚詳細地介紹本發(fā)明實施例所提供的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的制備方法，以下將結(jié)合具體實施例進行說明。

實施例1

首先配置4mM的兩親性短肽溶液，并放置于室溫待其自組裝；向1mL組裝好的兩親性短肽溶液中加入40μL正硅酸四乙酯和1wt％的聚乙烯醇，振蕩均勻后在25℃反應(yīng)3天得到短肽/二氧化硅凝膠；將所得的凝膠用超純水置換6次后，與-80℃冰箱進行冰凝誘導(dǎo)處理，凍干后于模擬體液中浸泡3天后得到短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料1。

實施例2

首先配置10mM的兩親性短肽溶液，并放置于室溫待其自組裝；向1mL組裝好的兩親性短肽溶液中加入200μL正硅酸四乙酯和2wt％的海藻酸鈉，振蕩均勻后在25℃反應(yīng)得到短肽/二氧化硅水凝膠；將所得的凝膠用超純水置換6次后，與-196℃液氮中進行冰凝誘導(dǎo)處理，凍干后于模擬體液中浸泡5天，得到短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料2。

實施例3

首先配置2mM的兩親性短肽溶液，并放置于室溫待其自組裝；向1mL組裝好的兩親性短肽溶液中加入正硅酸四乙酯和3wt％的殼聚糖，振蕩均勻后在25℃反應(yīng)得到短肽/二氧化硅水凝膠；將所得的凝膠用超純水置換8次后，與-20℃冰箱進行冰凝誘導(dǎo)處理，凍干后于模擬體液中浸泡6天，得到短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料3。

由上述實施例1-3所制備得到的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料在外觀、三維結(jié)構(gòu)、保水性能和細胞毒性方面比較相似，只是材料的孔徑和機械 強度不同。以下將以實施例2得到的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料2為例進行具體描述。

實施例4

短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的形態(tài)及結(jié)構(gòu)表征

通過普通的數(shù)碼相機獲得短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的外觀照片，如圖1所示，得到的材料材質(zhì)均勻，且具有較好的機械強度。

短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu)以及孔特性通過掃描電子顯微鏡獲得。所用儀器為：日立公司所生產(chǎn)的S-4800冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，采用加速電壓5kV。

本實施例結(jié)合冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu)。具體的，首先對短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料樣品內(nèi)進行預(yù)處理，干態(tài)放置于液氮中冷凍30min后進行脆斷，且分別沿著原冰晶生長的垂直方向和平行方向切斷，獲得垂直于冰晶生長方向和平行于冰晶生長方向的不同截面。然后把處理后的樣品分別粘到有導(dǎo)電雙面膠的樣品臺上，對樣品噴金1-2min增加導(dǎo)電性，然后放入樣品室，找到合適樣品區(qū)域并調(diào)到適當放大倍率進行掃描拍照。

由圖2A中可以看出，材料的橫截面由多個孔隙排列而成。材料孔隙在50um左右，孔徑比較均勻，反映了冰凝誘導(dǎo)法制備短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料孔徑較為均勻。

由圖2B中可以看出，材料的縱截面由多個半圓筒性的孔隙組成。其直徑在50um左右，反映了材料形成的是具有方向性的直通孔，且空隙的方向是沿著冰晶生長方向延伸的。

由圖2C中可以看出，三維大孔材料的孔壁是由一維的納米纖維結(jié)構(gòu)堆積而 成。一維納米纖維的直徑在15nm左右，表面較為粗糙。與單純的二氧化硅礦化相比，纖維的直徑增加且表面變得粗糙，表明有其它的顆粒在短肽/二氧化硅纖維表面沉積。這種無機材料包覆有機組裝體形成的一維結(jié)構(gòu)在機械性能提高的同時保留了有機組裝體的彈性，因此，由這些一維復(fù)合纖維形成的大孔材料具有良好的機械性能，而且纖維之間保留了足夠的納米級別的堆積空隙。

實施例5

短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的孔分布表征

本實施例中的孔分布測試采用AutoporeⅢ-9420型壓汞儀，分別測試1-6000psi下的進汞曲線和退汞曲線，然后通過計算得出材料的孔徑分布。首先在真空條件下給材料脫氣5h后進行壓汞測試，測試時由低壓到高壓依次漸變，記錄每次升壓時壓入的汞體積即可。

由圖3中可以看出，其在50.69μm處的孔徑分布量最大，其次還有在100μm、20μm、2μm等處均有少量的孔隙存在，反映了通過冰凝誘導(dǎo)法制備的多孔材料能夠形成以某一孔徑為主導(dǎo)的多級孔結(jié)構(gòu)。因此，通過冰凝誘導(dǎo)法不僅僅能獲得較大孔徑的直通孔，還能得到許多較小孔徑的其它孔，形成了這種多級孔分布的特性，更有利于骨細胞的生長以及營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的排出。

實施例6

短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的元素分布表征

短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料中的各主要元素分布通過掃描電子顯微鏡附帶的能譜儀獲得。所用儀器：日立公司所生產(chǎn)的S-4800冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡-能譜儀，采用20kV的工作電壓進行大范圍內(nèi)普通掃描。

本實施例結(jié)合場發(fā)射掃描電子顯微鏡-能譜儀測定短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料中Si，P，Ca，O四中元素的分布。具體的，首先把大孔材料研磨 成粉末狀，然后把處理后的樣品分別粘到有雙面膠的樣品臺上，放入樣品室，找到合適樣品區(qū)域并調(diào)到適當放大倍率進行能譜分析。

由圖4中可以看出，譜圖中硅和氧的含量最多，說明二氧化硅仍然是復(fù)合材料中的主要成分。但鈣和磷的元素峰也比較明顯，說明復(fù)合材料含有較多的鈣磷化合物。由于其鈣磷比為1.7，故推斷其為羥基磷灰石。以上分析表明，所制備材料為具有多級孔結(jié)構(gòu)的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石復(fù)合材料。

實施例7

短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料的細胞毒性表征

按照實施例2中的反應(yīng)物組成和工藝條件在96孔聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板中成膠，并通過冰凝誘導(dǎo)處理后，于超凈臺紫外燈下滅菌半小時后分別用無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)和達爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基置換數(shù)次，然后接種細胞并進行細胞毒性實驗。培養(yǎng)使用DMEM高糖培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中含有10％的胎牛血清)培養(yǎng)成骨細胞，在37℃、5％的二氧化碳氛圍下培養(yǎng)一天和三天后，加入少量噻唑藍(MTT)溶液(濃度為0.5mg/mL)，作用4h后吸棄培養(yǎng)基并加入一定量二甲基亞砜(DMSO)待甲臜完全溶解后于酶標儀中讀取490nm處的吸光度值。通過轉(zhuǎn)換即可得到細胞在材料中的生長情況。其結(jié)果如圖5所示，可以看出，短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料，其細胞存活率均在90％以上，符合醫(yī)學(xué)上的使用標準。

綜合以上實施例，通過仿生礦化和冰凝誘導(dǎo)法構(gòu)筑的短肽/二氧化硅/羥基磷灰石多孔復(fù)合材料，具有良好的孔結(jié)構(gòu)調(diào)控性能和機械性能、較低的毒性和良好的生物功能性，作為三維支架材料在骨修復(fù)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。