本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海洋生物活性組合物及藥用制劑。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)60年代以來(lái)，人們對(duì)巨大的海洋生物資源進(jìn)行了世界范圍的大規(guī)模研究，掀起了海洋藥物研究開(kāi)發(fā)熱潮。其中，抗腫瘤活性物質(zhì)尤其引人矚目，已經(jīng)成為全世界普遍關(guān)注的研究熱點(diǎn)。學(xué)者預(yù)言，最有前途的抗癌藥物將來(lái)自海洋，海洋抗腫瘤活性物質(zhì)一直是海洋藥物研究的重點(diǎn)。
腫瘤(tumour)是指機(jī)體在各種致瘤因子作用下，局部組織細(xì)胞增生所形成的新生物(neogrowth)，因?yàn)檫@種新生物多呈占位性塊狀突起，也稱(chēng)贅生物(neoplasm)。根據(jù)新生物的細(xì)胞特性及對(duì)機(jī)體的危害性程度，又將腫瘤分為良性腫瘤和惡性腫瘤兩大類(lèi)，而癌癥即為惡性腫瘤的總稱(chēng)。要注意的是，癌癥與癌是兩個(gè)不同的概念，癌指的是上皮性的惡性腫瘤，如由大腸黏膜上皮形成的惡性腫瘤稱(chēng)為大腸黏膜上皮癌，簡(jiǎn)稱(chēng)大腸癌。由皮膚上皮形成的稱(chēng)皮膚上皮癌，簡(jiǎn)稱(chēng)皮膚癌等等。若醫(yī)生說(shuō)某某人患的是癌癥，即表明患者長(zhǎng)的是惡性腫瘤；若說(shuō)某某人患的是胃癌，意思是患者的胃黏膜上皮形成的癌癥，若說(shuō)患者得的是胃肉瘤，則表明這種惡性腫瘤不是由黏膜上皮細(xì)胞所形成的，可能由平滑肌細(xì)胞惡變引起，或是屬于胃的惡性淋巴瘤等。
牡蠣又稱(chēng)蠔、海蠣子等，是一種常見(jiàn)的海洋貝類(lèi)動(dòng)物，屬軟體動(dòng)物門(mén)，瓣鰓綱(Lamellibranchia)，牡蠣科(Ostreidae)，牡蠣屬。牡蠣肉質(zhì)鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的食品?，F(xiàn)代研究表明，牡蠣肉中含有豐富的糖原、蛋白質(zhì)、氨基酸、人體必需的微量元素、維生素和較多的具有重要生理活性的不飽和脂肪酸。實(shí)踐證明，牡蠣提取物可以治療多種疾病，起到特殊的療效。當(dāng)前，國(guó)外除了將牡蠣作為海味直接食用外，也開(kāi)發(fā)研制了大量以牡蠣提取物為主要成分的食品、保健品和藥品，這些產(chǎn)品不僅具有相當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)或治療價(jià)值，而且也具有極高的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。目前有關(guān)牡蠣提取物的制備方法很多，如US66732公開(kāi)了一種由牡蠣分泌液制備牡蠣提取物的方法；CN1024074C公開(kāi)了一種全營(yíng)養(yǎng)牡蠣精粉的生產(chǎn)方法；CN1067553C公開(kāi)了一種由新鮮活牡蠣提取有效成分的方法；CN1132646A采用酶解工藝制備牡蠣成分；CN1486634A也公開(kāi)了一種牡蠣提取物及其制備方法。
海帶(Laminaria japonica)在我國(guó)產(chǎn)量極其豐富，其藥用價(jià)值在《本草綱目》、《神農(nóng)本草經(jīng)》和《食物本草》等傳統(tǒng)醫(yī)書(shū)中都已有記載。現(xiàn)代科學(xué)研究證明，海帶具有多方面的保健功能，如降血脂、降血糖、抗血栓、抗腫瘤、抗輻射等。海帶的多種生物功能大多與海帶中的生理活性多糖有關(guān)。目前，海帶多糖的提取主要是先提取粗多糖，然后再進(jìn)一步分離純化，再進(jìn)行活性檢測(cè)。這種方法不確定因素較多，而且分離過(guò)程中容易導(dǎo)致活性成分丟失，且提取分離的海帶多糖不一定具有抗氧化或抗腫瘤活性。中國(guó)專(zhuān)利CN201210017025.3提供了一種同時(shí)具有抗氧化和抗腫瘤活性的海帶多糖及其提取分離方法，經(jīng)試驗(yàn)證明，所得到的海帶多糖具有更好的抗氧化和抗腫瘤活性，為制備抗氧化或抗腫瘤藥物提供新的選擇。
