本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域,涉及生物標志物作為靶標在肺腺癌診治中的應(yīng)用,具體的所述生物標志物為CLINT1。
背景技術(shù):
肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的腫瘤之一,嚴重危害人類健康。肺癌可以分為非小細胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)。其中NSCLC約占肺癌總數(shù)的80%-85%,其病情發(fā)展迅速,轉(zhuǎn)移速度快,復(fù)發(fā)率較高。大部分病人發(fā)現(xiàn)時已發(fā)展至中晚期,預(yù)后差,5年生存率不足15%。早期接受治療的NSCLC患者復(fù)發(fā)率達40%,且70%以上患者被發(fā)現(xiàn)時已是局部侵犯或遠隔轉(zhuǎn)移而無法手術(shù)。
目前,外科手術(shù)、化療、放療仍是肺癌的主要治療方式。近年,隨著多學(xué)科綜合治療(multidisciplinary team,MDT)的發(fā)展,肺癌的治療取得了長足的進步。然而,肺癌5年生存率仍徘徊在15%左右。精準醫(yī)學(xué)模式是當(dāng)今腫瘤治療的趨勢和方向,其關(guān)鍵是利用有效的生物標志物,進行特異性個體化治療。因此,尋找肺癌新的有效分子標志物以及潛在治療靶點就顯得尤為重要。
隨著人類基因組計劃的完成,對肺癌在基因水平有了全新的認識??梢哉J為,在分子基因水平肺鱗癌和肺腺癌是“兩種疾病”?,F(xiàn)有資料也提示在肺腺癌中可能更易發(fā)現(xiàn)生物標志物,并可能從中獲益。
精準醫(yī)學(xué)模式的倡導(dǎo)為肺癌的診治打開了嶄新的思路。精準醫(yī)學(xué)是基于分子生物信息學(xué)的醫(yī)學(xué)模式,其關(guān)鍵是利用有效的生物標志物,區(qū)分目標人群,從而進行特異性個體化治療。因此,尋找肺癌新的有效的分子生物標志物和信號通路,進一步闡明肺癌的發(fā)生發(fā)展機制,為肺癌的個體化精準治療提供新的理論依據(jù)成為當(dāng)今的研究熱點和方向。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明的目的在于提供一種與肺腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生物標志物。
為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
本發(fā)明提供了一種CLINT1基因的用途,用于制備預(yù)防或治療肺腺癌的藥物組合物。
進一步,所述藥物組合物包括CLINT1的下調(diào)劑。所述下調(diào)劑選自:以CLINT1或其轉(zhuǎn)錄本為靶序列、且能夠抑制CLINT1基因表達或基因轉(zhuǎn)錄的干擾分子,包括:shRNA(小發(fā)夾RNA)、小干擾RNA(SiRNA)、dsRNA、微小RNA、反義核酸,或能表達或形成所述shRNA、小干擾RNA、dsRNA、微小RNA、反義核酸的構(gòu)建物;或特異性與CLINT1編碼的蛋白結(jié)合的結(jié)合分子(如能夠抑制CLINT1蛋白活性的抗體或配體)。
進一步,所述的下調(diào)劑選自下組序列的siRNA:SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9。
本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療肺腺癌的CLINT1的下調(diào)劑,所述下調(diào)劑選自:
核酸抑制物,蛋白抑制劑,蛋白水解酶,蛋白結(jié)合分子,其能夠在蛋白或基因水平上下調(diào)CLINT1基因或其編碼的蛋白的表達或活性。
在本發(fā)明中,所述CLINT1的下調(diào)劑還可用于抑制肺腺癌細胞的侵襲和增殖。
本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療肺腺癌的藥物組合物,所述藥物組合物含有:
上面所述的CLINT1的下調(diào)劑;和
藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明提供了一種CLINT1基因的用途,用于篩選預(yù)防或治療肺腺癌的潛在物質(zhì)。
本發(fā)明提供了一種篩選預(yù)防或治療肺腺癌的潛在物質(zhì)的方法,所述方法包括:
用候選物質(zhì)處理表達或含有CLINT1基因或其編碼的蛋白的體系;和
檢測所述體系中CLINT1基因或其編碼的蛋白的表達或活性;
其中,若所述候選物質(zhì)可降低CLINT1基因的表達或活性,(優(yōu)選顯著降低,如低20%以上,較佳的低50%以上;更佳的低80%以上),則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療肺腺癌的潛在物質(zhì)。所述體系選自:細胞體系、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。
所述候選物質(zhì)包括但不限于:針對CLINT1基因或其編碼的蛋白或其上游或下游基因或蛋白設(shè)計的干擾分子、核酸抑制物、結(jié)合分子(如抗體或配體)、小分子化合物等。
在本發(fā)明中,所述的方法還包括:對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗,以從候選物質(zhì)中進一步選擇和確定對于預(yù)防、緩解或治療肺腺癌有用的物質(zhì)。
本發(fā)明提供了一種CLINT1基因的用途,用于制備診斷肺腺癌的產(chǎn)品。其中,所述產(chǎn)品包括(但不限于)芯片、制劑或試劑盒。
進一步,所述產(chǎn)品包括檢測CLINT1基因表達的試劑。
進一步,所述試劑選自:
特異性識別CLINT1的探針;或
特異性擴增CLINT1的引物;或
特異性結(jié)合CLINT1編碼的蛋白的抗體或配體。
較佳的,所述的特異性擴增CLINT1基因的引物是引物對,序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
附圖說明
圖1是利用QPCR檢測CLINT1基因在肺腺癌組織中的表達情況圖;
圖2是利用QPCR檢測CLINT1在肺腺癌細胞中的轉(zhuǎn)染情況圖;
圖3是用CCK-8法檢測CLINT1基因?qū)Ψ蜗侔┘毎鲋车挠绊憟D;
圖4是用流式細胞儀檢測CLINT1基因?qū)Ψ蜗侔┘毎蛲龅挠绊憟D;
圖5是利用Transwell小室檢測CLINT1對肺腺癌細胞遷移和侵襲的影響圖;其中圖A是CLINT1對肺腺癌細胞遷移的影響圖;圖B是CLINT1對肺腺癌細胞侵襲的影響圖。
具體的實施方式
