本發(fā)明屬于總皂苷提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種巖生忍冬總皂苷提取方法。
背景技術(shù)：
巖生忍冬(Lonicera rupicola Hook.f.et Thomson.)為忍冬科忍冬屬常綠藤木植物。主要分布于甘肅(臨潭)、寧夏南部、四川西部、云南西北部、西藏(林芝、錯(cuò)那)。生于高山灌叢草甸、流石灘邊緣、林緣河灘草地或山坡灌叢中，。味淡，微甘，性寒。清熱解毒，疏風(fēng)通絡(luò)。用于溫病發(fā)熱，熱毒血痢，癰腫瘡瘍，風(fēng)濕熱痹，關(guān)節(jié)紅腫熱痛。以其莖、葉、花入藥，具有清熱解毒、抗菌消炎、保肝利膽等功效。皂苷是一類由糖體和苷元縮合而成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物。傳統(tǒng)定義皂苷基于它們的表面活性，許多皂苷具有洗滌作用，其水溶液振搖能產(chǎn)生大量持久性肥皂樣泡沫。皂苷化合物通常分子量較大，極性也大?？傇碥諡榻Y(jié)構(gòu)極為相似的類似物，如糖的種類、苷元均相同，只是糖連接的位置和次序不同。近十年來從天然資源中發(fā)現(xiàn)的皂苷中約有310余種顯示出多種生物活性，如抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保肝活性等。
綜上所述，皂苷化合物通常分子量較大，極性也大，難以提取。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種巖生忍冬總皂苷提取方法，旨在解決皂苷化合物通常分子量較大，極性也大，難以提取的問題。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種巖生忍冬總皂苷提取方法，所述巖生忍冬總皂苷提取方法乙醇回流提取的最優(yōu)條件為：80％乙醇，料液比為1:14，70℃下回流105min。
進(jìn)一步，所述巖生忍冬總皂苷對維氏氣單胞菌CGMCC3700株抑菌活性最高，MIC值為0.48mg/mL；對其余腸沙門氏菌腸亞種CGMCC1.10754和大腸桿菌ATCC25922等13種標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC值分布在7.6875mg/mL-61.5mg/mL之間。
本發(fā)明提供的巖生忍冬總皂苷提取方法，由MIC試驗(yàn)結(jié)果可知巖生忍冬總皂苷對本次試驗(yàn)中的致病菌都具有一定程度的抑制能力。其中，對總皂苷最為敏感的菌株為維氏氣單胞菌CGMCC3700株，濃度為0.246g/mL的總皂苷浸膏溶液在稀釋倍數(shù)為512倍時(shí)，即濃度為0.48mg/mL的時(shí)候仍對其具有抑制生長的能力。除了維氏氣單胞菌CGMCC3700株，總皂苷對其余幾種菌株的MIC值都在稀釋倍數(shù)為4-32倍之間，即藥物濃度在7.6875mg/mL-61.5mg/mL之間。
試驗(yàn)得出最佳提取條件中提取時(shí)間為105min，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)并沒有涉及到時(shí)間低于105min時(shí)的提取率?？赡墚?dāng)溫度低于105min時(shí)存在更優(yōu)的條件。本試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)影響總皂苷提取率的實(shí)驗(yàn)因素時(shí)沒有設(shè)置回流次數(shù)這一因素?？s短單次回流時(shí)間，增加回流次數(shù)，可能進(jìn)一步增加提取率，還需要進(jìn)一步的研究。現(xiàn)在很多人選擇乙醇回流提取后樣品直接通過大孔樹脂純化與富集中藥成分。本試驗(yàn)考慮到藥液濃度可能比較高，先進(jìn)行萃取，除去了部分脂溶性物質(zhì)和其他一些雜質(zhì)，有助于提高大孔樹脂吸附率?，F(xiàn)在大部分試驗(yàn)選擇應(yīng)用于提取植物中皂苷成分的AB-8大孔樹脂。
