本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種制備斑馬魚(yú)血栓模型的方法。
背景技術(shù)：
：心血管疾病(cardiovasculardisease,CVD)是一類(lèi)心臟或者血管相關(guān)的疾病。主要包括冠狀動(dòng)脈疾病如心絞痛、心肌梗塞，以及其他心血管疾病如中風(fēng)、高血壓心臟病、外周動(dòng)脈疾病、靜脈血栓等，是世界范圍內(nèi)致死和致殘的主要疾病之一。《中國(guó)心血管病報(bào)告2015》顯示：2014年，中國(guó)心血管病死亡率仍居疾病死亡構(gòu)成的首位，高于腫瘤及其他疾病。其中，農(nóng)村心血管病死亡率從2009年起超過(guò)并持續(xù)高于城市水平。心血管病占居民疾病死亡構(gòu)成在農(nóng)村為44.60％，在城市為42.51％。血栓形成或栓塞是導(dǎo)致心臟和外周血管事件的最后關(guān)鍵環(huán)節(jié),是心血管疾病致死和致殘的直接原因。臨床常用的抗血栓藥物如華法林，阿司匹林，氯吡格雷等，長(zhǎng)期使用容易導(dǎo)致出血風(fēng)險(xiǎn)。溶栓藥物如鏈激酶(Streptokinase,SK),尿激酶(Urokinase,UK),蚓激酶(Lumbrukinase),尿激酶原(Pro-urokinase),葡激酶(Staphylokinase),重組組織型纖溶酶原激活劑等，均有較好的溶栓效應(yīng)，但是由于血栓形成后的治療窗口期在0-6小時(shí)左右，超過(guò)時(shí)限，即便是溶栓治療，產(chǎn)生的臨床意義也有限，所以開(kāi)發(fā)新型的安全，高效的抗血栓生成藥物仍然意義重大。通過(guò)手術(shù)結(jié)扎、激光損傷、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)等多種方法可以成功地誘導(dǎo)小鼠、大鼠，家兔等高等動(dòng)物的血栓模型，但由于使用大鼠、小鼠等動(dòng)物造模時(shí)，所需動(dòng)物數(shù)量巨大、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)、試驗(yàn)費(fèi)用高、模型可重復(fù)性較差等原因，這類(lèi)血栓動(dòng)物模型僅適用于少數(shù)藥物的抗血栓效應(yīng)評(píng)價(jià)，尚不適用于抗血栓藥物的大規(guī)模篩選。和傳統(tǒng)的哺乳類(lèi)動(dòng)物模型如嚙齒類(lèi)大鼠、小鼠相比較，斑馬魚(yú)動(dòng)物模型具有飼養(yǎng)成本低，觀察方便，易于實(shí)現(xiàn)高通量篩選，可有效模擬人類(lèi)疾病病理特征等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為公認(rèn)的理想藥物篩選模型。斑馬魚(yú)的血栓形成和凝血機(jī)制與人類(lèi)相似，是很好的研究血栓形成的動(dòng)物模型?，F(xiàn)在已經(jīng)通過(guò)不同的方法建立了多種斑馬魚(yú)血栓模型，如JagadeeswaranP研究團(tuán)隊(duì)用氯化鐵、苯肼、或者激光損傷產(chǎn)生了相應(yīng)的血栓模型。張勇研究小組發(fā)表了用苯肼誘導(dǎo)斑馬魚(yú)血栓研究的論文，劉可春課題組利用ADP成功的誘導(dǎo)了斑馬魚(yú)血栓模型。這些斑馬魚(yú)血栓模型或者由于操作繁瑣，需要昂貴的設(shè)備，或者模型穩(wěn)定性較差。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種制備斑馬魚(yú)血栓動(dòng)物模型的新方法。本發(fā)明提供了一種制備斑馬魚(yú)血栓動(dòng)物模型的方法，它利用腎上腺素作為血栓誘導(dǎo)劑。具體的，它包括以下步驟：1)挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)30條左右移入微孔板，微孔板中事先加入用胚胎培養(yǎng)水配制的一定濃度腎上腺素溶液，藥液加好后加蓋封閉,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4-30小時(shí)后，吸棄培養(yǎng)水，用移液槍吸取等體積鄰聯(lián)茴香胺染色液于微孔板中避光染色15min；或挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)30條左右，在其卵黃部位注射一定濃度腎上腺素溶液，注射完成后移入事先加入胚胎培養(yǎng)水的微孔板中，然后加蓋封閉,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