海馬作為中藥材使用在我國(guó)已具有悠久的歷史，梁代陶弘景《本草經(jīng)集注》中對(duì)海馬已有記載“其性溫味甘，歸肝、腎經(jīng)，具有溫腎壯陽(yáng)，消腫散結(jié)、婦人催生等功效，能夠醫(yī)治呼吸系統(tǒng)失調(diào)、性功能障礙、失眠、體乏、咽喉腫痛、皮膚病以及難產(chǎn)等疾癥”時(shí)稱(chēng)“水馬”。
近年來(lái)，海洋放線菌逐漸成為藥物開(kāi)發(fā)的重要源泉，由于其生活在高鹽、高壓、低溫和低營(yíng)養(yǎng)的特殊環(huán)境中，能產(chǎn)生很多結(jié)構(gòu)獨(dú)特、作用新穎的化合物，具有陸地微生物無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。從海洋放線菌中分離到新活性化合物的數(shù)量逐年增多，包括了很多活性很高的細(xì)胞毒化合物，其中thiocoraline、salinosporamideA和ECO-4601已經(jīng)進(jìn)入臨床研究。因此，海洋放線菌作為一種細(xì)胞毒化合物的新來(lái)源，已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注。
鯊魚(yú)屬于軟骨魚(yú)綱(Chondrichthyes)、鯊形總目(Selachomorpha)，約250多種。在自然界中鯊魚(yú)是極少患惡性腫瘤的動(dòng)物之一，其發(fā)病率為百萬(wàn)分之一。美國(guó)科學(xué)家曾做過(guò)這樣的研究，將高劑量的強(qiáng)致癌物質(zhì)黃曲霉素B1注射到鯊魚(yú)體內(nèi)，不能誘發(fā)癌癥。
然而，目前未見(jiàn)牡蠣提取物、海帶提取物、海藻提取物、海蘿提取物、海馬酶解提取物、海參提取物、海綿提取物、鯊魚(yú)提取物與海洋放線菌發(fā)酵液聯(lián)合應(yīng)用的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提出一種海洋生物活性組合物，該組合物具有針對(duì)性強(qiáng)、療效好、毒副作用小，抗腫瘤效果好。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：
一種海洋生物活性組合物，由牡蠣提取物10～30份、海帶提取物2～6份、海藻提取物4～8份、海蘿提取物5～10份、海馬酶解提取物10～16份、海參提取物10～16份、海綿提取物4～8份、鯊魚(yú)提取物2～6份與海洋放線菌發(fā)酵液15～25份組成。
作為優(yōu)選，本發(fā)明的一些實(shí)施例中，海帶提取物為褐藻糖膠。
作為優(yōu)選，本發(fā)明的一些實(shí)施例中，海洋放線菌為海洋放線菌AFN1007，來(lái)自中國(guó)專(zhuān)利200810123930.0。
作為優(yōu)選，本發(fā)明的一些實(shí)施例中，海藻提取物為海藻多糖，海蘿提取物為甲醇提取物，鯊魚(yú)提取物為鯊魚(yú)肝臟與軟骨的提取物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種海洋生物活性組合物的藥用制劑，由上述的組合物與藥用載體、添加劑混合制成膠囊、顆粒劑、口服液、丸劑或沖劑。
本發(fā)明所述的牡蠣提取物采用已知公開(kāi)的方法制備，如中國(guó)專(zhuān)利(ZL94101124.0)公開(kāi)的牡蠣提取物及其制劑的制備方法制備：
(1)鮮活牡蠣去殼，水洗去雜；
(2)在1～5Kgf/cm3(公斤)的壓力(表壓)和40～110℃的溫度下用水提取，提取次數(shù)為1～3次，優(yōu)選2次，每次0.5～2小時(shí)，所用水為去離子水，牡蠣肉與水的重量比為1:1～3，優(yōu)選為1:2。
(3)過(guò)濾，去除殘?jiān)?/p>
(4)在真空中減壓濃縮；
(5)在噴霧干燥機(jī)中進(jìn)行噴霧干燥，即得本發(fā)明的牡蠣提取物。
海帶多糖為海帶中的主要成分，至今已發(fā)現(xiàn)海帶中有3種主要多糖，即褐藻膠(algin)、褐藻糖膠(fucoidan)和海帶淀粉(lami naran)。本發(fā)明中所述海帶提取物至少包含褐藻糖膠。
本發(fā)明海馬酶解提取物所用方法采用已知公開(kāi)的方法制備，如中國(guó)專(zhuān)利201510067879.6公開(kāi)一種海馬胰蛋白酶酶解液，將質(zhì)量比為100:5的海馬粉末和胰蛋白酶置于燒杯中，并向燒杯中加入pH＝8.0的PBS緩沖溶液獲得混合溶液，且海馬粉末與PBS緩沖溶液的質(zhì)量體積比為1:200，將混合溶液在50～60℃的條件下恒溫水浴酶解6～8h，然后將混合溶液在100℃的條件下水浴至少10min，之后對(duì)混合溶液進(jìn)行離心處理并取上清液，將上清液經(jīng)0.45μm的濾膜過(guò)濾，濾后的液體即為海馬胰蛋白酶酶解液(即是海馬酶解提取物)。