本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究,通過高通量方法,采用目前覆蓋數(shù)據(jù)庫最廣的基因芯片,檢測肺腺癌標本中基因在腫瘤組織和癌旁組織的表達,發(fā)現(xiàn)其中具有明顯表達差異的基因片段,探討其與肺腺癌的發(fā)生之間的關(guān)系,從而為肺腺癌的早期檢測及靶向治療尋找更好的途徑和方法。通過篩選,本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了肺腺癌中CLINT1顯著性上調(diào)。實驗證明,通過降低CLINT1的表達水平,能夠有效地抑制肺腺癌細胞的生長和侵襲,提示檢測CLINT1基因的表達水平可成為肺腺癌早期診斷的輔助診斷指標之一,干擾CLINT1基因表達可成為預(yù)防或治療肺腺癌或肺腺癌轉(zhuǎn)移的新途徑。
CLINT1基因
CLINT1是位于人5號染色體長臂3區(qū)3帶上,一種代表性的人CLINT1基因的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明中的CLINT1包括野生型、突變型或其片段。
本發(fā)明的人CLINT1核苷酸全長序列或其片段通??梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法,可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列,并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板,擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時,常常需要進行兩次或多次PCR擴增,然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到,本發(fā)明的實用性并不局限于對本發(fā)明的靶標基因的任何特定變體的基因表達進行定量。如果當(dāng)核酸或其片段與其它核酸(或其互補鏈)最佳比對時(具有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔?,在至少大約60%的核苷酸堿基、通常至少大約70%、更通常至少大約80%、優(yōu)選至少大約90%、及更優(yōu)選至少大約95-98%核苷酸堿基中存在核苷酸序列相同性,則這兩個序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。
或者,當(dāng)核酸或其片段與另一核酸(或其互補鏈)、一條鏈或其互補序列在選擇性雜交條件下雜交時,則其間存在基本同源或(相同性)。當(dāng)雜交比特異性整體喪失發(fā)生更具選擇性時,存在雜交選擇性。典型地,當(dāng)在至少大約14個核苷酸的一段序列存在至少大約55%相同性、優(yōu)選至少大約65%、更優(yōu)選至少大約75%及最優(yōu)選至少大約90%相同性時,發(fā)生選擇性雜交。如本文所述,同源對比的長度可以是較長的序列節(jié)段,在某些實施方案中通常為至少大約20個核苷酸,更通常為至少大約24個核苷酸,典型為至少大約28個核苷酸,更典型為至少大約32個核苷酸,及優(yōu)選至少大約36或更多個核苷酸。
因此,本發(fā)明的多核苷酸與SEQ ID NO.1優(yōu)選具有至少75%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%同源性。更優(yōu)選地,存在至少95%、更優(yōu)選至少98%同源性。
本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測定基因表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,測定基因表達的手段不是本發(fā)明的重要方面??梢栽谵D(zhuǎn)錄水平上檢測生物標志物的表達水平。
下調(diào)劑和藥物組合物
基于本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn),本發(fā)明提供了一種CLINT1的下調(diào)劑的用途,用于制備抑制肺腺癌的藥物組合物。如本文所用,所述的CLINT1的下調(diào)劑包括但不限于抑制劑、拮抗劑、阻滯劑、阻斷劑、核酸抑制物等。
所述的CLINT1基因或蛋白的下調(diào)劑是指任何可降低CLINT1蛋白的活性、降低CLINT1基因或蛋白的穩(wěn)定性、下調(diào)CLINT1蛋白的表達、減少CLINT1蛋白有效作用時間、或抑制CLINT1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì),這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明,作為對于下調(diào)CLINT1有用的物質(zhì),從而可用于預(yù)防或治療肺腺癌。例如,所述的抑制劑是:核酸抑制物,蛋白抑制劑,抗體,配體,蛋白水解酶,蛋白結(jié)合分子,只要其能夠在蛋白或基因水平上下調(diào)CLINT1蛋白或其編碼基因的表達。
作為本發(fā)明的一種選擇方式,所述的CLINT1的下調(diào)劑是一種特異性與CLINT1結(jié)合的抗體。所述的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體??捎肅LINT1蛋白免疫動物,如家兔,小鼠,大鼠等來生產(chǎn)多克隆抗體;多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng),包括但不限于弗氏佐劑等。與之相似的,表達CLINT1或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。所述的抗體也可以是單克隆抗體,此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。抗體的“特異性”是指抗體能結(jié)合于CLINT1基因產(chǎn)物或片段。較佳地,指那些能與CLINT1基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體,而且還包括具有免疫活性的抗體片段,如Fab’或(Fab)2片段;抗體重鏈;抗體輕鏈;遺傳工程改造的單鏈Fv分子;或嵌合抗體??笴LINT1蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中,檢測活檢標本中的CLINT1蛋白含量,還可以作為用于預(yù)防肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲的特異性治療劑。血樣或尿液中的CLINT1蛋白的直接測定可以作為腫瘤的輔助診斷和愈后的觀察指標,也可作為腫瘤早期診斷的依據(jù)。抗體可以通過ELISA、Western Blot印跡分析,或者與檢測基團偶聯(lián),通過化學(xué)發(fā)光、同位素示蹤等方法來檢測。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式,所述CLINT1的下調(diào)劑是一種CLINT1特異性的小干擾RNA分子。如本文所用,所述的“小干擾RNA”是指一種短片段雙鏈RNA分子,能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA,這個過程就是RNA干擾(RNA interference)過程。小干擾RNA可以制備成雙鏈核酸的形式,它含有一個正義鏈和一個反義鏈,這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個雙鏈RNA復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此,舉例來講,互補的正義鏈和反義鏈是化學(xué)合成的,其后可通過退火雜交,產(chǎn)生合成的雙鏈RNA復(fù)合物。