4-30小時(shí)后，吸棄培養(yǎng)水，用移液槍吸取等體積鄰聯(lián)茴香胺染色液于微孔板中避光染色15min；2)移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；3)將斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)入新的微孔板中，加入DMSO；4)取斑馬魚(yú)置載玻片上，于顯微鏡下對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行拍照并保存；5)利用圖像處理軟件(如Image-ProPlus6)計(jì)算斑馬魚(yú)軀干部及尾部血管染色面積，記錄斑馬魚(yú)尾部血管紅細(xì)胞的染色面積作為血栓發(fā)生程度的指標(biāo)。其中，所述的斑馬魚(yú)幼魚(yú)指的是受精后發(fā)育3-14天的幼魚(yú)。其中，所述的腎上腺素的濃度在2mmol/L～30mmol/L之間。其中，所述的置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間為4-30小時(shí)。其中，所述的斑馬魚(yú)指各種實(shí)驗(yàn)用品系的斑馬魚(yú)。其中，斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)用水配方：5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4。其中，鄰聯(lián)茴香胺染色液配方：含0.6mg/mL鄰聯(lián)茴香胺,0.01moL/L醋酸鈉,0.65％H202,、40％酒精，溶劑為水。0.65％H202是指：體積濃度為0.65％的H202。40％酒精是指：體積濃度為40％酒精。其中，斑馬魚(yú)幼魚(yú)的選?。喊凑粘Ｒ?guī)技術(shù)飼養(yǎng)斑馬魚(yú)，收集斑馬魚(yú)受精卵，受精卵進(jìn)行消毒和清洗后,移入斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)用水中(斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)用水配方：5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4),28℃下控光培養(yǎng)。在斑馬魚(yú)發(fā)育至5dpf,在倒置顯微鏡下挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)。優(yōu)選的，本發(fā)明動(dòng)物模型的制備方法，包括以下步驟：挑選健康性成熟的斑馬魚(yú),按雌雄1∶2的比例放入交配缸內(nèi),次日清晨獲得胚胎，用胚胎培養(yǎng)水進(jìn)行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培養(yǎng)箱，每日更換胚胎培養(yǎng)水兩次，在斑馬魚(yú)發(fā)育至5dpf時(shí)，在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)30條左右移入6孔板，6孔板中事先加入用胚胎培養(yǎng)水配制的濃度為4mmol/mL腎上腺素溶液，藥液加好后置于培養(yǎng)箱(28℃)內(nèi)培養(yǎng)8小時(shí)后，吸棄培養(yǎng)水，用移液槍吸取等體積鄰聯(lián)茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯(lián)茴香胺,0.01moL/L醋酸鈉,0.65％,H202,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑馬魚(yú)置載玻片上，于顯微鏡下對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行拍照并保存；利用圖像處理軟件計(jì)算斑馬魚(yú)軀干部及尾部血管染色面積。