本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域，具體涉及一種靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系，并將其應(yīng)用于抗癌藥物運(yùn)輸。

背景技術(shù)：

在藥物應(yīng)用領(lǐng)域，目前很多活性藥物分子在臨床應(yīng)用之前及在應(yīng)用過程當(dāng)中遇到了很多問題，例如藥物的理化性質(zhì)(水溶性差，滲透性差等)限制了其臨床應(yīng)用；藥物分子選擇性低，對正常組織的毒性很大。因此開發(fā)合適的藥物載體就成為解決這一問題最經(jīng)濟(jì)、最有效的手段。在眾多的新型藥物載體中，多孔納米材料所具有的多孔結(jié)構(gòu)使其成為較為理想的藥物載體。

在藥物運(yùn)載體系中，多孔納米材料除了發(fā)揮藥物載體的作用外，許多納米材料本身便具有潛在的藥理活性。而二氧化鈰納米粒子的細(xì)胞毒性(誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，引起脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞膜滲漏，dna損傷等)使二氧化鈰成為一種可具有協(xié)同治療功能的生物納米材料。在2013年，曲曉剛課題組在此方面的工作尤為突出，他設(shè)計(jì)了一種基于介孔硅的并含有氧化鈰的ph響應(yīng)的智能藥物釋放體系，在這一藥物運(yùn)載體系中，載藥主體仍然使用常用的介孔硅納米材料，環(huán)糊精包裹的二氧化鈰納米粒子作為藥物的封蓋，利用細(xì)胞不同環(huán)境的ph實(shí)現(xiàn)了抗癌藥物對癌細(xì)胞的控制釋放與協(xié)同治療。然而，在抗癌藥物控制釋放的過程中，環(huán)糊精仍然包裹在二氧化鈰納米粒子上，由于環(huán)糊精獨(dú)特的生物相容性，環(huán)糊精的包裹很大程度影響了二氧化鈰對癌細(xì)胞的毒性，從而使二氧化鈰和藥物對癌細(xì)胞的協(xié)同作用受到了很大的限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷或不足，本發(fā)明的首要目在于提供一種在生理環(huán)境中分散性好、具有良好的生物相容性和協(xié)同抗癌能力的靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系；

為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：

一種靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系，其特征在于，采用具有細(xì)胞毒性的二氧化鈰作為載藥主體，以糖作為靶向基團(tuán)，以糖功能化的柱[5]芳烴作為主體分子，以二氧化鈰載藥主體表面修飾的含二硫鍵的吡啶鹽作為客體分子，通過主客體作用將糖功能化的柱[5]芳烴連接在吸附抗癌藥物的二氧化鈰表面，使得抗癌藥物包封在載藥主體上。

其中，所述的二氧化鈰為多孔二氧化鈰納米棒，其粒徑為60nm。

所述的糖為可以特異性識(shí)別癌細(xì)胞表面糖結(jié)合蛋白的半乳糖。

本發(fā)明的另一目的是提供上述靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系的制備方法，按如下步驟進(jìn)行：

1)在二氧化鈰表面修飾上含二硫鍵的吡啶鹽；

2)將含二硫鍵的吡啶鹽的二氧化鈰吸附藥物；

3)將含糖功能化的柱[5]芳烴通過主客體作用連接在吸附抗癌藥物的二氧化鈰表面作為抗癌藥物封蓋，將抗癌藥物包封，構(gòu)建成為靶向刺激響應(yīng)性多功能納米載藥體系。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述靶向刺激響應(yīng)性多功能納米載藥體系的用途，即：應(yīng)用于抗癌藥物運(yùn)輸。

由于半乳糖的保護(hù)作用，該靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系對正常細(xì)胞顯示較低毒性；當(dāng)其靶向進(jìn)入癌細(xì)胞，在癌細(xì)胞中，二硫鍵被高濃度谷胱甘肽(gsh)還原斷裂，半乳糖的保護(hù)作用消失，二氧化鈰自身的毒性出現(xiàn)，在藥物的控制釋放的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)二氧化鈰和藥物協(xié)同抗癌作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系，具有良好的生物相容性，可靶向進(jìn)攻肝癌細(xì)胞，并且有效地協(xié)同抗癌藥物提高抗癌藥物殺傷力。為進(jìn)一步發(fā)展具有協(xié)同作用的靶向刺激響應(yīng)納米載藥體系提供了一個(gè)堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

本發(fā)明提供的靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系及其用于抗癌藥物的運(yùn)輸具有以下優(yōu)勢：