在篩選有效的siRNA序列時,本發(fā)明人通過大量的比對分析,從而找出最佳的有效片段。本發(fā)明人設(shè)計合成了多種siRNA序列,并將它們分別通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染肺腺癌細胞系進行驗證,選出干擾效果最佳的siRNA,它們分別具有SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示的序列,進一步地在細胞水平實驗,結(jié)果證明對于細胞試驗而言抑制效率非常高。
作為本發(fā)明的一種可選方式,所述的CLINT1的下調(diào)劑也可以是一種“小發(fā)夾RNA(Small hairpin RNA,shRNA)”,其是能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼小RNA分子,小發(fā)夾RNA能夠通過RNA干擾途徑來抑制基因的表達。如上述,shRNA可以由雙鏈DNA模板來表達。雙鏈DNA模板被插進一個載體,例如質(zhì)?;虿《据d體,然后在體外或體內(nèi)連接到一個啟動子進行表達。shRNA在真核細胞內(nèi)DICER酶的作用下,可被切割成小干擾RNA分子,從而進入RNAi途徑?!皊hRNA表達載體”是指一些本領(lǐng)域常規(guī)用于構(gòu)建shRNA結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒,通常該質(zhì)粒上存在“間隔序列”以及位于“間隔序列”兩邊的多克隆位點或供替換序列,從而人們可以將shRNA(或類似物)相應(yīng)的DNA序列通過正向和反向的方式插入多克隆位點或替換其上的供替換序列,該DNA序列轉(zhuǎn)錄后的RNA可形成shRNA(ShortHairpin)結(jié)構(gòu)。所述的“shRNA表達載體”目前已經(jīng)完全可以通過商購的途徑購買獲得,例如一些病毒載體。
本發(fā)明的核酸抑制物如siRNA可以化學(xué)合成,也可以通過一個重組核酸結(jié)構(gòu)里的表達盒轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA之后進行制備。siRNA等核酸抑制物,可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細胞內(nèi),或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細胞內(nèi)。
藥物組合物
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物,它含有有效量的所述的CLINT1的下調(diào)劑,以及藥學(xué)上可接受的載體。所述的組合物可用于抑制肺腺癌。任何前述的CLINT1的下調(diào)劑均可用于組合物的制備。
如本文所用,所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。下調(diào)劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于:所述的CLINT1基因的下調(diào)劑的藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等;患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。
所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體,包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體:它們本身并不是必要的活性成分,且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體,如水、鹽水、緩沖液。另外,這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì),如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細胞(宿主細胞)轉(zhuǎn)染試劑。
本發(fā)明可以采用用本領(lǐng)域熟知的多種方法來將所述的下調(diào)劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動物。包括但不限于:皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等;優(yōu)選的,所述給藥方式是非腸道給予的。
優(yōu)選的,可采用基因治療的手段進行。比如,可直接將CLINT1的下調(diào)劑通過諸如注射等方法給藥于受試者;或者,可通過一定的途徑將攜帶CLINT1的下調(diào)劑的表達單位(比如表達載體或病毒等,或siRNA或shRNA)遞送到靶點上,并使之表達活性的CLINT1下調(diào)劑,具體情況需視所述的下調(diào)劑的類型而定,這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
術(shù)語“宿主細胞”可以是原核細胞,如細菌細胞;或是低等真核細胞,如酵母細胞;或是高等真核細胞,如哺乳動物細胞。代表性例子有:大腸桿菌,鏈霉菌屬的細菌細胞;真菌細胞如酵母;植物細胞;果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞;CHO、COS、或293細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時,能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲,用CaCl2法處理,所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要,轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物,可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法:磷酸鈣共沉淀法,常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
本發(fā)明中的藥物組合物包括CLINT1的下調(diào)劑、和/或與所述下調(diào)劑配伍的其他藥類以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。
本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療肺腺癌的藥物聯(lián)用,其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥,甚至在同一組合物中同時給藥。