進(jìn)一步優(yōu)選的，本發(fā)明動(dòng)物模型的制備方法，包括以下步驟：挑選健康性成熟的斑馬魚(yú),按雌雄1∶2的比例放入交配缸內(nèi),次日清晨獲得胚胎，用胚胎培養(yǎng)水進(jìn)行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培養(yǎng)箱，每日更換胚胎培養(yǎng)水兩次，在斑馬魚(yú)發(fā)育至5dpf時(shí)，在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥組各挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)30條移入6孔板，6孔板中除空白對(duì)照組外均加入用胚胎培養(yǎng)水配制的濃度為4mmol/mL腎上腺素溶液，空白對(duì)照組僅加入胚胎培養(yǎng)用水，陽(yáng)性藥組加入Warfarin至終濃度為300μmol/L，藥液加好后置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8小時(shí)后，吸棄培養(yǎng)水，用移液槍吸取等體積鄰聯(lián)茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯(lián)茴香胺,0.01moL/L醋酸鈉,0.65％,H202,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑馬魚(yú)置載玻片上，于顯微鏡下對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行拍照并保存；利用圖像處理軟件計(jì)算斑馬魚(yú)軀干部及尾部血管染色面積，血栓增加率和血栓抑制率的計(jì)算方法為：血栓增加率％＝模型對(duì)照組斑塊染色面積*100/空白對(duì)照組斑塊染色面積；血栓抑制率％＝(模型對(duì)照組斑塊染色面積-陽(yáng)性藥組斑塊染色面積)*100/模型對(duì)照組斑塊染色面積，其中，空白對(duì)照組溶液的配制：使用去離子水配制含5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4，其中，陽(yáng)性藥組溶液的配制：使用去離子水配制含5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4,4mmol/mL腎上腺素，300μmol/LWarfarin。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供斑馬魚(yú)血栓動(dòng)物模型的使用方法：斑馬魚(yú)軀干部及尾部血管染色面積代表了血栓發(fā)生的程度，待評(píng)價(jià)藥物可以在造模前加入，或者與腎上腺素同時(shí)加入，或者在腎上腺素加入后2-4小時(shí)內(nèi)加入均可，通過(guò)比較空白對(duì)照組，模型對(duì)照組以及給藥組的染色面積，可以定量的比較藥物的抗血栓生成效應(yīng)。本發(fā)明采用腎上腺素誘導(dǎo)斑馬魚(yú)形成血栓動(dòng)物模型，模型成功率高，穩(wěn)定，腎上腺素功能眾多，可以較好地模擬臨床病理狀態(tài)下血栓的發(fā)生，同時(shí)操作簡(jiǎn)便，可以在微孔板中操作，易于實(shí)現(xiàn)高通量篩選。該方法制作過(guò)程簡(jiǎn)單，成本低廉，可廣泛推廣，模型成功率高，結(jié)果穩(wěn)定，斑馬魚(yú)的血栓形成與人類(lèi)的血栓形成分子機(jī)制高度相似，可以用于抗血栓藥物的篩選和藥效評(píng)價(jià)。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想的前提下，還可以做出其他多種形式的修改、替換及變更。對(duì)說(shuō)明書(shū)中出現(xiàn)的以下名詞進(jìn)行解釋、說(shuō)明：Dpf：Dayspastfertilization斑馬魚(yú)胚胎受精后發(fā)育的天數(shù)DMSO：DimethylSulphoxide二甲基亞砜具體實(shí)施方式以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本
發(fā)明內(nèi)容再做進(jìn)一步說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1：本發(fā)明動(dòng)物模型的制備實(shí)驗(yàn)方法：斑馬魚(yú)飼養(yǎng)條件為：水溫27.5-28.5℃，電導(dǎo)率450-850μS/cm，pH值6.8-7.2，明/暗周期為14h/10h。挑選健康性成熟的斑馬魚(yú),按雌雄1∶2的比例放入交配缸內(nèi),次日清晨獲得胚胎，用胚胎培養(yǎng)水進(jìn)行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培養(yǎng)箱，每日更換胚胎培養(yǎng)水兩次。在斑馬魚(yú)發(fā)育至5dpf時(shí)，在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？