(1)解決了納米材料的生物相容性和難于修飾等的問題，符合當(dāng)今社會(huì)的發(fā)展要求，具有良好的應(yīng)用和發(fā)展前景。

(2)同現(xiàn)有的載藥體系相比，該靶向刺激響應(yīng)性多功能納米載藥體系可主動(dòng)識(shí)別癌細(xì)胞、具有氧化還原刺激響應(yīng)性、實(shí)現(xiàn)抗癌藥物的靶向運(yùn)輸，利用材料自身毒性還可以協(xié)同提高抗癌藥物對癌細(xì)胞的殺傷力：在該材料表面修飾上具有靶向作用的半乳糖，不僅可以改善材料的生物相容性保護(hù)正常細(xì)胞而且可以實(shí)現(xiàn)對癌細(xì)胞的主動(dòng)識(shí)別；在癌細(xì)胞中，高濃度的gsh可以高效的還原二硫鍵，當(dāng)二硫鍵斷裂后，柱芳烴從材料表面脫落，包封作用與糖保護(hù)作用消失，實(shí)現(xiàn)了抗癌藥物的快速釋放的同時(shí)，利用納米二氧化鈰自身毒性和藥物的協(xié)同作用，可提高對癌細(xì)胞的殺傷力。

附圖說明

圖1是靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系制備示意圖；

圖2是靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系透射電鏡圖片；

圖3是實(shí)施例5所得化合物7的核磁共振氫譜圖；

圖4是未修飾納米材料二氧化鈰的透射電鏡圖片；

圖5是本發(fā)明所得靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系的透射電鏡圖片；

圖6是本發(fā)明所得靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系的載藥毒性試驗(yàn)；

圖7是本發(fā)明所得靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系的材料毒性試驗(yàn)；

圖8是本發(fā)明所得靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系的體外模擬釋放曲線；

圖9是本發(fā)明所得靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系驗(yàn)證靶向的流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；

圖10是實(shí)施例6的反應(yīng)示意圖；

圖11是實(shí)施例7的反應(yīng)示意圖。

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，在以下的實(shí)施例中，本發(fā)明給出了靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系的合成以及該體系的制備過程，應(yīng)當(dāng)理解，以下的實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

參見圖1和圖2，本實(shí)施例給出一種靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系，選擇采用具有細(xì)胞毒性的二氧化鈰納米棒作為載藥主體，以糖作為靶向基團(tuán)，以糖功能化的柱[5]芳烴作為主體分子，以二氧化鈰納米棒載藥主體表面修飾的含二硫鍵的吡啶鹽作為客體分子，通過主客體作用將糖功能化的柱[5]芳烴連接在吸附抗癌藥物的二氧化鈰納米棒表面，使得抗癌藥物包封在載藥主體上。

上述的生物體內(nèi)重要的糖為：半乳糖；

上述作為藥物包封作用并且改善材料生物相容性的主體分子選擇糖功能化柱[5]芳烴，使該載藥體系在低濃度谷胱甘肽(gsh)的正常細(xì)胞中具備良好的生物相容性；

上述刺激響應(yīng)基團(tuán)選擇二硫鍵，當(dāng)被gsh還原之后，二硫鍵斷裂，糖功能化的柱芳烴從多孔二氧化鈰納米棒上脫落，不僅載藥主體上負(fù)載的藥物從孔內(nèi)釋放，實(shí)現(xiàn)抗癌藥物快速釋放，而且糖保護(hù)作用消失，納米二氧化鈰表面裸露，利用材料自身毒性，實(shí)現(xiàn)和藥物協(xié)同抗癌作用。

上述靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系的制備方法，包括如

下步驟：

1)在二氧化鈰納米棒表面修飾上含二硫鍵的吡啶鹽；

2)將含二硫鍵的吡啶鹽的二氧化鈰吸抗癌附藥物；

3)將含糖功能化的柱[5]芳烴通過主客體作用連接在吸附藥物的二氧化鈰納米棒表面作為抗癌藥物封蓋，將抗癌藥物包封，構(gòu)建成為靶向刺激響應(yīng)性多功能納米載藥體系。

由于多孔二氧化鈰納米棒表面連接糖功能化的柱[5]芳烴，可顯著提高體系的生物相容性；同時(shí)，利用半乳糖基可與癌細(xì)胞表面過量表達(dá)的特異性半乳糖結(jié)合蛋白相互作用，實(shí)現(xiàn)靶向選擇性進(jìn)入癌細(xì)胞，進(jìn)而利用癌細(xì)胞內(nèi)較高濃度的gsh促使體系中的二硫鍵快速斷裂，從而釋放抗癌藥物并裸露具有細(xì)胞毒性的二氧化鈰納米粒子，可實(shí)現(xiàn)氧化鈰納米載體與抗癌藥物協(xié)同抗癌的目的。

