本發(fā)明涉及一種cdk4/6抑制劑與雌激素受體拮抗劑聯(lián)合在制備治療乳腺癌的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高，頗具侵襲性，但病程進(jìn)展緩慢，中國(guó)人口協(xié)會(huì)2010年2月1日在北京發(fā)布了《中國(guó)乳腺疾病調(diào)查報(bào)告》，報(bào)告顯示，我國(guó)城市地區(qū)乳腺癌的死亡率增長(zhǎng)了38.91％，乳腺癌已經(jīng)成為對(duì)婦女健康威脅最大的疾病，目前在研和上市的乳腺癌藥物至少有156種，其中68％為靶向治療藥物。大量研究發(fā)現(xiàn)腫瘤與細(xì)胞周期異常相關(guān)，腫瘤細(xì)胞中有絲分裂信號(hào)蛋白的大量突變和抗有絲分裂信號(hào)蛋白缺陷導(dǎo)致增殖紊亂；同時(shí)大部分腫瘤都存在基因組不穩(wěn)定性(gin)和染色體組不穩(wěn)定性(cin)，這三種基本的細(xì)胞周期缺陷都直接或間接由cdks的失控引起。周期素依賴性蛋白激酶(cdk，cyclindependentkinase)抑制劑日益成為熱門靶標(biāo)。

目前開(kāi)發(fā)的一代二代cdk抑制劑很多，最受關(guān)注的二代藥物包括pfizer公司和onyx公司共同開(kāi)發(fā)的cdk4/6抑制劑pd-0332991，其通過(guò)抑制cdk4/6的活性，抑制rb的磷酸化，使e2f-rb復(fù)合物留滯在胞漿中，阻斷細(xì)胞周期的啟動(dòng)。臨床試驗(yàn)結(jié)果(nct00721409)顯示，來(lái)曲唑單藥治療的患者的無(wú)進(jìn)展存活期(progression-freesurvival,pfs)為7.5月，而來(lái)曲唑和pd-0332991藥物聯(lián)用治療的患者其無(wú)進(jìn)展存活期則延長(zhǎng)至26.1月，這一顯著優(yōu)勢(shì)獲得了廣泛關(guān)注。對(duì)于在先接受過(guò)內(nèi)分泌療法后疾病進(jìn)展的激素受體陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人，pd-0332991與氟維司群聯(lián)用相比于氟維司群?jiǎn)斡靡惭娱L(zhǎng)了其無(wú)進(jìn)展生存期(palbociclibinhormone-receptor–positiveadvancedbreastcancer.thenewenglandjournalofmedicine.july16,2015vol.373no.3.)

wo2014183520公開(kāi)了與pd-0332991結(jié)構(gòu)相似的一系列滿足式(i)通式的cdk4/6抑制劑，具有顯著的cdk4/6的抑制活性和高度選擇性，并預(yù)期這些化合物可能用于一系列腫瘤，并且可以與一系列現(xiàn)有的抗腫瘤劑聯(lián)合使用，其中包括如下所示的式a化合物，其化學(xué)名為6-乙酰基-8-環(huán)戊基-5-甲基-2-((5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮：

然而上述文獻(xiàn)并沒(méi)有具體公開(kāi)哪一個(gè)化合物與哪一種抗腫瘤劑聯(lián)用時(shí)可以取得較好的效果，更沒(méi)有預(yù)期一些特定的聯(lián)用方式可以取得協(xié)同作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)，化合物a或其可藥用鹽與雌激素受體拮抗劑聯(lián)合使用時(shí)取得了顯著的協(xié)同作用，從而完成了本發(fā)明。

本發(fā)明一方面提供了化合物a或其可藥用鹽與雌激素受體拮抗劑聯(lián)合在制備治療乳腺癌的藥物中的用途。所述的雌激素受體拮抗劑可以是他莫昔芬、氟維司群，優(yōu)選氟維司群。