瞻讓?duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥組(Warfarin華法林，>98％，湖北興銀河化工有限公司)各挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)30條移入6孔板，6孔板中除空白對(duì)照組外均加入用胚胎培養(yǎng)水配制的濃度為4mmol/mL腎上腺素溶液，空白對(duì)照組僅加入胚胎培養(yǎng)用水，陽(yáng)性藥組加入Warfarin至終濃度為300μmol/L。藥液加好后置于培養(yǎng)箱(28℃)內(nèi)培養(yǎng)8小時(shí)后，吸棄培養(yǎng)水，用移液槍吸取等體積鄰聯(lián)茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯(lián)茴香胺,0.01moL/L醋酸鈉,0.65％,H202,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑馬魚(yú)置載玻片上，于顯微鏡下對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行拍照并保存；利用圖像處理軟件(如Image-ProPlus6)計(jì)算斑馬魚(yú)軀干部及尾部血管染色面積。血栓增加率和血栓抑制率的計(jì)算方法為：血栓增加率％＝模型對(duì)照組斑塊染色面積*100/空白對(duì)照組斑塊染色面積；血栓抑制率％＝(模型對(duì)照組斑塊染色面積-陽(yáng)性藥組斑塊染色面積)*100/模型對(duì)照組斑塊染色面積。其中，空白對(duì)照組溶液的配制：使用去離子水配制含5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4，其中，陽(yáng)性藥組溶液的配制：使用去離子水配制含5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4,4mmol/mL腎上腺素，300μmol/LWarfarin。其中，4mmol/mL腎上腺素溶液:將腎上腺素溶解于胚胎培養(yǎng)水中使其含5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/LCaCl2,0.16mmol/LMgSO4，4mmol/mL腎上腺素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表1顯示了華法林對(duì)AH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)尾部血栓面積影響，從數(shù)據(jù)可以看出，腎上腺素誘導(dǎo)后，血栓面積是原來(lái)面積的685％，華法林處理后，血栓面積大大降低，僅為原來(lái)的147％，華法林對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)的血栓生成抑制率達(dá)到78.5％。說(shuō)明本模型可以有效的誘導(dǎo)血栓發(fā)生，陽(yáng)性藥華法林可以有效地抑制腎上腺素誘導(dǎo)的血栓生成。表1華法林對(duì)AH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)尾部血栓面積影響(n＝30)尾部血栓面積(像素)血栓增加率％血栓抑制率％CK141.65±182.76100-----AH970.35±459.326850Warfarin207.85±236.2214778.5實(shí)施例2：本發(fā)明動(dòng)物模型的制備實(shí)驗(yàn)方法：斑馬魚(yú)飼養(yǎng)條件為：水溫27.5-28.5℃，電導(dǎo)率450-850μS/cm，pH值6.8-7.2，明/暗周期為14h/10h。挑選健康性成熟的斑馬魚(yú),按雌雄1∶2的比例放入交配缸內(nèi),次日清晨獲得胚胎，用胚胎培養(yǎng)水進(jìn)行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培養(yǎng)箱，每日更換胚胎培養(yǎng)水兩次。在斑馬魚(yú)發(fā)育至3dpf時(shí)，在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？瞻讓?duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥組(Warfarin，>98％，湖北興銀河化工有限公司)各挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)30條左右移入12孔板，12孔板中除空白組外均加入用胚胎培養(yǎng)水配制的濃度為2mmol/mL腎上腺素溶液，空白對(duì)照組僅加入胚胎培養(yǎng)用水，陽(yáng)性藥組加入Warfarin至終濃度為300μmol/L。