本發(fā)明的藥物組合物還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時給藥,而其它劑量可以單獨給藥。在治療過程中,可以根據(jù)癥狀的嚴重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答,調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。
藥物篩選
本發(fā)明提供了一種篩選預(yù)防或治療肺腺癌藥物的方法,即:
在實驗組中,向細胞培養(yǎng)體系中加入待測化合物,并測定CLINT1的表達水平;在對照組中,向同樣的培養(yǎng)體系中不加入待測化合物,并測定CLINT1的表達水平;其中,如果實驗組中CLINT1的表達水平大于對照組,則說明該候選化合物為CLINT1的下調(diào)劑。
在本發(fā)明中,所述的方法還包括:對上面步驟獲得的候選化合物進一步測試其抑制肺腺癌的效果,若測試化合物對肺腺癌有顯著的抑制效果,則說明該化合物為預(yù)防或治療肺腺癌的潛在物質(zhì)。
芯片、試劑盒
本發(fā)明的所述的基因芯片包括:固相載體;以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針,所述的寡核苷酸探針特異性地對應(yīng)于CLINT1所示的部分或全部序列。
具體地,可根據(jù)本發(fā)明所述的基因,設(shè)計出適合的探針,固定在固相載體上,形成“寡核苷酸陣列”。所述的“寡核苷酸陣列”是指具有可尋址位置(即以區(qū)別性的,可訪問的地址為特征的位置)的陣列,每個可尋址位置均含有一個與其相連的特征性寡核苷酸。根據(jù)需要,可將寡核苷酸陣列分成多個亞陣。
術(shù)語“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出,術(shù)語“探針”通常指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴格性,探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標記,其范圍包括引物。雜交方式,包括,但不限于:溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。
本發(fā)明中針對CLINT1基因的寡核苷酸探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制,只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合,任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣,所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長,甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響,所述探針的長度通常至少是14個堿基對,最長一般不超過30個堿基對,與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序列最好少于4個堿基對,以免影響雜交效率。
本發(fā)明中所述固相載體可采用基因芯片領(lǐng)域的各種常用材料,例如包括但不限于塑料制品、微顆粒、膜載體等。所述塑料制品可通過非共價或物理吸附機制與抗體或蛋白抗原相結(jié)合,最常用的塑料制品為聚苯乙烯制成的小試管、小珠和微量反應(yīng)板;所述微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒,其直徑多為微米,由于帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的功能團,易與抗體(抗原)形成化學(xué)偶聯(lián),結(jié)合容量大;所述膜載體包括硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜及尼龍膜等微孔濾膜。
所述的CLINT1芯片的制備可采用本領(lǐng)域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法。例如,如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片,探針的5’端含有氨基修飾的聚dT串,可將寡核苷酸探針配制成溶液,然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或硅片上,排列成預(yù)定的序列或陣列,然后通過放置過夜來固定,就可得到本發(fā)明的基因芯片。
本發(fā)明提供了一種試劑盒,所述試劑盒可用于檢測CLINT1基因或蛋白的表達。優(yōu)選的,所述的制劑或試劑盒中還含有用于標記RNA樣品的標記物,以及與所述標記物相對應(yīng)的底物。此外,所述的試劑盒中還可包括用于提取RNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑,包括但不限于:抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液等。此外,所述的試劑盒中還包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。
試劑盒的組分可以以水介質(zhì)的形式或以凍干的形式來包裝。試劑盒中適當(dāng)?shù)娜萜魍ǔV辽侔ㄒ环N小瓶、試管、長頸瓶、寶特瓶、針筒或其它容器,其中可放置一種組分,并且優(yōu)選地,可進行適當(dāng)?shù)氐确帧T谠噭┖兄写嬖诙嘤谝环N的組分時,試劑盒中通常也將包含第二、第三或其它附加的容器,其中分離地放置附加的組分。然而,不同組合的組分可被包含在一個小瓶中。本發(fā)明的試劑盒通常也將包括一種用于容納反應(yīng)物的容器,密封以用于商業(yè)銷售。這種容器可包括注模或吹模的塑料容器,其中可保留所需的小瓶。
本發(fā)明中,術(shù)語“樣本”以其最廣泛的含義使用。在一種含義中,意在包括從任何來源獲得的標本或培養(yǎng)物,以及生物和環(huán)境樣本。生物樣本可獲自動物(包括人)并涵蓋液體、固體、組織和氣體。生物樣本包括血液制品,諸如血漿、血清等。然而,此類樣本不應(yīng)解釋為限制適用于本發(fā)明的樣本類型。
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件,例如Sambrook等人,分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:ColdSpring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1篩選與肺腺癌相關(guān)的基因標志物
1、樣品收集
各收集8例肺腺癌癌旁組織和肺腺癌組織樣本。肺腺癌腫瘤組織標本取材部位為主要腫瘤區(qū)域,位于腫瘤腫塊中外1/3與正常組織交接處,排除腫瘤中心明顯壞死、鈣化部分以及腫瘤外圍正常肺組織;癌旁正常肺組織標本取自腫瘤邊緣5cm以上的部位,肉眼觀察無明顯變化。上述所有標本的取得均通過組織倫理委員會的同意。
2、RNA樣品的制備(利用E.Z.N.A.miRNA kit進行操作)