其中所述的乳腺癌優(yōu)選為雌激素受體陽(yáng)性(er+)、和/或人表皮生長(zhǎng)因子受體2陰性(her2-)的乳腺癌；更優(yōu)選為上述表型的局部晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌。

在本發(fā)明中，化合物a在實(shí)際使用時(shí)，優(yōu)選其可藥用鹽的形式，可以是各種有機(jī)酸或者無(wú)機(jī)酸的加成鹽，其中特別優(yōu)選羥乙基磺酸鹽，其結(jié)構(gòu)如下所示：

更優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物a的羥乙基磺酸鹽以i型結(jié)晶的形式存在，使用cu-ka輻射，得到以2θ角度和晶面間距表示的x-射線粉末衍射圖譜，所述i型結(jié)晶具有如圖1所示的x-射線粉末衍射圖譜，其中在約4.17(21.17)，8.26(10.69)，9.04(9.77)，10.78(8.20)，12.38(7.14)，14.01(6.32)，18.50(4.79)，18.89(4.70)，20.69(4.29)，21.58(4.11)，23.87(3.73)和28.15(3.17)有特征峰。

所述的i晶型經(jīng)光照、高溫和高濕條件下測(cè)試，穩(wěn)定性良好，且溶解性、生物利用度優(yōu)于化合物a本身。

在本發(fā)明中，化合物a或其可藥用鹽的每日用量(以化合物a計(jì))范圍可以是0.1mg/kg～1000mg/kg，優(yōu)選0.5～10mg/kg，更優(yōu)選0.5～5mg/kg。對(duì)于成年人類，優(yōu)選以化合物a計(jì)，每日用量1mg～1000mg，優(yōu)選10～500mg，最優(yōu)選30至300mg。

在本發(fā)明中，對(duì)于成年人類，雌激素受體拮抗劑的每次用量為1～2000mg，優(yōu)選10～1000mg，更優(yōu)選100～1000mg。

本發(fā)明中所述的聯(lián)合使用，并不限定化合物a或其可藥用鹽與雌激素受體拮抗劑同時(shí)施用，也可以二者先后施用；另外，為了用藥方便，還可將化合物a與雌激素受體拮抗劑制成藥物組合物。

附圖說(shuō)明

圖1：顯示化合物a的羥乙基磺酸鹽的i晶型的xrd圖譜；

圖2：顯示化合物a的羥乙基磺酸鹽的i晶型的dsc圖譜圖；

圖3：pd-0332991、化合物a單用或與氟維司群合用對(duì)人乳腺癌mcf-7裸小鼠皮下移植瘤的療效；

圖4：pd-0332991、化合物a單用或與氟維司群合用對(duì)荷瘤裸小鼠體重的影響；

圖5：pd-0332991、化合物a單用或與氟維司群合用對(duì)人乳腺癌mcf-7裸小鼠皮下移植瘤的療效(腫瘤照片)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例用于進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例并非限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)驗(yàn)所用的測(cè)試儀器

1、dsc譜

儀器型號(hào)：mettlertoledodsc1stareesystem

吹掃氣：氮?dú)?/p>

升溫速率：10.0℃/min

溫度范圍：40-400℃

2、x-射線衍射譜

儀器型號(hào)：brukerd8focusx-射線粉末衍射儀

射線：?jiǎn)紊玞u-kα射線(λ＝1.5406)

掃描方式：θ/2θ，掃描范圍：2-40°

電壓：40kv，電流：40ma

實(shí)施例1：6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-2-((5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮羥乙基磺酸鹽的制備

步驟1：6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-5',6'-二氫-[3,4'-聯(lián)吡啶]-1'(2'h)-甲酸叔丁酯的制備