藥液加好后置于培養(yǎng)箱(28℃)內(nèi)培養(yǎng)30小時(shí)后，吸棄培養(yǎng)水，用移液槍吸取等體積鄰聯(lián)茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯(lián)茴香胺,0.01moL/L醋酸鈉,0.65％,H202,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑馬魚(yú)置載玻片上，于顯微鏡下對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行拍照并保存；利用圖像處理軟件(如Image-ProPlus6)計(jì)算斑馬魚(yú)軀干部及尾部血管染色面積。實(shí)施例3：本發(fā)明動(dòng)物模型的制備實(shí)驗(yàn)方法：斑馬魚(yú)飼養(yǎng)條件為：水溫27.5-28.5℃，電導(dǎo)率450-850μS/cm，pH值6.8-7.2，明/暗周期為14h/10h。挑選健康性成熟的斑馬魚(yú),按雌雄1∶2的比例放入交配缸內(nèi),次日清晨獲得胚胎，用胚胎培養(yǎng)水進(jìn)行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培養(yǎng)箱，每日更換胚胎培養(yǎng)水兩次。在斑馬魚(yú)發(fā)育至14dpf時(shí)，在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？瞻讓?duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥組(Warfarin，>98％，湖北興銀河化工有限公司)各挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)30條左右移入24孔板，24孔板中除空白組外均加入用胚胎培養(yǎng)水配制的濃度為30mmol/mL腎上腺素溶液，空白對(duì)照組僅加入胚胎培養(yǎng)用水，陽(yáng)性藥組加入Warfarin至終濃度為300μmol/L，。藥液加好后置于培養(yǎng)箱(28℃)內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí)后，吸棄培養(yǎng)水，用移液槍吸取等體積鄰聯(lián)茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯(lián)茴香胺,0.01moL/L醋酸鈉,0.65％,H202,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑馬魚(yú)置載玻片上，于顯微鏡下對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行拍照并保存；利用圖像處理軟件(如Image-ProPlus6)計(jì)算斑馬魚(yú)軀干部及尾部血管染色面積。實(shí)施例4、傳統(tǒng)動(dòng)物模型的制備1.大鼠血栓模型1.1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物150只SD大鼠,SPF級(jí),年齡8～12w，體重300±209,雌雄不限。飼養(yǎng)條件為室溫20～25℃,光線(xiàn)、通風(fēng)良好,自由飲水、進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。1.2.實(shí)驗(yàn)試劑3％碘酒消毒，75％的酒精脫碘，0.9％生理鹽水；1.3.試驗(yàn)設(shè)備手術(shù)顯微鏡(鎮(zhèn)江中天光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；XTS-6A型)；顯微手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械有限公司；Q/CYAEin-2000)；彩色病理圖像分析儀(日本OLYMpUS；BX50)；顯微鏡攝像頭(日本JVC；TK-C1381)；直柄式電動(dòng)石膏鋸(浙江醫(yī)療器械有限公司)；無(wú)水石膏繃帶(浙江義烏捷康醫(yī)療用品有限公司；生產(chǎn)許可證2000308號(hào))。1.4.