隨著抗生素的應(yīng)用不斷增多，獸醫(yī)臨床中耐抗生素藥物的致病菌株不斷增加。傳統(tǒng)中獸醫(yī)中，忍冬歷來就被用于清熱解毒，民間更是有夏季直接將忍冬藤泡水飲用的習(xí)慣。從MIC試驗(yàn)中可看出巖生忍冬中的皂苷成分對14種標(biāo)準(zhǔn)菌株均具有一定的抑菌活性，對巖生忍冬在川西北畜禽疾病防控具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察乙醇濃度(％)、溫度(℃)、時(shí)間(min)、料液比(W/V)對巖生忍冬中總皂苷的提取的影響。以總皂苷的浸膏率為評判標(biāo)準(zhǔn)，得出乙醇回流的最優(yōu)條件為：80％乙醇，料液比(W/V)為1:14，70℃下回流105min。該條件下浸膏率可達(dá)9.84％。用微量稀釋法檢測總皂苷抑菌活性，結(jié)果表明巖生忍冬總皂苷提取物對14種病原菌均有一定程度的抑制作用。其中，對維氏氣單胞菌CGMCC3700株抑菌活性最高，MIC值為0.48mg/mL。對其余13種菌株的MIC值分布在7.6875-61.5mg/mL。
下面結(jié)合試驗(yàn)對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。
1試驗(yàn)材料
1.1試驗(yàn)藥材：
巖生忍冬，采自四川省阿壩州紅原縣，經(jīng)西南民族大學(xué)獸醫(yī)學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室陳朝喜副教授鑒定為忍冬屬巖生忍冬。取其莖葉，樣品經(jīng)自然風(fēng)干后粉碎備用。
1.2試驗(yàn)菌株：
供試菌株為14種標(biāo)準(zhǔn)菌株，由西南民族大學(xué)獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室保存并提供。
1.3儀器及試劑：
試驗(yàn)儀器：SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)、DLSB-10L/20低溫冷卻液循環(huán)泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-3000(上海亞榮生化儀器廠)、DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)、立式高壓蒸汽滅菌器、索式提取器、DZF-6030A真空干燥箱、電子分析天平、超凈工作臺(tái)、分液漏斗、移液槍(200L、1000L)。
試驗(yàn)試劑：MH肉湯培養(yǎng)基、石油醚、正丁醇(分析純)、乙醇(10％、20％、30％...90％)、濃硫酸(分析純)、甲醇(分析純)、去離子水。
2方法與步驟
2.1試驗(yàn)步驟：采藥乙醇回流浸提石油醚萃取正丁醇萃取大孔樹脂精制總皂苷微量肉湯稀釋法測定MIC。
2.2試驗(yàn)方法
2.2.1正交設(shè)計(jì)法
正交設(shè)計(jì)是利用一套規(guī)格化的表格來科學(xué)合理的安排多因素多水平試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法。依據(jù)正交性從全面試驗(yàn)中挑選出具有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，這些代表性的點(diǎn)具有“均勻分散，齊整可比”的特點(diǎn)。這樣可以節(jié)省人、財(cái)、物和時(shí)間，是一種高效、快速、便捷、經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)方法，也是現(xiàn)代提取中藥成分時(shí)常用的設(shè)計(jì)方法之一。本次試驗(yàn)為四因素三水平試驗(yàn)，故選用表L9(43)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。因素水平的設(shè)計(jì)見表1。
表1乙醇回流提取總皂苷因素水平的設(shè)計(jì)
注：A乙醇濃度(％)B溫度(℃)C時(shí)間(min)D料液比(W/V)
2.2.2乙醇回流提取
乙醇回流提取是指用乙醇溶液浸提藥材成分，浸提液被加熱，溶劑餾出后又被冷凝回浸出器中浸提藥材。這樣周而復(fù)始，直至藥材中的有效成分被浸提完全。溫度、時(shí)間、料液比、乙醇濃度是乙醇回流的重要影響因素，故在此四個(gè)因素各設(shè)置三個(gè)水平，優(yōu)選提取條件。以總皂苷的浸膏率為提取率評判標(biāo)準(zhǔn)：浸膏率(％)＝浸膏質(zhì)量/巖生忍冬干重×100％。
