本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

周圍神經(jīng)損傷是臨床上最嚴(yán)重的創(chuàng)傷之一。我國(guó)每年因各種原因造成的周圍神經(jīng)病例數(shù)額巨大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年因嚴(yán)重創(chuàng)傷、先天性畸形及腫瘤切除等原因造成的周圍神經(jīng)損傷約200萬(wàn)例；根據(jù)Integra Life Science公司估計(jì)，全球有關(guān)神經(jīng)修復(fù)的市場(chǎng)約為40億美元。隨著現(xiàn)代工業(yè)、交通及建筑業(yè)的發(fā)展，周圍神經(jīng)損傷的發(fā)生率呈逐年增加的趨勢(shì)，給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。盡管周圍神經(jīng)損傷后能夠自發(fā)再生，并與靶組織重新建立突觸聯(lián)系從而恢復(fù)神經(jīng)功能，但周圍神經(jīng)損傷的臨床修復(fù)效果仍差強(qiáng)人意，且致殘率較高。尤其是長(zhǎng)節(jié)段(＞3cm)神經(jīng)缺損，無(wú)法實(shí)施無(wú)張力縫合，修復(fù)更為困難，患者預(yù)后更差。長(zhǎng)節(jié)段神經(jīng)缺損臨床治療的金標(biāo)準(zhǔn)是自體神經(jīng)移植，但供體來(lái)源有限、供區(qū)功能損害、供受神經(jīng)直徑不匹配等限制了自體神經(jīng)的應(yīng)用。

目前已經(jīng)商品化的神經(jīng)修復(fù)支架包括Neurotube、NeuroGen、Neuromatrix等，但均存在各種問(wèn)題，如神經(jīng)導(dǎo)管壁易塌陷，缺乏內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)，無(wú)法引導(dǎo)長(zhǎng)距離神經(jīng)缺損，更重要的是其修復(fù)效果并不理想。因此，開(kāi)發(fā)一種具有更好修復(fù)效果的神經(jīng)修復(fù)產(chǎn)品具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。

在神經(jīng)發(fā)育及再生過(guò)程中，梯度神經(jīng)生長(zhǎng)因子能夠更加有效的誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)分化。大量研究發(fā)現(xiàn)給予梯度神經(jīng)生長(zhǎng)因子，能夠有效地誘導(dǎo)神經(jīng)定向生長(zhǎng)，提高神經(jīng)再生的速度及功能恢復(fù)效果。此外，支架的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，尤其是仿生學(xué)的設(shè)計(jì)對(duì)神經(jīng)再生也發(fā)揮的重要的引導(dǎo)作用。橋接支架內(nèi)部縱向排列的微管結(jié)構(gòu)，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞遷移以及軸突的延伸。因此將梯度因子復(fù)合入具有縱向排列的微管結(jié)構(gòu)的神經(jīng)支架中，有望更好的促進(jìn)神經(jīng)再生，取得更優(yōu)的功能恢復(fù)。目前國(guó)際上尚無(wú)將梯度因子復(fù)合入具有縱向排列的微管結(jié)構(gòu)的神經(jīng)支架的報(bào)道，也無(wú)梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架制作工藝。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架制備方法及其應(yīng)用，旨在解決目前商品化神經(jīng)導(dǎo)管均沒(méi)有誘導(dǎo)活性，并且缺乏內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)，無(wú)法引導(dǎo)長(zhǎng)距離神經(jīng)缺損的問(wèn)題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架制備方法，包括以下步驟：：

步驟一，材料溶解：0～250mg取殼聚糖、0～100mg I型膠原分別溶于5ml的醋酸溶液(3～6mg/ml)，4℃，溶解24小時(shí)；

步驟二，材料混合：將5ml殼聚糖溶液倒入5ml膠原溶液中，用勻漿器冰水浴條件下混勻，攪拌速度2500～3000rpm，4min/次，間歇4min，重復(fù)混勻4次～5次；得到無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的混合凝膠；之后取5ml混合凝膠，加入2500ng NGF或GDNF促神經(jīng)再生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，形成500ng/ml濃度的混合有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的凝膠；

步驟三，凝膠去氣泡處理：先用真空泵抽真空5min，放氣使氣泡破碎，重復(fù)4～5次；之后離心機(jī)5000rpm離心3～5min；再次真空泵抽真空5min，放氣使氣泡破碎，重復(fù)4～5次；最后離心機(jī)5000rpm離心3～5min；