實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)大鼠不麻醉，3％碘酒消毒，75％酒精脫碘，消毒范圍為劍突以下至足趾末端，鋪無(wú)菌洞巾，行腹股溝處內(nèi)側(cè)切口，長(zhǎng)約1cm，分離皮下組織，暴露股動(dòng)、靜脈和股神經(jīng)，顯露出長(zhǎng)約1.5cm的股靜脈，用同一廠家，同一批號(hào)新制12.5mm全齒蚊式血管鉗分三段各鉗夾1次，力量為血管鉗緊1扣，每次持續(xù)3s，鉗夾完畢，用1號(hào)絲線(xiàn)全層間斷縫合皮膚切口，不放置引流，按同法處理另一側(cè)后，行骸人字石膏固定，石膏厚度6層，固定石膏時(shí)開(kāi)窗暴露切口位置，便于觀察局部組織反應(yīng)情況，切口用酒精紗布包扎。造模后大鼠正常飲水，顆粒飼料喂養(yǎng)，不使用抗菌素。2.苯肼誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)血栓模型1.1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AB系野生型斑馬魚(yú)。每次交配準(zhǔn)備4～5對(duì)成年斑馬魚(yú)，平均每對(duì)能產(chǎn)200～300個(gè)胚胎。在受精后6h(即6hpf，hourspostfertilization)和24hpf對(duì)胚胎進(jìn)行清理(移除已死亡胚胎)，并根據(jù)胚胎的發(fā)育階段挑選合適的胚胎。1.2.實(shí)驗(yàn)試劑苯肼(阿拉丁)、無(wú)水乙醇、鄰聯(lián)茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯(lián)茴香胺、0.01mol/L醋酸鈉、0.65％H2O2、40％乙醇)；1.3.試驗(yàn)設(shè)備解剖顯微鏡(SMZ645，Nikon公司，日本)，電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡(AZlOO，Nikon公司，日本)，12孔板(NestBiotech)。1.4.實(shí)驗(yàn)操作在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至2d時(shí)，在解剖顯微鏡挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)胚胎，將其分到12孔板中，每孔30尾，分別設(shè)置血栓誘導(dǎo)劑處理組(0.5μmol/L～8μmol/L)、溶劑對(duì)照組(0.1％的酒精)、1個(gè)空白對(duì)照組(胚胎養(yǎng)殖用水)。之后28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1d。用鄰聯(lián)茴香胺染色液(含0.6mg/mL鄰聯(lián)茴香胺、0.01mol/L醋酸鈉、0.65％H202、40％乙醇)對(duì)血栓誘導(dǎo)劑處理組、溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組進(jìn)行染色，整個(gè)染色過(guò)程需避光操作。移除微孔板中的液體，加入等體積濃度為0.64mmol/L的甲磺酸麻醉斑馬魚(yú)，用3％甲基纖維素膠固定于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)尾靜脈血栓形成情況。本發(fā)明與傳統(tǒng)的模型制備方法相比較，具有以下特點(diǎn)：1.與其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型相比，斑馬魚(yú)血栓模型具有檢測(cè)快捷，成本低廉，便于抗血栓藥物的高通量篩選的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)于血栓動(dòng)物模型的研究很多，目前已經(jīng)利用小鼠，大鼠、小型豬等多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用不同方法構(gòu)建了相應(yīng)的血栓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。血栓模型的造模方法分為以下幾類(lèi)，第一類(lèi)是對(duì)動(dòng)物進(jìn)行物理?yè)p傷形成血栓模型，比如光化學(xué)反應(yīng)可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血小板聚集和血栓形成。Herrmann等采用異硫氰酸熒光素作光敏劑引發(fā)光化學(xué)反應(yīng)，使倉(cāng)鼠面頰部血管的血小板發(fā)生聚集等。