氬氣保護(hù)下，將(10g，29.06mmol)2-氨基-6-(1-丁氧乙烯基)-8-環(huán)戊基-5-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮(按wo2014183520公開(kāi)方法制備)、碳酸銫(14.22g，43.75mmol)、pd2(dba)3(2.12g，2.31mmol)、4,5-雙二苯基膦-9,9-二甲基氧雜蒽(2.69g，4.69mmol)和125.00g二氧六環(huán)投入三口反應(yīng)瓶中，攪拌均勻后加熱至回流，緩慢滴加原料4-(6-氯吡啶-3-基)-5,6-二氫吡啶-1(2h)-羧酸叔丁酯(10.34g，35.00mmol,購(gòu)自鹽城市瑞康醫(yī)藥化工有限公司)和二氧六環(huán)(65.62g，0.74mol)的混合液(滴加時(shí)間約5h)。滴畢繼續(xù)回流攪拌反應(yīng)1～1.5h，tlc監(jiān)控原料2-氨基-6-(1-丁氧乙烯基)-8-環(huán)戊基-5-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮反應(yīng)完全(展開(kāi)劑：石油醚：乙酸乙酯＝2:1，原料rf＝0.6，產(chǎn)物rf＝0.7)，終止反應(yīng)。反應(yīng)液冷卻至室溫，過(guò)濾，濾餅用二氯甲烷17.19g×3洗滌。將濾液于65℃減壓濃縮干。殘留物加入137.50g二氯甲烷溶解，加入56.25g純化水，分液，水相再用68.75g二氯甲烷萃取。合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾餅用23.44g二氯甲烷洗，濾液于45℃減壓濃縮至油狀液體。加入150g丙酮溶解，室溫?cái)嚢杓s2h，冰水浴攪拌約3h。過(guò)濾，濾餅用冷丙酮25g×4洗滌，室溫減壓干燥8～10h，得固體約14.84g，收率：80～92％，hplc檢測(cè)純度不低于90％。esi/ms:[m+h]＝601.43。

步驟2：4-(6-((6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的制備

將6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-5',6'-二氫-[3,4'-聯(lián)吡啶]-1'(2'h)-甲酸叔丁酯(14.84g，24.69mmol)和75g乙酸投入三口反應(yīng)瓶中，通氬氣保護(hù)。加入10％pd/c(5g)，氫氣置換三次，攪拌下于50～60℃常壓加氫反應(yīng)30～32h。hplc法監(jiān)測(cè)中間態(tài)剩余量(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-5',6'-二氫-[3,4'-聯(lián)吡啶]-1'(2'h)-甲酸叔丁酯脫掉正丁基保護(hù)但雙鍵未被還原的中間體)＜0.3％，終止反應(yīng)。反應(yīng)液冷卻至室溫，體系氬氣置換后過(guò)濾，濾餅用37.50g二氯甲烷洗滌。將濾液于65℃減壓濃縮至干。殘留物氬氣保護(hù)用50g無(wú)水乙醇回流打漿0.5h，攪拌下自然冷卻至室溫，冰浴攪拌約4h。過(guò)濾，濾餅用冷無(wú)水乙醇12.50g×2洗滌。所得濕品加入二氯甲烷31.25g攪拌，過(guò)濾不溶物，濾液攪拌下緩慢加入異丙醇118.75g，冰浴攪拌約3h，過(guò)濾后減壓干燥8～10h得固體約8.75g，產(chǎn)率：60～72％，hplc檢測(cè)純度不低于98％。esi/ms:[m+h]＝547.26。

步驟3：6-乙酰基-8-環(huán)戊基-5-甲基-2-((5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮羥乙基磺酸鹽的制備