步驟四，梯度因子凝膠鑄模：將混合有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的凝膠及無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的混合凝膠分別裝入1ml注射器，并分別安裝兩個(gè)可編程微量注射泵，兩注射器通過(guò)Y型管連接到一個(gè)混勻器。將混合有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的凝膠和無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的凝膠通過(guò)變速控制，注入混勻器中，之后注入圓柱形模具，并在圓柱形模具一端塞入與圓柱形模具內(nèi)經(jīng)相匹配的銅塞；最終在圓柱形模具中形成一個(gè)沿縱向的因子梯度；

步驟五，縱向微管結(jié)構(gòu)制備：圓柱形模具裝入垂直下落架，銅塞距離外部的液氮面5cm～10cm，下落架連接于勻速下降儀上，以1mm/min～5mm/min速度下降；待全部浸入液氮后，取出圓柱形模具；

步驟六，冷凍干燥：去除圓柱形模具的銅塞；預(yù)冷冷凍干燥機(jī)30min～60min；冷凍干燥18h～24h，至圓柱形模具完全干燥；

步驟七，梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架交聯(lián)：將制好支架從圓柱形模具中取出，放入20ml 0.5％～10％京尼平乙醇溶液4℃交聯(lián)4小時(shí)～48小時(shí)，或放入NHS/EDC溶液交聯(lián)24h～48h；

步驟八，去除殘留交聯(lián)劑：將交聯(lián)支架從交聯(lián)劑中取出，放入200ml pH7.0-7.5的蒸餾水中，搖床40rpm，1小時(shí)/次，重復(fù)洗3次～6次；；

步驟九，凍干：將清洗的神經(jīng)支架取出，放入-80℃冷凍30分鐘～60分鐘，放入預(yù)冷凍干機(jī)中凍干18小時(shí)～24小時(shí)；制得梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架。

進(jìn)一步，步驟四中，將混合有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的凝膠及無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的混合凝膠分別裝入1ml注射器，并分別安裝兩個(gè)可編程微量注射泵，所述兩個(gè)可編程微量注射泵通過(guò)變速注射控制，裝有含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器一加速，裝有混合含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器二減速，兩個(gè)注射器的流速之和恒定不變。

進(jìn)一步，梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架內(nèi)徑為1mm～8mm；長(zhǎng)度為1cm～10cm或者大于10cm。

進(jìn)一步，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為NGF、GDNF、BDNF、NT3、VEGF、CNTF中的一種。

進(jìn)一步，最終在模具中形成一個(gè)沿縱向的因子梯度，因子梯度為線性濃度梯度。

進(jìn)一步，步驟一中，優(yōu)選250mg殼聚糖、100mgI型膠原分別溶于5ml醋酸溶液中得到的混合凝膠；或?yàn)閱渭兠髂z溶于5ml醋酸溶液中得到的混合凝膠，單純明膠占無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的混合凝膠的質(zhì)量比為1％～5％；

步驟七中，交聯(lián)劑優(yōu)選1％京尼平乙醇溶液，交聯(lián)24小時(shí)。

進(jìn)一步，所述裝有含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器一加速，裝有混合含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器二減速，兩個(gè)注射器的流速之和恒定不變；

具體包括：

裝有無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合凝膠的注射器一通過(guò)可編程微量注射泵一控制，凝膠流速由0μl/min逐漸加速，3min達(dá)60μl/min，之后以60μl/min恒定流速，裝有無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器一再注射1min，使60μl不含因子的凝膠體積剛好為Y型管處到圓柱形模具之間通道殘留的凝膠體積

裝有混合含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器二通過(guò)可編程微量注射泵二控制，流速由60μl/min逐漸減速，3min末達(dá)0μl/min；含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠。

本發(fā)明另一目的在于提供一種利用上述制備方法制備的梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架的促進(jìn)神經(jīng)再生方法，該梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架的促進(jìn)神經(jīng)再生方法包括：

促神經(jīng)再生的營(yíng)養(yǎng)因子沿神經(jīng)支架縱向形成由低濃度到高濃度的因子梯度，通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)方向性神經(jīng)再生；同時(shí)神經(jīng)支架利用縱向平行排列的微管結(jié)構(gòu)，通過(guò)物理引導(dǎo)神經(jīng)再生。