第二類(lèi)是通過(guò)外界環(huán)境刺激或者藥物(如腎上腺素)刺激造成動(dòng)物情緒變化劇烈，從而導(dǎo)致血栓發(fā)生，如長(zhǎng)期冷刺激，注射醋酸氫化可的松或者腎上腺素等方法造成血栓模型，其中注射腎上腺素加冰浴刺激是比較廣泛的造模方法，目前使用最多。第三類(lèi)方法是基于血液流變學(xué)特征的改變，通過(guò)注射高分子右旋糖苷誘導(dǎo)動(dòng)物微循環(huán)減慢，形成類(lèi)似血瘀進(jìn)而形成血栓的動(dòng)物模型，此模型在日本、韓國(guó)也受到關(guān)注。在以上模型中，判斷血栓模型是否成功的基本指標(biāo)包括血液流變學(xué)、血小板聚集性、血小板功能、血栓的形成及血栓面積、微循環(huán)等以及與此相關(guān)的生化因子如血小板活化相關(guān)因子，內(nèi)皮素、細(xì)胞黏附分子、炎癥因子等的變化。以上基于小鼠、大鼠等哺乳動(dòng)物的血栓模型可以很好的模擬人類(lèi)血栓發(fā)生時(shí)的病理變化，對(duì)于驗(yàn)證藥物的有效性，了解藥物的作用機(jī)制有巨大的促進(jìn)作用。以上模型的缺點(diǎn)在于使用較多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，造模周期較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)銷(xiāo)相對(duì)較多，在探討具體的藥物作用機(jī)制方面更具優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于以藥物活性評(píng)測(cè)、藥物篩選為目的的實(shí)驗(yàn)則不適用，所以建立快速檢測(cè)，成本低廉的血栓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型有重要的意義。和傳統(tǒng)的哺乳類(lèi)動(dòng)物模型如嚙齒類(lèi)大鼠、小鼠相比較，斑馬魚(yú)動(dòng)物模型具有許多天然的優(yōu)勢(shì)。首先，斑馬魚(yú)體積小，成魚(yú)體長(zhǎng)僅3-4cm，幼龜體長(zhǎng)只有1-2mm，可以使用96孔或者384孔微孔板進(jìn)行大模規(guī)模實(shí)驗(yàn)操作，所以斑馬魚(yú)動(dòng)物模型適合高通量、高內(nèi)涵自動(dòng)化分析；斑馬魚(yú)飼養(yǎng)成本低，占地空間小，200m2的空間可養(yǎng)殖50000條以上成魚(yú)，而且藥物用量少(微克級(jí)，為小鼠實(shí)驗(yàn)用藥量的1/100到1/1000)；另外斑馬魚(yú)產(chǎn)卵量大，胚胎發(fā)育周期短，一對(duì)成魚(yú)每周可產(chǎn)卵200-400枚，從受精卵到完整的胚胎僅需要24h，受精后60h左右，斑馬魚(yú)的心、腦、肝、腎、脾、胰腺、血液和血管等器官均已建成，斑馬魚(yú)發(fā)育7d之內(nèi)，胚胎透明，結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)可以在顯微鏡下清晰的觀察到器官的形態(tài)變化及功能變化，如心跳、心率、血流、肝臟、腎臟、心包形態(tài)上的異常等；斑馬魚(yú)基因組與人類(lèi)相似度達(dá)85％，疾病相關(guān)的基因和人類(lèi)的相似度高達(dá)99％，可以模擬人類(lèi)的發(fā)病過(guò)程，用于藥物篩選可以極大地降低藥物篩選周期及成本，是非常理想的藥物篩選模型。對(duì)于成分復(fù)雜的中藥來(lái)說(shuō)，分離純化成本極高，而微克級(jí)的樣品即可滿(mǎn)足斑馬魚(yú)藥物效應(yīng)的觀察，這對(duì)于其它模型來(lái)說(shuō)是很難實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，斑馬魚(yú)作為整體動(dòng)物模型，能夠反映藥物對(duì)于整體動(dòng)物的作用效果，符合中藥整體性作用的理論特點(diǎn)，比離體的細(xì)胞、分子藥物篩選模型更能真實(shí)的反映中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用模式，能夠有效的防止體外篩選中的漏篩現(xiàn)象，所以斑馬魚(yú)藥物篩選模型尤其適用于成分復(fù)雜的中藥活性物質(zhì)的篩選。2.與其他斑馬魚(yú)血栓模型相比，基于腎上腺素誘導(dǎo)的模型具有穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)，與人類(lèi)血栓的形成機(jī)制相似度高等優(yōu)點(diǎn)。目前利用斑馬魚(yú)制作血栓動(dòng)物模型的研究已開(kāi)展了近十年，也取得了一些進(jìn)展。