在研缽中導(dǎo)入液氮,取上述獲得的組織放入研缽中,在液氮中剪碎并研磨成粉末,剪碎后投入液氮中并研磨至粉末狀,隨后轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器中;組織勻漿在玻璃勻漿器中加入Trizol試劑,在冰上研磨組織。將勻漿后組織勻漿液轉(zhuǎn)入無RNA酶的EP管中,室溫下靜置5min。按照試劑盒中的說明書提取分離RNA。具體如下:
1)RNA的分離:
在EP管中加入0.2m1氯仿,蓋緊EP管蓋,手動劇烈振蕩15s,使其充分混勻。室溫下孵化5min。然后在4℃下以14000g離心15min。離心后樣品分為三層,RNA存在于上層水相中。
2)RNA沉淀
將分離得的水相取450μl移至新的無RNA酶的EP管中,按照1:1的比例加入450μl異丙醇,上下顛倒混勻后在室溫下孵化10min,4℃14000g離心10min。
3)RNA洗脫
離心后小心移去上清,加入1ml 75%乙醇(滅酶處理,現(xiàn)用現(xiàn)配并在冰上預(yù)冷)沖洗RNA,隨后4℃7500g離心5min。
4)RNA再溶解
小心移去洗滌之后的上清,在超凈工作臺中打開EP管管蓋,在室溫下放置RNA樣本5-10min,晾干。加入無RNA酶處理水20-50μl,55-60℃水浴箱中水浴10min。
5)RNA樣品的質(zhì)量分析
分光光度計檢測:
NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品,RNA-seq測序的樣品要求:OD260/OD280為1.8-2.2。
瓊脂糖凝膠電泳檢測:
將上述提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳,Agilent Technologies 2100Bioanalyzer檢測RNA樣品質(zhì)量,觀察28S rRNA和18S rRNA主帶明顯、無降解、RNA完整性指數(shù)合格、濃度達到要求,可以用于芯片的基因表達譜及篩選實驗。
3、逆轉(zhuǎn)錄和標記
用Low RNA Input Linear Amplification Kit將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,同時用Cy3分別標記實驗組和對照組。
4、雜交
基因芯片采用Aglient公司的人全基因組表達譜芯片。按芯片使用說明書的步驟進行。
5、數(shù)據(jù)分析
利用Agilent GeneSpring軟件對芯片結(jié)果進行分析,篩選表達量具有顯著性差異(標準為該基因在癌與癌旁的表達量相差2倍以上,而且p<0.05)的基因。
6、結(jié)果
結(jié)果顯示,CLINT1在肺腺癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織中的表達量。
實施例2QPCR測序驗證CLINT1基因的差異表達
1、對CLINT1基因差異表達進行大樣本QPCR驗證。按照實施例1中的樣本收集方式選擇肺腺癌癌旁組織和肺腺癌組織各50例。
2、RNA提取步驟如實施例1所述。
3、逆轉(zhuǎn)錄
1)反應(yīng)體系:
RNA模板 1μl,隨機引物1μl,雙蒸水加至12μl,混勻,低轉(zhuǎn)速離心,65℃5min,然后放在冰上冷卻。
繼續(xù)在12μl反應(yīng)液中加入下列成分:
5×反應(yīng)緩沖液4μl,RNA酶抑制劑(20U/μl)1μl,10mM dNTP混合液 2μl,AMV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl)1μl;充分混勻并進行離心處理;
2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件
25℃5min,42℃60min,70℃5min。
3)聚合酶鏈反應(yīng)
引物設(shè)計:
根據(jù)Genebank中CLINT1基因和GAPDH基因的編碼序列設(shè)計QPCR擴增引物,由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下:
CLINT1基因:
正向引物為5’-TCTATGATGAGCACTAAC-3’(SEQ ID NO.3);
反向引物為5’-GGACCATATCTGTATTCT-3’(SEQ ID NO.4)。
GAPDH基因:
正向引物為5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.5);
反向引物為5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.6)。
配制PCR反應(yīng)體系:
2×qPCR混合液 12.5μl,基因引物2.0μl,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5μl,ddH2O 8.0μl。
PCR反應(yīng)條件:95℃10min,(95℃15s,60℃60s)×40個循環(huán),60℃5min延伸反應(yīng)。75℃至95℃,每20s升溫1℃,繪制溶解曲線。以SYBR Green作為熒光標記物,在Light Cycler熒光定量PCR儀上進行PCR反應(yīng),通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶,ΔΔCT法進行相對定量。
5、統(tǒng)計學(xué)方法
實驗都是按照重復(fù)3次來完成的,結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示,采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的,癌與癌旁組織的配對比較采用t檢驗,認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。
6、結(jié)果
結(jié)果如圖1所示,與肺腺癌癌旁組織相比,CLINT1在肺腺癌組織中表達上調(diào),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),同芯片檢測結(jié)果一致。
實施例3CLINT1基因的沉默
1、細胞培養(yǎng)
人肺腺癌細胞株A549,以含10%胎牛血清和1%P/S的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、相對濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次,使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。
將培養(yǎng)瓶中的細胞用胰酶進行消化并接種在6孔板中,保證細胞數(shù)為2-8×105個/孔,加入細胞培養(yǎng)基。過夜,第二天觀察細胞密度,細胞密度為70%以上可進行轉(zhuǎn)染。
2、siRNA的設(shè)計
陰性對照siRNA序列(siRNA-NC):
正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.7)
反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.8)