(一)糖靶向藥物包封材料的合成

實(shí)施例1：

半乳糖衍生物1的合成：在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將2g(5.12mmol)全乙酰化半乳糖溶于15ml的二氯甲烷中；同時(shí)，加入12ml氫溴酸(氫溴酸的濃度33％，溶解在乙酸中，得到hbr)，室溫下反應(yīng)2h。tlc檢測原料反應(yīng)完全后，加入20ml冰水和20ml二氯甲烷后分液，水層用3*20ml二氯甲烷萃取，有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉100ml洗至中性。最后，有機(jī)層用50ml飽和氯化鈉洗一次，清洗后用無水硫酸鈉干燥、減壓除去溶劑得到半乳糖衍生物1。

由于半乳糖衍生物1很不穩(wěn)定，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。將2g半乳糖衍生物1，1.6g(1eq.)四丁基硫酸氫氨(bunhso4)，1.54g(5eq.)疊氮化鈉(nan3)溶于二氯甲烷中，再加入飽和碳酸氫鈉20ml，室溫下反應(yīng)16h。tcl檢測原料反應(yīng)完畢后，用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥后，減壓除去有機(jī)溶劑得到白色固體產(chǎn)物2(1.5g)。

實(shí)施例2：

化合物4的合成：將11g對苯二酚3(100mmol)，碳酸鉀(k2co3)27.6g(200mmol)，溴丙炔47.5g(200mmol)溶于180ml乙腈中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)中加熱回流24h。tcl檢測反應(yīng)完畢后，過濾后真空旋干，用二氯甲烷溶解后用蒸餾水水洗三次。分液后有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥后柱色譜分離得到化合物4(89％)。

實(shí)施例3：

化合物5的合成：取2.72g化合物4(20mmol)溶于60ml的一二二氯乙烷中，氮?dú)猸h(huán)境下加入1.398g多聚甲醛(40mmol)，三氟化硼乙醚4ml室溫下攪拌一小時(shí)，tlc檢測反應(yīng)結(jié)束后加入冰水淬滅，有機(jī)層用水洗三次，飽和氯化鈉洗三次，最后用無水硫酸鈉干燥，柱色譜分離得到化合物5(75％)。

實(shí)施例4：

化合物6的合成：500mg化合物2(1.33mmol)，66mg化合物5溶解在10ml的二氯甲烷中，加入30mg五水硫酸銅(0.12mmol)，80mg抗壞血酸鈉(0.57mmol)，最后加入10ml蒸餾水。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢?4h。tlc檢測反應(yīng)完畢后，用二氯甲烷稀釋水洗3遍。有基層用硫酸鈉干燥后過濾，濃縮后柱色譜分離得到淺黃色固體化合物6(56％)。

實(shí)施例5：

化合物7的合成：將2.36g化合物6(0.5mmol)溶解在甲醇鈉的甲醇溶液(35ml，0.15m)中，室溫?cái)嚢?2h。得到的懸濁液減壓抽濾，并且用20ml甲醇洗5遍，得到白色固體化合物7(73％)，核磁共振氫譜圖參見圖3。

實(shí)施例6：

材料9的合成：將10mg的多孔二氧化鈰納米棒8分散在15ml乙醇中，加入133μl蒸餾水，加入3.34mg巰丙基三甲氧基硅烷，3.73mg二硫吡啶，室溫下攪拌12h。之后對該懸濁液離心處理，并用乙醇和蒸餾水各洗5遍后凍干處理，得到多孔二氧化鈰納米棒8表面含二硫吡啶的灰色粉末材料9。

(二)糖靶向智能多孔納米材料的制備

實(shí)施例7：

定量稱取灰色粉末材料9超聲分散于蒸餾水溶液中，稱取等當(dāng)量的白色固體化合物7溶于上述分散體系中，超聲10min，室溫中靜置2h后離心該懸濁液，之后在乙醇溶液中分散，分別取少量滴到銅網(wǎng)上，自然晾干即可用場發(fā)射掃面電鏡進(jìn)行觀察，圖2即為所看到的透射電鏡圖片(圖4為未經(jīng)修飾的納米二氧化鈰，圖5是本發(fā)明所得靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系的透射電鏡圖片)。

另外申請人還將上述靶向刺激響應(yīng)性多功能二氧化鈰納米載藥體系進(jìn)行了載藥毒性試驗(yàn)(圖6)和材料毒性試驗(yàn)(圖7)；以及靶向的流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(圖9)。

通過細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該載藥體系的靶向性；通過體外實(shí)驗(yàn)表明該載藥體系具有g(shù)sh響應(yīng)性；并通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明了該載藥體系具有較好的生物相容性和協(xié)同抗癌能力。該多功能納米載藥體系制備過程簡單、制備周期短，穩(wěn)定性高，具有良好的生物相容性，在多功能納米載藥體系中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用和發(fā)展前景。

上述對實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用本發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易的對這些實(shí)施例做出各種修改，并把此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)發(fā)明的提示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。