已有的研究顯示，斑馬魚(yú)的血栓形成和凝血機(jī)制與人類(lèi)相似，在人類(lèi)中存在的與血栓形成相關(guān)的基因在斑馬魚(yú)中均存在，功能也完全相似，所以斑馬魚(yú)是很好的研究血栓形成的動(dòng)物模型。JagadeeswaranP研究團(tuán)隊(duì)嘗試用多種方法建立斑馬魚(yú)血栓模型，如氯化鐵誘導(dǎo)的血栓模型，苯肼誘導(dǎo)的血栓模型及激光損傷誘導(dǎo)的血栓模型。其中苯肼誘導(dǎo)的血栓模型經(jīng)進(jìn)一步的研究證實(shí)，苯肼誘導(dǎo)的血栓并不是由于血小板聚集引起的血栓，不能模擬疾病發(fā)生時(shí)血栓的形成過(guò)程，用傳統(tǒng)的抗血栓藥物阿司匹林作用也不能抑制苯肼的誘導(dǎo)作用，國(guó)內(nèi)張勇研究小組發(fā)表了用苯肼誘導(dǎo)斑馬魚(yú)血栓研究的論文，但該論文未對(duì)血栓的組成進(jìn)一步的檢測(cè)，僅僅限于血栓形態(tài)學(xué)的觀測(cè)，所以該血栓模型的有效性仍然值得探討；氯化鐵誘導(dǎo)的血栓模型可以有效模擬人類(lèi)疾病時(shí)血栓的發(fā)生，華法林等抗凝藥物也可以對(duì)抗氯化鐵誘導(dǎo)的血栓形成，但是該模型中，氯化鐵是用濾紙貼在麻醉后的斑馬魚(yú)身體上，依靠藥物的自然擴(kuò)散作用擴(kuò)散至血管導(dǎo)致形成血栓，操作十分繁瑣，而且血栓通常在幾十秒內(nèi)形成，主要是由于氯化鐵引發(fā)自由基爆發(fā)導(dǎo)致血栓形成，誘發(fā)血栓效應(yīng)太過(guò)劇烈，藥物的抗血栓效應(yīng)難以觀察，無(wú)法進(jìn)行高通量的篩選，所以并不適合藥物的篩選。Jagadeeswaran等用激光誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)血栓模型同樣是在幾十秒內(nèi)形成血栓，難以觀察到藥物的作用效果，同時(shí)由于該模型需要昂貴的激光器、顯微操作裝置等精密儀器，亦不適用于高通量篩選的需要。劉可春課題組利用ADP成功的誘導(dǎo)了斑馬魚(yú)血栓模型，但僅報(bào)道了ADP可以誘導(dǎo)血栓形成，血栓的形成證據(jù)是通過(guò)觀察血小板熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(CD41:GFP)背部的熒光亮斑證實(shí)的，缺乏血栓形成率等造模關(guān)鍵指標(biāo)，同時(shí)也缺乏陽(yáng)性藥物的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所以該斑馬魚(yú)血栓模型的穩(wěn)定性仍需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。我們前期利用ADP誘導(dǎo)斑馬魚(yú)血栓模型的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該模型的血栓成功率很低，ADP濃度較低時(shí)，很難誘發(fā)血栓形成，而ADP濃度較高時(shí)，極易導(dǎo)致斑馬魚(yú)的死亡，說(shuō)明該模型存在不穩(wěn)定性，我們推測(cè)可能的原因是ADP是生物體內(nèi)能量代謝十分重要的分子，生物體內(nèi)有豐富的磷酸酯酶可以使ADP分解為AMP或者轉(zhuǎn)化為ATP,該過(guò)程可以極為迅速的進(jìn)行，所以進(jìn)入斑馬魚(yú)體內(nèi)的ADP會(huì)被快速分解，在血液中難以達(dá)到誘發(fā)血栓形成的有效濃度，所以導(dǎo)致該模型不太穩(wěn)定。在以上研究的基礎(chǔ)上，我們嘗試了利用腎上腺素溶液作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)斑馬魚(yú)產(chǎn)生以微循環(huán)障礙為特征的血栓動(dòng)物模型。腎上腺素是非常重要的血小板活化劑，我們的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腎上腺素溶液可以有效的誘導(dǎo)降低斑馬魚(yú)微循環(huán)速度，促進(jìn)斑馬魚(yú)血栓的形成，模型穩(wěn)定，重復(fù)性高，利用血小板熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(CD41:GFP)可以在顯微鏡下觀察到明顯的血小板聚集，誘導(dǎo)的血栓主要位于斑馬魚(yú)尾部靜脈血管，血栓誘導(dǎo)率可高達(dá)90％以上。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3