2.2.3液液萃取
萃取是利用各種組分(包括目的產(chǎn)物)在兩個(gè)不相混溶的液相中的溶解系數(shù)差異很大，萃取劑有較高的溶解能力，而萃余項(xiàng)溶解度較低。使溶質(zhì)部分從萃取劑內(nèi)轉(zhuǎn)移到以原溶劑為主的萃余項(xiàng)內(nèi)，從而達(dá)到分離目的。本試驗(yàn)先后經(jīng)兩步萃取，第一步是石油醚-水相萃取，取水層，棄去溶解有酯類的石油醚層，起到脫脂的作用；第二步是正丁醇-水相萃取，取溶解有皂苷的水飽和正丁醇層。
萃取后將水飽和正丁醇層減壓旋蒸、烘干。以浸膏率作為評判標(biāo)準(zhǔn)，選出乙醇回流的最佳條件。再分別稱取3組重5g藥物做平行試驗(yàn)，檢測提取工藝的可靠性和重復(fù)性，收集這三組平行試驗(yàn)的浸膏產(chǎn)物(共2.22g)，備用。同時(shí)在此最優(yōu)條件下提取10g巖生忍冬，得浸膏(1.38g)備用。
2.2.4大孔樹脂法
大孔樹脂(macroporous resin)又稱全多孔樹脂，樹脂表面有大大小小、形狀各異、互相貫通的孔穴，通過其巨大的比表面積產(chǎn)生較大的范德華引力或產(chǎn)生氫鍵，從低濃度的溶液中吸附有機(jī)物而工作。樹脂孔徑直接影響不同大小分子的出入，而使樹脂的吸附具有一定的選擇性。不同的有機(jī)化合物因其在樹脂上經(jīng)一定時(shí)間吸附作用后，由相應(yīng)溶劑洗脫，收集的洗脫液中富集大量有機(jī)物質(zhì)從而達(dá)到分離精制的目的。具有吸附容量大、速度快、穩(wěn)定性高、選擇性好、脫色能力強(qiáng)等特點(diǎn)，目前已應(yīng)用于工業(yè)制造、廢水處理、原子能工業(yè)、冶金工業(yè)。由于其種種優(yōu)點(diǎn)，近年來大孔樹脂被廣泛應(yīng)用于中藥成分的提取分離。已有用大孔樹脂對遠(yuǎn)志、知母、常春藤中總皂苷進(jìn)行純化的報(bào)道。本試驗(yàn)中選用NKA-9大孔樹脂，取30mL去離子水溶解烘干后的浸膏，3000rpm離心15min后取上清液減壓旋蒸。水溶浸膏，將溶液上大孔樹脂(干重5g)柱，充分吸附反應(yīng)5h，以10％乙醇濃度為梯度，自10％至90％各取80mL乙醇溶液洗脫大孔樹脂吸附物質(zhì)，收集40％、50％、60％、70％乙醇洗脫液，裝入同一圓底燒瓶，減壓旋蒸，烘干后得精制總皂苷浸膏2.46g。
2.2.5測定抗菌活性:微量肉湯稀釋法
制備標(biāo)準(zhǔn)菌液：復(fù)活標(biāo)準(zhǔn)菌株。輕搖0.5號麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)管，無菌操作將被測定的肉湯培養(yǎng)物加到與標(biāo)準(zhǔn)管相同直徑(大小)的無菌試管中。以無菌操作向被測定試管加入無菌蒸餾水，直到濃度與所要求的標(biāo)準(zhǔn)管的濃度相同。
制備藥液：取10mL亞甲基二砜溶解精制總皂苷浸膏。在注射器上安裝一次性0.22μm(尼龍66)孔徑的針式過濾頭在超凈工作臺(tái)中過濾制得藥液。
配置MH肉湯培養(yǎng)基：參照CLSI(2013版)指導(dǎo)原則和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，配置MH肉湯，高壓滅菌。采取微量肉湯稀釋法測定總皂苷提取物對14種標(biāo)準(zhǔn)菌株的體外抑制能力。
取14個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每板的第12孔作為陰性對照。將MH肉湯按照每孔100μm加入96孔板，然后每板第一孔加入100μm藥液，吹打三次。對藥液進(jìn)行2倍稀釋，即從第一孔吸取100μm液體加入第二孔，吹打三次，照此重復(fù)直至最后一孔，第12孔為陰性對照，不用棄去100μm液體。加完藥物后加稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)菌液，每一板AB、CD、EF、GH排的前1-11孔加入相同菌液100μm。第12孔不加菌液，作為空白對照。另取多西環(huán)素代替總皂苷制成的藥液，做陽性對照。置恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)隔夜，在空白對照不長細(xì)菌的情況下觀察各孔培養(yǎng)液中細(xì)菌生長情況，以抑制細(xì)菌生長的最高稀釋濃度作為巖生忍冬總皂苷提取物的最小抑菌濃度(MIC)。