將4-(6-((6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氫吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(8.75g，15.94mmol)和56.25g無(wú)水甲醇投入三口反應(yīng)瓶中，攪拌均勻。將80％羥乙基磺酸(8.81g，55.94mmol)和水0.94g溶于13.75g無(wú)水甲醇中，滴加到上述溶液中，溶液變澄清。滴畢加熱回流攪拌反應(yīng)3～3.5h，tlc檢測(cè)原料反應(yīng)完全(石油醚：乙酸乙酯＝1:1，原料rf＝0.3，產(chǎn)物rf＝0)，終止反應(yīng)，趁熱過(guò)濾。濾液攪拌下滴加三乙胺(4.00g，39.38mmol)，滴畢繼續(xù)攪拌約1h，冰浴攪拌約3h。過(guò)濾，濾餅用冷無(wú)水甲醇7.19g×2洗滌，40℃減壓干燥6～8h得固體約7.97g，收率：82～93％，hplc檢測(cè)純度不低于98％。tof-ms:[m+h]＝447.2503(6-乙?；?8-環(huán)戊基-5-甲基-2-((5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮結(jié)合一個(gè)氫離子的離子峰)。該結(jié)晶樣品的x-射線衍射譜圖見(jiàn)圖1。該結(jié)晶在約4.17(21.17)，8.26(10.69)，9.04(9.77)，10.78(8.20)，12.38(7.14)，14.01(6.32)，18.50(4.79)，18.89(4.70)，20.69(4.29)，21.58(4.11)，23.87(3.73)和28.15(3.17)處有特征峰。dsc譜圖見(jiàn)圖2，在324℃附近有熔融吸熱峰，將此晶型定義為i晶型。經(jīng)光照、高溫和高濕條件下測(cè)試，該晶型的穩(wěn)定性良好。

實(shí)施例2：化合物a和pd-0332991單用或與氟維司群合用對(duì)人乳腺癌mcf-7裸小鼠皮下移植瘤的療效。

1受試藥物

藥物名稱：pd-0332991的羥乙基磺酸鹽為黃色結(jié)晶性粉末，根據(jù)cn1835951b公開(kāi)的方法制備；化合物a的羥乙基磺酸鹽為白色粉末，由實(shí)施例1制備得到；氟維司群為白色粉末，由上海恒瑞醫(yī)藥有限公司提供。

配制方法：化合物a的羥乙基磺酸鹽用50mm檸檬酸+0.5％cmc+0.5％tween80配制；pd-0332991的羥乙基磺酸鹽用含0.1％tween80的蒸餾水配制并稀釋；氟維司群用市售大豆油配制。

2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

balb/ca-nude裸小鼠，6-7周，♀，購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司。生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk(滬)2013-0018；動(dòng)物合格證號(hào)2013001812696。飼養(yǎng)環(huán)境：spf級(jí)。

3實(shí)驗(yàn)步驟

裸小鼠皮下埋植雌激素緩釋片(0.72mg/片,60天釋放，innovativeresearchofamerica)，第二天接種人乳腺癌mcf-7細(xì)胞，待腫瘤生長(zhǎng)至100-200mm³后，將動(dòng)物隨機(jī)分組(d0)。給藥劑量和給藥方案見(jiàn)表1。每周測(cè)2-3次瘤體積，稱鼠重，記錄數(shù)據(jù)。腫瘤體積(v)計(jì)算公式為：

v＝1/2×a×b²其中a、b分別表示長(zhǎng)、寬。

t/c(％)＝(t-t0)/(c-c0)×100其中t、c為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘤體積；t0、c0為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的腫瘤體積。

4試驗(yàn)結(jié)果

化合物a(75mg/kg,po,qd16)顯著抑制表達(dá)雌激素受體人乳腺癌mcf-7裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率為130％，有8/8腫瘤部分消退；參比藥物pd-0332991相同劑量和方案對(duì)mcf-7的抑瘤率為124％，有7/8腫瘤部分消退；氟維司群(1mg/只，單次皮下注射)對(duì)mcf-7的抑瘤率為25％；化合物a、pd-0332991與氟維司群合用抑瘤率均明顯提高，分別從單用化合物a、pd-0332991時(shí)的130％和124％提高到148％和143％(p<0.05,與單用化合物a或pd-0332991比較)。荷瘤小鼠對(duì)以上藥物均能很好耐受，沒(méi)有明顯體重減輕等癥狀發(fā)生。相比較，無(wú)論是單用還是對(duì)氟維司群的增效作用，化合物a和pd-0332991對(duì)mcf-7的療效相當(dāng)。