本發(fā)明通過(guò)制備同時(shí)具備梯度因子及縱向仿生結(jié)構(gòu)的神經(jīng)修復(fù)支架，通過(guò)化學(xué)因子誘導(dǎo)及物理引導(dǎo)，協(xié)同促進(jìn)神經(jīng)再生，解決了目前長(zhǎng)節(jié)段神經(jīng)缺損修復(fù)材料促再生效果差，功能恢復(fù)不理想的問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架制備方法流程圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的梯度因子制作系統(tǒng)示意圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的圓柱形模具圖；

圖中：1、注射器一、2、注射器二；3、可編程微量注射泵一；4、可編程微量注射泵二；5、Y型管；6、螺旋混勻器；7、銅塞；8、聚四氟乙烯厚壁圓柱管。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的兩可編程注射泵通過(guò)控制流速，在內(nèi)徑為2mm，長(zhǎng)度為6cm的圓柱形模具內(nèi)形成線性因子梯度圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的梯度因子仿生支架掃描電鏡圖像示意圖。

圖中：A.梯度因子仿生支架橫截面呈蜂窩狀；B.梯度因子仿生支架斜切面可見(jiàn)隧道樣微管向內(nèi)部延伸；C.梯度因子仿生支架縱切面呈平行排列的微管結(jié)構(gòu)。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)描述。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架制備方法，包括以下步驟：

S101：材料溶解：0～250mg取殼聚糖、0～100mg I型膠原分別溶于5ml的醋酸溶液(3～6mg/ml)，4℃，溶解24小時(shí)。

S102：材料混合：將5ml殼聚糖溶液倒入5ml膠原溶液中，用勻漿器冰水浴條件下混勻，攪拌速度2500～3000rpm，4min/次，間歇4min，重復(fù)混勻4次～5次；得到無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的混合凝膠；之后取5ml混合凝膠，加入2500ng NGF或GDNF促神經(jīng)再生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，形成500ng/ml濃度的混合有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的凝膠。

S103：凝膠去氣泡處理：先用真空泵抽真空5min，放氣使氣泡破碎，重復(fù)4～5次；之后離心機(jī)5000rpm離心3～5min；再次真空泵抽真空5min，放氣使氣泡破碎，重復(fù)4～5次；最后離心機(jī)5000rpm離心3～5min。

S104：梯度因子凝膠鑄模：將混合有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的凝膠及無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的混合凝膠分別裝入1ml注射器，并分別安裝兩個(gè)可編程微量注射泵，兩注射器通過(guò)Y型管連接到一個(gè)混勻器。將混合有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的凝膠和無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的凝膠通過(guò)變速控制，注入混勻器中，之后注入圓柱形模具，并在圓柱形模具一端塞入與圓柱形模具內(nèi)經(jīng)相匹配的銅塞；最終在圓柱形模具中形成一個(gè)沿縱向的因子梯度。

S105：縱向微管結(jié)構(gòu)制備：圓柱形模具裝入垂直下落架，銅塞距離外部的液氮面5cm～10cm，下落架連接于勻速下降儀上，以1mm/min～5mm/min速度下降；待全部浸入液氮后，取出圓柱形模具。

S106：冷凍干燥：去除圓柱形模具的銅塞；預(yù)冷冷凍干燥機(jī)30min～60min；冷凍干燥18h～24h，至圓柱形模具完全干燥。

S107：梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架交聯(lián)：將制好支架從圓柱形模具中取出，放入20ml 0.5％～10％京尼平乙醇溶液4℃交聯(lián)4小時(shí)～48小時(shí)，或放入NHS/EDC溶液交聯(lián)24h～48h。

S108：去除殘留交聯(lián)劑：將交聯(lián)支架從交聯(lián)劑中取出，放入200ml pH 7.0-7.5的蒸餾水中，搖床40rpm，1小時(shí)/次，重復(fù)洗3次～6次。

S109：凍干：將清洗的神經(jīng)支架取出，放入-80℃冷凍30分鐘～60分鐘，放入預(yù)冷凍干機(jī)中凍干18小時(shí)～24小時(shí)；制得梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架。