2.2.6皂苷的檢驗(yàn)
每次在將制得的浸膏溶解之后，需對皂苷進(jìn)行檢驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采取兩種方法對皂苷進(jìn)行定性檢驗(yàn)：方法1：水溶液強(qiáng)烈震蕩，產(chǎn)生持久性泡沫(2min不散)；方法2：硫酸：甲醇(1:1)試劑檢驗(yàn)。噴后加熱，不同皂苷元可顯紅褐色、紫色、黃色或黑色，所顯顏色與溫度無關(guān)。
3結(jié)果與分析
表2醇提總皂苷L9(43)正交試驗(yàn)結(jié)果
注：K表示總和，k表示平均數(shù)，R表示極差
表33組平行試驗(yàn)結(jié)果
注：表示平均數(shù)
表4精制總皂苷對14種病原菌的MIC試驗(yàn)結(jié)果
表5陽性對照藥物多西環(huán)素的質(zhì)控范圍
正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，R值：料液比>溫度＝時(shí)間>乙醇濃度，可知這四個(gè)因素中對總皂苷得率影響最大的因素為料液比，其次是溫度和時(shí)間，影響最小的因素是乙醇濃度。各因素最佳條件分別為A2、B1、C1、D1，即用80％乙醇，料液比為1:14(即取用5g藥材和70mL80％乙醇溶液)時(shí)，70℃下回流105min，所得浸膏率為最高。在9個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，1號組所得浸膏率最高，為14.2％。隨后我們依照正交設(shè)計(jì)所得最優(yōu)條件進(jìn)行了三組平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。平均浸膏率為14.7％，高于正交試驗(yàn)中1號試驗(yàn)組，且重復(fù)率較高。得出結(jié)論A2B1C1D1試驗(yàn)結(jié)果較為穩(wěn)定，故此組合為最優(yōu)提取條件。
由MIC試驗(yàn)結(jié)果可知巖生忍冬總皂苷對本次試驗(yàn)中的致病菌都具有一定程度的抑制能力。其中，對總皂苷最為敏感的菌株為維氏氣單胞菌CGMCC3700株，濃度為0.246g/mL的總皂苷浸膏溶液在稀釋倍數(shù)為512倍時(shí)，即濃度為0.48mg/mL的時(shí)候仍對其具有抑制生長的能力。除了維氏氣單胞菌CGMCC3700株，總皂苷對其余幾種菌株的MIC值都在稀釋倍數(shù)為4-32倍之間，即藥物濃度在7.6875mg/mL-61.5mg/mL之間。
試驗(yàn)得出最佳提取條件中提取時(shí)間為105min，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)并沒有涉及到時(shí)間低于105min時(shí)的提取率?？赡墚?dāng)溫度低于105min時(shí)存在更優(yōu)的條件。本試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)影響總皂苷提取率的實(shí)驗(yàn)因素時(shí)沒有設(shè)置回流次數(shù)這一因素。縮短單次回流時(shí)間，增加回流次數(shù)，可能進(jìn)一步增加提取率，還需要進(jìn)一步的研究。現(xiàn)在很多人選擇乙醇回流提取后樣品直接通過大孔樹脂純化與富集中藥成分。本試驗(yàn)考慮到藥液濃度可能比較高，先進(jìn)行萃取，除去了部分脂溶性物質(zhì)和其他一些雜質(zhì)，有助于提高大孔樹脂吸附率?，F(xiàn)在大部分試驗(yàn)選擇應(yīng)用于提取植物中皂苷成分的AB-8大孔樹脂。
隨著抗生素的應(yīng)用不斷增多，獸醫(yī)臨床中耐抗生素藥物的致病菌株不斷增加。而我國的天然植物資源無疑是一個(gè)巨大的寶藏。傳統(tǒng)中獸醫(yī)中，忍冬歷來就被用于清熱解毒，民間更是有夏季直接將忍冬藤泡水飲用的習(xí)慣。從MIC試驗(yàn)中可看出巖生忍冬中的皂苷成分對14種標(biāo)準(zhǔn)菌株均具有一定的抑菌活性，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。