海蘿(Gloiopeltis furcata)，紅藻門(mén)內(nèi)枝藻科海蘿屬，為一年生紅藻。在我國(guó)將海蘿作為食用和藥用及用于紡織工業(yè)已有悠久的歷史。海蘿對(duì)人口腔瘤KB細(xì)胞和HT229細(xì)胞具有選擇性抑制活性。
鯊魚(yú)的骨骼系統(tǒng)為缺少血管的軟骨，占其體重的6％～8％。鯊魚(yú)軟骨是一種酸性粘多糖復(fù)合物，含蛋白質(zhì)、氨基葡聚糖、硫酸軟骨素等成分。其抗腫瘤成分主要是多糖和一些活性蛋白因子。鯊魚(yú)肝臟中的抗腫瘤活性物質(zhì)主要為角鯊烯，角鯊烯是一種抗腫瘤與治療心血管病的生物活性物質(zhì)。在體內(nèi)可由醋酸酯形成，參與膽固醇的生物合成，促進(jìn)生物氧化及機(jī)體的新陳代謝，同時(shí)還是萜類(lèi)和其它甾類(lèi)化合物的重要前體。
本發(fā)明的有益效果：
1、本發(fā)明中牡蠣提取物、海帶提取物、海藻提取物、海蘿提取物、海馬酶解提取物、海參提取物、海綿提取物、鯊魚(yú)提取物與海洋放線菌發(fā)酵液進(jìn)行配伍之后，可以顯著激活NK細(xì)胞的活性。NK細(xì)胞可以迅速自動(dòng)識(shí)別和溶解多種腫瘤或被感染細(xì)胞。因此，它可有效殺傷癌細(xì)胞并阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散，再則，由于NK細(xì)胞可自動(dòng)識(shí)別作用于癌細(xì)胞，它不需要抗體或事先與細(xì)胞作用，也無(wú)需依賴(lài)主要組織相容性復(fù)合體的識(shí)別。因而，對(duì)人體正常細(xì)胞沒(méi)有任何毒副作用。
2、海帶提取物單獨(dú)進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其實(shí)其抗腫瘤能力很弱，特別是已經(jīng)進(jìn)入癌癥中期的細(xì)胞更無(wú)任何效果。但是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)將牡蠣提取物、海帶提取物、海洋放線菌發(fā)酵液與海馬酶解提取物按照配合混合后，能夠有效抑制癌癥中期細(xì)胞的生長(zhǎng)，肝癌細(xì)胞QGY7703的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到了85％。在此基礎(chǔ)上面，再與余下組分配合使用，更能夠促進(jìn)將癌癥細(xì)胞的殺死。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種海洋生物活性組合物，由牡蠣提取物20份、褐藻糖膠4份、海藻多糖6份、海蘿提取物8份、海馬酶解提取物12份、海參提取物12份、海綿提取物5份、鯊魚(yú)提取物3份與20份海洋放線菌發(fā)酵液AFN1007組成。
實(shí)施例2
一種海洋生物活性組合物，由牡蠣提取物10份、褐藻糖膠6份、海藻多糖4份、海蘿提取物10份、海馬酶解提取物10份、海參提取物16份、海綿提取物8份、鯊魚(yú)提取物2份與海洋放線菌發(fā)酵液15份組成。
實(shí)施例3
一種海洋生物活性組合物，由牡蠣提取物30份、褐藻糖膠2份、海藻多糖8份、海蘿提取物5份、海馬酶解提取物16份、海參提取物10份、海綿提取物4份、鯊魚(yú)提取物6份與海洋放線菌發(fā)酵液25份組成。
實(shí)施例4
本研究依衛(wèi)生部新藥審批的有關(guān)規(guī)定，對(duì)本發(fā)明的海洋生物活性組合物進(jìn)行了對(duì)小鼠肺癌模型的抑制作用試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)施例1～3、對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組5組。
1、受試藥物：
實(shí)施例1～3的海洋生物活性組合物，臨用前配置成水混懸液。
2、動(dòng)物
2.1來(lái)源：C57小鼠，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖廠提供，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第01-3004。