進(jìn)一步，步驟四中，將混合有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的凝膠及無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的混合凝膠分別裝入1ml注射器，并分別安裝兩個(gè)可編程微量注射泵，所述兩個(gè)可編程微量注射泵通過(guò)變速注射控制，裝有含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器一加速，裝有混合含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器二減速，兩個(gè)注射器的流速之和恒定不變。

進(jìn)一步，梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架內(nèi)徑為1mm～8mm；長(zhǎng)度為1cm～10cm或者大于10cm。

進(jìn)一步，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為NGF、GDNF、BDNF、NT3、VEGF、CNTF中的一種。

進(jìn)一步，最終在模具中形成一個(gè)沿縱向的因子梯度，因子梯度為線性濃度梯度。

進(jìn)一步，步驟一中，優(yōu)選250mg殼聚糖、100mgI型膠原分別溶于5ml醋酸溶液中得到的混合凝膠；或?yàn)閱渭兠髂z溶于5ml醋酸溶液中得到的混合凝膠，單純明膠占無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的混合凝膠的質(zhì)量比為1％～5％；

步驟七中，交聯(lián)劑優(yōu)選1％京尼平乙醇溶液，交聯(lián)24小時(shí)。

進(jìn)一步，所述裝有含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器一加速，裝有混合含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器二減速，兩個(gè)注射器的流速之和恒定不變；

具體包括：

裝有無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合凝膠的注射器一通過(guò)可編程微量注射泵一控制，凝膠流速由0μl/min逐漸加速，3min達(dá)60μl/min，之后以60μl/min恒定流速，裝有無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器一再注射1min，使60μl不含因子的凝膠體積剛好為Y型管處到圓柱形模具之間通道殘留的凝膠體積

裝有混合含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器二通過(guò)可編程微量注射泵二控制，流速由60μl/min逐漸減速，3min末達(dá)0μl/min；含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠。

本發(fā)明另一目的在于提供一種利用上述制備方法制備的梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架的促進(jìn)神經(jīng)再生方法，該梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架的促進(jìn)神經(jīng)再生方法包括：

促神經(jīng)再生的營(yíng)養(yǎng)因子沿神經(jīng)支架縱向形成由低濃度到高濃度的因子梯度，通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)方向性神經(jīng)再生；同時(shí)神經(jīng)支架利用縱向平行排列的微管結(jié)構(gòu)，通過(guò)物理引導(dǎo)神經(jīng)再生。

如圖2所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架制作系統(tǒng)，包括：

用于裝無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器一1；

用于裝有含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠的注射器二2；

用于控制注射器一裝無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠流速的可編程微量注射泵一3；

用于控制注射器二神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合凝膠流速的可編程微量注射泵二4；

與Y型管5連接，用于將來(lái)自注射器一的無(wú)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠與來(lái)自注射器二的含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子凝膠混勻的螺旋混勻器6；

連接螺旋混勻器，用于形成一個(gè)沿縱向的因子梯度的圓柱形模具。

如圖3所示，所述圓柱形模具包括：

聚四氟乙烯厚壁圓柱管8，管壁厚度＞4mm；

連接聚四氟乙烯管下端的與其內(nèi)徑相匹配的銅塞7。

圓柱形模具內(nèi)徑為1mm～8mm；長(zhǎng)度為1cm～10cm或者大于10cm；管壁厚度＞4mm；所述注射器一、注射器二的內(nèi)容積均為1mL。

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的兩可編程注射泵通過(guò)控制流速，在內(nèi)徑為2mm，長(zhǎng)度為6cm的圓柱形模具內(nèi)形成線性因子梯度圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的梯度因子仿生支架掃描電鏡圖像示意圖。

圖中：A.梯度因子仿生支架橫截面呈蜂窩狀；B.梯度因子仿生支架斜切面可見(jiàn)隧道樣微管向內(nèi)部延伸；C.梯度因子仿生支架縱切面呈平行排列的微管結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明以制作長(zhǎng)度為6cm，內(nèi)徑為2mm，線性因子梯度(最低濃度為0ng/ml，最高濃度為500ng/ml)的梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架為例，其制備方法包括以下步驟：

步驟一，材料溶解：100mg殼聚糖，250mgI型膠原分別溶于5ml 3～6mg/ml的醋酸溶液中，4℃，溶解24小時(shí)。

步驟二，材料混合：將5ml殼聚糖溶液倒入膠原溶液中，用勻漿器冰水浴條件下混勻，2500-3000rpm，4min/次，間歇4min，重復(fù)混勻4-5次。之后取5ml混合凝膠，加入2500ng NGF或GDNF等促神經(jīng)再生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，形成500ng/ml濃度。