siRNA-1:
正義鏈為5’-UUAUCACUGAAUGGAAAAGCA-3’(SEQ ID NO.9)
反義鏈為5’-CUUUUCCAUUCAGUGAUAAAU-3’(SEQ ID NO.10)
siRNA-2:
正義鏈為5’-UCCAAUUCUUUUUGUUGUCUU-3’(SEQ ID NO.11)
反義鏈為5’-GACAACAAAAAGAAUUGGAGA-3’(SEQ ID NO.12)
siRNA-3:
正義鏈為5’-AUACUUGUCUUUGUUCUUCUU-3’(SEQ ID NO.13)
反義鏈為5’-GAAGAACAAAGACAAGUAUGU-3’(SEQ ID NO.14)
3、轉(zhuǎn)染
將實驗分為三組:對照組(A549)、陰性對照組(siRNA-NC)和實驗組(siRNA1、siRNA2、siRNA-3),其中陰性對照組siRNA與CLINT1基因的序列無同源性,濃度為20nM/孔,同時分別進行轉(zhuǎn)染。
4、QPCR檢測CLINT1基因的轉(zhuǎn)錄水平
4.1細胞總RNA的提取
1)將6孔板中的細胞培養(yǎng)液倒掉,用PBS沖洗兩次,各孔加入1ml Trizol試劑,室溫放置5min。
2)加入0.2m1氯仿,劇烈震蕩15s,4℃,12000g離心15min。
3)水相轉(zhuǎn)移到新管中,加入4.5m1異丙醇,室溫放置10min;4℃,10000g離心10min。
4)倒掉液體,用l ml的75%乙醇洗EP管壁。4℃,7500g,離心5min。
5)倒掉清洗后的75%乙醇,室溫晾置5-10min。
6)加入25μl無RNA酶的DEPC水,-70℃保存。
4.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實施例2。
4.3QPCR擴增步驟同實施例2。
5、統(tǒng)計學(xué)方法
實驗都是按照重復(fù)3次來完成的,結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示,采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的,CLINT1基因?qū)嶒灲M與對照組之間的差異采用t檢驗,認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。
6、結(jié)果
結(jié)果如圖2顯示,與非轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比,實驗組中的CLINT1的表達水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
實施例4CLINT1基因?qū)Ψ蜗侔┘毎鲋车挠绊?/p>
采用CCK-8實驗檢測CLINT1基因?qū)Ψ蜗侔┘毎鲋衬芰τ绊憽?/p>
1、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟同實施例3,轉(zhuǎn)染后6h換液,放置細胞培養(yǎng)箱過夜。
2、第二天將細胞取出,顯微鏡下觀察細胞生長情況,1ml/孔加入含EDTA的胰酶,進行細胞消化,待消化完成后去除胰酶,加入細胞培養(yǎng)基混勻使細胞懸浮,然后進行細胞計數(shù)。
3、將細胞懸液濃度稀釋為15000個/ml,之后往96孔板中進行接種,每孔加入細胞懸液200μl,細胞控制在3000個左右,接種8個復(fù)孔。設(shè)置siRNA-1實驗組和siRNA-NC對照組。共鋪4塊96孔板分別用于24h、48h、72h、96h 4個檢測時間點。
4、24h后,將第一塊96孔板取出,每孔中加入10μl的CCK-8檢測液,將96孔板繼續(xù)放入細胞培養(yǎng)箱中孵育4h左右,用酶標儀檢測各孔在450nm波長處的吸光度值并記錄數(shù)據(jù)。
5、在48h、72h、96h后分別重復(fù)步驟4中的操作,最后統(tǒng)計出各時間點的吸光度值,作出生長曲線圖。
6、統(tǒng)計學(xué)分析
實驗都是按照重復(fù)3次來完成的,采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析,兩者之間的差異采用t檢驗,認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。
7、結(jié)果
結(jié)果如圖3所示,與對照相比,實驗組在轉(zhuǎn)染siRNA-1后,細胞的增殖明顯受到了抑制,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)說明CLINT1具有促進細胞增殖的作用。
實施例5CLINT1基因?qū)Ψ蜗侔┘毎蛲龅挠绊?/p>
使用流式細胞儀檢測CLINT1基因?qū)毎蛲龅挠绊憽?/p>
1、細胞培養(yǎng)步驟同實施例3。
2、細胞轉(zhuǎn)染步驟同實施例3。
3、步驟
1)將3m1 10×上樣緩沖液用27m1蒸餾水稀釋。
2)收集細胞樣本并用預(yù)冷的PBS清洗。
3)將細胞加入lml 1×上樣緩沖液,300g離心10min,吸出緩沖液。
4)再次加入lml 1×上樣緩沖液,將細胞懸液中細胞濃度調(diào)整為1×106個/ml。
5)將細胞懸液取出100μl,加入EP管中。
6)將5μl的Annexin V FITC加入EP管中,混勻EP管中的液體,在室溫下避光孵育10min。
7)向EP管中加入5μl PI染液,在室溫下避光5min。
8)在EP管中加入500μl的PBS溶液,輕輕混勻,1h內(nèi)上流式細胞儀進行檢測。
3、統(tǒng)計學(xué)方法
實驗都是按照重復(fù)3次來完成的,結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示,采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的,兩者之間的差異采用的t檢驗,認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。
4、結(jié)果:
結(jié)果如圖4所示,實驗組與對照組相比,細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),該結(jié)果說明,CLINT1的過表達抑制肺腺癌細胞的凋亡。
實施例6細胞遷移及侵襲實驗
1、Transwell小室制備
無菌條件下Matrigel冰浴融化,用PBS進行20倍稀釋,以50μl/孔的體積鋪在Transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h,待Matrigel膠聚合成凝膠后取出,輕輕吸出上層析出液。每孔中加入50μl的含BSA的無血清培養(yǎng)液對基底膜進行水化處理,37℃放置30min。
2、配置細胞懸液
細胞撤血清饑餓處理12-24h,對細胞進行消化處理,終止消化后進行離心,去除上層培養(yǎng)液。用PBS對沉淀細胞進行清洗,加入含有BSA的無血清培養(yǎng)基對其進行重懸。調(diào)整細胞的密度至5×l05個/ml。
3、細胞接種