2.2體重：18～20克。
2.3性別：雌雄各半。
2.4各組動(dòng)物數(shù)：每組10只。
2.5飼養(yǎng)條件：飼料由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物繁殖廠提供，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，每籠5只，雌雄分開(kāi)。動(dòng)物室內(nèi)溫度控制在20～26℃，濕度為40～60％。
3、實(shí)驗(yàn)方法：
3.1腫瘤模型的建立：從北京藥物研究所引進(jìn)荷瘤(Lewis肺癌)小鼠，取其腫瘤組織，勻漿制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞為5×106/ml，每只小鼠右腑下接種0.2ml。
3.2實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)取移植瘤小鼠隨機(jī)分組，共分5組，每組10只雌雄各半，分別為對(duì)照組(荷瘤對(duì)照)、陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺腹腔注射)、實(shí)施例1～3組。
3.3給藥方法：對(duì)照組從接種腫瘤第二天起灌胃給予生理鹽水0.2ml/10g、陽(yáng)性對(duì)照組一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺(1ml/kg)、各實(shí)驗(yàn)組灌胃給予不同濃度組合物0.2ml/10g，連續(xù)給藥12天。
3.4抑瘤觀察：停止給藥第二天，殺小鼠解剖取瘤稱(chēng)重，按下列公式計(jì)算抑瘤率：
腫瘤抑制率(％)＝(對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100％。
3.5NK細(xì)胞活性觀察：用乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)各動(dòng)物NK細(xì)胞活性，效應(yīng)細(xì)胞為各組小鼠脾細(xì)胞，靶細(xì)胞為YAC-細(xì)胞，效靶比例為50∶1，每組細(xì)胞做三復(fù)孔，分別設(shè)靶細(xì)胞自然釋放孔(Ks)，最大釋放孔(Km)，實(shí)驗(yàn)孔(E)。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm處，檢測(cè)各孔光密度值(OD)，按下式計(jì)算NK活性：
NK活性(％)＝(E-KS/Km-Ks)*100％。
3.6淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率觀察：用MTT法無(wú)菌取各組動(dòng)物脾臟制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×107/ml，取96孔培養(yǎng)板，每組細(xì)胞做六復(fù)孔(0.2ml/孔)，其中三孔加ConA(終濃度5mg/ml)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)68小時(shí)，取出，1000rpm，離心10min，每孔小心取出上清液100μl棄去，每孔加入MTT液(5mg/ml)10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入酸性異丙醇，震蕩混勻，用酶標(biāo)儀在570nm處，讀取各孔光密度值(OD)，按下式計(jì)算淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)：
SI＝ConA刺激孔OD均值/細(xì)胞對(duì)照孔OD均值。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1
表1海洋生物活性組合物對(duì)小鼠Lewis肺癌的抗腫瘤作用
*P<0.05
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明藥物可顯著激活NK細(xì)胞活性，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，有明顯抗腫瘤作用。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。