步驟三，凝膠去氣泡處理：(1)真空泵抽真空5min，放氣使氣泡破碎，重復(fù)4-5次。

(2)5000rpm離心3min；(3)真空泵抽真空5min，放氣使氣泡破碎，重復(fù)4-5次；(4)5000rpm離心3min

步驟四，梯度因子凝膠鑄模：應(yīng)用，將混合有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的凝膠及無(wú)因子的凝膠分別裝入1ml注射器，并分別安裝到兩個(gè)可編程微量注射泵，通過(guò)變速注射控制(見(jiàn)圖4：一個(gè)加速，一個(gè)減速)，但是兩者流速之和恒定，兩注射器通過(guò)Y型管連接到一個(gè)混勻器，將混勻的凝膠注入圓柱形模具，并在模具一端塞入與內(nèi)經(jīng)相匹配的銅塞。最終在模具中形成一個(gè)沿縱向的因子梯度(見(jiàn)圖2)。

步驟五，縱向微管結(jié)構(gòu)制備：梯度因子凝膠鑄模裝入垂直下落架，銅柱距離液氮面5-10cm，下落架連接于勻速下降儀上，以1-5mm/min速度下降。待全部浸入液氮后，取出。

步驟六，冷凍干燥：(1)去除模具上的銅柱；(2)預(yù)冷冷凍干燥機(jī)30-60min；(3)冷凍干燥18-24h，至完全干燥。

步驟七：梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架交聯(lián)：將制好支架從模具中取出，放入20ml 1％京尼平乙醇溶液4℃交聯(lián)24-48小時(shí)，或放入NHS/EDC溶液交聯(lián)24-48h。(對(duì)于直徑越粗，長(zhǎng)度越長(zhǎng)，交聯(lián)時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng))。

步驟八，去除殘留交聯(lián)劑：將交聯(lián)支架從交聯(lián)劑中取出，放入200ml PH7.0-7.5的蒸餾水中，搖床40rpm，1小時(shí)/次，重復(fù)洗3-6次。(對(duì)于直徑越粗，清洗時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng))。

步驟九，凍干：將清洗的神經(jīng)支架取出，放入-80℃冷凍30-60分鐘，放入預(yù)冷凍干機(jī)中凍干18-24小時(shí)。

本發(fā)明實(shí)施例提供一種梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架促進(jìn)神經(jīng)再生方法，該梯度因子仿生神經(jīng)修復(fù)支架促進(jìn)神經(jīng)再生方法包括：

促神經(jīng)再生的營(yíng)養(yǎng)因子沿神經(jīng)支架縱向形成由低濃度到高濃度的因子梯度(見(jiàn)圖3從左向右為由低濃度到高濃度梯度)，通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)方向性神經(jīng)再生；同時(shí)神經(jīng)支架具有縱向平行排列的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖5)，通過(guò)物理引導(dǎo)神經(jīng)再生。因此化學(xué)誘導(dǎo)與物理引導(dǎo)能夠起到相互促進(jìn)協(xié)同加速神經(jīng)再生。

如圖4所示，兩可編程注射泵通過(guò)控制流速，在內(nèi)徑為2mm，長(zhǎng)度為6cm的模具內(nèi)形成線性因子梯度。注射器1凝膠流速由0μl/min逐漸加速，3min達(dá)60μl/min，3min末停止。注射器2流速由60μl/min逐漸減速，3min末達(dá)0μl/min，之后以60μl/min恒定流速再注射1min，這60μl不含因子的凝膠體積剛好為Y型管處到模具之間通道殘留的凝膠體積。

本發(fā)明通過(guò)制備同時(shí)具備梯度因子及縱向仿生結(jié)構(gòu)的神經(jīng)修復(fù)支架，通過(guò)化學(xué)因子誘導(dǎo)及物理拓?fù)湔T導(dǎo)，協(xié)同促進(jìn)神經(jīng)再生，解決了目前長(zhǎng)節(jié)段神經(jīng)缺損修復(fù)材料促再生效果差，功能恢復(fù)不理想的問(wèn)題。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。