取細胞懸液200μl(遷移實驗為100μl,侵襲實驗為200μl)加入到Transwell小室中。在24孔板下室加入500μl含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)基。把細胞放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
4、染色
細胞在培養(yǎng)結(jié)束后使用DAPI染色。把小室細胞先用PBS漂洗2遍,放入DAPI工作液中室溫染色5-20min。用PBS漂洗2遍,放入熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)。
5、結(jié)果
結(jié)果如圖5所示,在肺腺癌細胞轉(zhuǎn)染干擾RNA之后,與對照組相比,實驗組的遷移及侵襲能力均有明顯下降,結(jié)果說明CLINT1能夠促進肺腺癌的遷移及侵襲。
上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出,對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾,這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京泱深生物信息技術(shù)有限公司
<120> 生物標志物作為靶標在肺腺癌診治中的應(yīng)用
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1932
<212> DNA
<213> 人源
<400> 1
atgttgaaca tgtggaaggt gcgcgagctg gtggacaaag ccaccaatgt tgttatgaat 60
tattcagaga tcgagtctaa ggttcgagag gcaacgaacg atgatccttg gggaccttct 120
gggcaactca tgggagagat tgccaaggct acatttatgt atgaacaatt tccagaactt 180
atgaacatgc tttggtcacg aatgttaaaa gacaacaaaa agaattggag aagagtttat 240
aagtcgttgc tgctcctagc ttacctcata aggaatggat cagagcgtgt tgttacaagt 300
gccagagaac acatttatga tttacgatcc ctggaaaatt accactttgt agatgagcat 360
ggtaaggatc aaggtataaa tattcgacag aaggtgaagg aattggttga atttgcccag 420
gatgacgaca ggcttcgtga agagcgaaag aaagcaaaga agaacaaaga caagtatgtt 480
ggggtttcct cagacagtgt tggaggattc agatacagtg aaagatatga tcctgagccc 540
aaatcaaaat gggatgagga gtgggataaa aacaagagtg cttttccatt cagtgataaa 600
ttaggtgagc tgagtgataa aattggaagc acaattgatg acaccatcag caagttccgg 660
aggaaagata gagaagactc tccagaaaga tgcagcgaca gcgatgagga aaagaaagcg 720
agaagaggca gatctcccaa aggtgaattc aaagatgaag aggagactgt gacgacaaag 780
catattcata tcacacaggc cacagagacc accacaacca gacacaagcg cacagcaaat 840
ccttccaaaa ccattgatct tggagcagca gcacattaca caggggacaa agcaagtcca 900
gatcagaatg cttcaaccca cacacctcag tcttcagtta agacttcagt gcctagcagc 960
aagtcatctg gtgaccttgt tgatctgttt gatggcacca gccagtcaac aggaggatca 1020
gctgatttat tcggaggatt tgctgacttt ggctcagctg ctgcatcagg cagtttccct 1080
tcccaagtaa cagcaacaag tgggaatgga gactttggtg actggagtgc cttcaaccaa 1140
gccccatcag gccctgttgc ttccagtggc gagttctttg gcagtgcctc acagccagcg 1200
gtagaacttg ttagtggctc acaatcagct ctaggcccac ctcctgctgc ctcaaattct 1260
tcagacctgt ttgatcttat gggctcgtcc caggcaacca tgacatcttc ccagagtatg 1320
aatttctcta tgatgagcac taacactgtg ggacttggtt tgcctatgtc aagatcacag 1380
cctttgcaaa atgttagcac agtgctgcag aagcctaatc ctctctataa tcagaataca 1440
gatatggtcc agaaatcagt cagcaaaacc ttgccctcta cttggtctga ccccagtgta 1500
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atggcccctc ttggaaatac tccgatgatg aaccagagca tgatgggcat gaacatgaac 1800
atagggatgt ccgctgctgg gatgggcttg acaggcacaa tgggaatggg catgcccaac 1860
atagccatga cttctggaac tgtgcaaccc aagcaagatg cctttgcaaa tttcgccaat 1920
tttagcaaat aa 1932
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<211> 643
<212> PRT
<213> 人源
<400> 2
Met Leu Asn Met Trp Lys Val Arg Glu Leu Val Asp Lys Ala Thr Asn
1 5 10 15
Val Val Met Asn Tyr Ser Glu Ile Glu Ser Lys Val Arg Glu Ala Thr
20 25 30
Asn Asp Asp Pro Trp Gly Pro Ser Gly Gln Leu Met Gly Glu Ile Ala
35 40 45
Lys Ala Thr Phe Met Tyr Glu Gln Phe Pro Glu Leu Met Asn Met Leu
50 55 60
Trp Ser Arg Met Leu Lys Asp Asn Lys Lys Asn Trp Arg Arg Val Tyr
65 70 75 80
Lys Ser Leu Leu Leu Leu Ala Tyr Leu Ile Arg Asn Gly Ser Glu Arg
85 90 95
Val Val Thr Ser Ala Arg Glu His Ile Tyr Asp Leu Arg Ser Leu Glu
100 105 110
Asn Tyr His Phe Val Asp Glu His Gly Lys Asp Gln Gly Ile Asn Ile
115 120 125
Arg Gln Lys Val Lys Glu Leu Val Glu Phe Ala Gln Asp Asp Asp Arg
130 135 140
Leu Arg Glu Glu Arg Lys Lys Ala Lys Lys Asn Lys Asp Lys Tyr Val
145 150 155 160
Gly Val Ser Ser Asp Ser Val Gly Gly Phe Arg Tyr Ser Glu Arg Tyr
165 170 175
Asp Pro Glu Pro Lys Ser Lys Trp Asp Glu Glu Trp Asp Lys Asn Lys
180 185 190
Ser Ala Phe Pro Phe Ser Asp Lys Leu Gly Glu Leu Ser Asp Lys Ile
195 200 205
Gly Ser Thr Ile Asp Asp Thr Ile Ser Lys Phe Arg Arg Lys Asp Arg
210 215 220
Glu Asp Ser Pro Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Glu Glu Lys Lys Ala
225 230 235 240
Arg Arg Gly Arg Ser Pro Lys Gly Glu Phe Lys Asp Glu Glu Glu Thr
245 250 255
Val Thr Thr Lys His Ile His Ile Thr Gln Ala Thr Glu Thr Thr Thr
260 265 270
Thr Arg His Lys Arg Thr Ala Asn Pro Ser Lys Thr Ile Asp Leu Gly
275 280 285
Ala Ala Ala His Tyr Thr Gly Asp Lys Ala Ser Pro Asp Gln Asn Ala
290 295 300
Ser Thr His Thr Pro Gln Ser Ser Val Lys Thr Ser Val Pro Ser Ser
305 310 315 320
Lys Ser Ser Gly Asp Leu Val Asp Leu Phe Asp Gly Thr Ser Gln Ser
325 330 335
Thr Gly Gly Ser Ala Asp Leu Phe Gly Gly Phe Ala Asp Phe Gly Ser
340 345 350
Ala Ala Ala Ser Gly Ser Phe Pro Ser Gln Val Thr Ala Thr Ser Gly
355 360 365
Asn Gly Asp Phe Gly Asp Trp Ser Ala Phe Asn Gln Ala Pro Ser Gly
370 375 380
Pro Val Ala Ser Ser Gly Glu Phe Phe Gly Ser Ala Ser Gln Pro Ala
385 390 395 400
Val Glu Leu Val Ser Gly Ser Gln Ser Ala Leu Gly Pro Pro Pro Ala
405 410 415
Ala Ser Asn Ser Ser Asp Leu Phe Asp Leu Met Gly Ser Ser Gln Ala
420 425 430
Thr Met Thr Ser Ser Gln Ser Met Asn Phe Ser Met Met Ser Thr Asn
435 440 445
Thr Val Gly Leu Gly Leu Pro Met Ser Arg Ser Gln Pro Leu Gln Asn
450 455 460
Val Ser Thr Val Leu Gln Lys Pro Asn Pro Leu Tyr Asn Gln Asn Thr
465 470 475 480
Asp Met Val Gln Lys Ser Val Ser Lys Thr Leu Pro Ser Thr Trp Ser
485 490 495
Asp Pro Ser Val Asn Ile Ser Leu Asp Asn Leu Leu Pro Gly Met Gln
500 505 510
Pro Ser Lys Pro Gln Gln Pro Ser Leu Asn Thr Met Ile Gln Gln Gln
515 520 525
Asn Met Gln Gln Pro Met Asn Val Met Thr Gln Ser Phe Gly Ala Val
530 535 540
Asn Leu Ser Ser Pro Ser Asn Met Leu Pro Val Arg Pro Gln Thr Asn
545 550 555 560
Ala Leu Ile Gly Gly Pro Met Pro Met Ser Met Pro Asn Val Met Thr
565 570 575
Gly Thr Met Gly Met Ala Pro Leu Gly Asn Thr Pro Met Met Asn Gln
580 585 590
Ser Met Met Gly Met Asn Met Asn Ile Gly Met Ser Ala Ala Gly Met
595 600 605
Gly Leu Thr Gly Thr Met Gly Met Gly Met Pro Asn Ile Ala Met Thr
610 615 620
Ser Gly Thr Val Gln Pro Lys Gln Asp Ala Phe Ala Asn Phe Ala Asn
625 630 635 640
Phe Ser Lys
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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<212> DNA
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<211> 21
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uccaauucuu uuuguugucu u 21
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gacaacaaaa agaauuggag a 21
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<212> RNA
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auacuugucu uuguucuucu u 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaagaacaaa gacaaguaug u 21