本發(fā)明涉及多糖提取及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種中藥成分巴戟天多糖對(duì)雄性生殖系統(tǒng)損傷的修復(fù)作用。

背景技術(shù)：

由于環(huán)境污染和生活壓力增大等因素的影響，人的生育能力日漸低下，不育癥已成為一項(xiàng)世界性的醫(yī)學(xué)和社會(huì)學(xué)問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球有6千萬(wàn)～8千萬(wàn)對(duì)不育夫婦。近。臨床上常用克羅米酚、吲哚美辛等治療各種少、弱精子癥，具有一定的療效，但都存不同程度的毒副作用?？肆_米酚可引起體重和性欲改變,輕度抑郁、惡心暈眩、視覺(jué)障礙、胃腸道反應(yīng)和皮疹等副作用。吲哚美辛治療2～4個(gè)月后，精子密度及精子運(yùn)動(dòng)速度有明顯改觀。但是有個(gè)別病例效果欠佳,主訴服藥后有嘔吐、頭昏等不良反應(yīng),停藥2個(gè)月后精液中精子又恢復(fù)至治療前水平。因此，尋找能有效促進(jìn)精子生成和減少毒副作用的新型生精藥物是當(dāng)前新藥研發(fā)熱點(diǎn)之一。

精索靜脈曲張(VaricoceLe，VC)是指由于靜脈回流受阻或瓣膜失效血液返流等因素導(dǎo)致精索靜脈的伸長(zhǎng)、擴(kuò)張及迂曲，并伴有兩側(cè)陰囊體積不對(duì)稱、陰囊重量增加及睪丸疼痛等,是男性泌尿生殖系統(tǒng)中常見(jiàn)的疾病之一。普通人群VC發(fā)病率為10％～15％,30～35％的原發(fā)性男性不育患者及69～81％的繼發(fā)性男性不育患者均患有精索靜脈曲張，是造成男性不育最主要的因素。WHO在男性不育研究中已把VC列入首位，然向其所致不孕的機(jī)理至令仍未完全闡明。

巴戟天是天然中草藥，茜草科藤狀灌木的根，主要生長(zhǎng)在我省閩南山區(qū)、廣東和廣西。在閩南地區(qū)有大面積的人工栽培，是我省的特產(chǎn)之一。中醫(yī)認(rèn)為巴戟天具有壯陽(yáng)補(bǔ)腎、固精安神功效，享有“北方高麗，南方巴戟”美稱。產(chǎn)地民眾有用巴戟天“與肉同煲”的食用習(xí)慣，以此來(lái)提高性能力，治療陽(yáng)痿等疾病?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為巴戟天能提高人體免疫力、增強(qiáng)性欲等。巴戟天的主要化學(xué)成分為糖類、蒽醌類和氨基酸類，此外還含有揮發(fā)性成分(主要為有機(jī)酸及其酯)，環(huán)烯醚萜和苷類，甾體化合物以及含有24種微量元素。巴戟天作為我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥之一，具有多方面的藥理作用。近年來(lái)大量臨床應(yīng)用及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的損傷具有明顯的修復(fù)作用，但是巴戟天中成分復(fù)雜，直接食用生藥藥具有一定的肝腎毒性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有的中草藥巴戟天對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的損傷具有明顯的修復(fù)作用，但是巴戟天中成分復(fù)雜，直接食用生藥具有一定的肝腎毒性的缺陷，提供一種一種中藥成分巴戟天多糖對(duì)雄性生殖系統(tǒng)損傷的修復(fù)作用。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

巴戟天多糖在在制備預(yù)防和治療雄性生殖系統(tǒng)疾病的藥物或保健品中的用途。

進(jìn)一步的，所述的雄性生殖系統(tǒng)疾病為精索靜脈曲張。

進(jìn)一步的，所述的巴戟天多糖的平均分子量為：1.0～1.5×10⁴。

進(jìn)一步的，所述的巴戟天多糖的提取方法，包括以下步驟：

1)、將巴戟天粉末用3倍質(zhì)量的95％乙醇沸水浴回流提取2h，重復(fù)一次，除去脂溶性成分以及寡糖；

2)藥渣自然揮發(fā)至無(wú)醇味，用6倍質(zhì)量的雙蒸水沸水浴提取2h，重復(fù)兩次；

3)、合并藥液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，至比重達(dá)到1.2g/mL；加入無(wú)水乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60％，4℃冰箱過(guò)夜，收集沉淀，得到巴戟天粗糖；

4)、加等量水溶解巴戟天粗糖，加入1/3體積的sevag試劑(氯仿：正丁醇＝1：4)，置于分液漏斗中，振搖，靜置分層1h，除去下層氯仿和中間層變性蛋白質(zhì)，重復(fù)兩次，得脫蛋白的巴戟天總多糖；

5)、調(diào)節(jié)巴戟天總多糖的pH為9.0，采用30％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的H₂O₂60℃除色30min；加入無(wú)水乙醇，使乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到60％，4℃冰箱過(guò)夜，收集沉淀；

6)、沉淀依次以無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，烘箱干燥，得巴戟天多糖粉末。

優(yōu)選的，所述的巴戟天多糖的用量為200～300mg kg^-1。

本發(fā)明將巴戟天多糖直接用于制備預(yù)防和治療雄性生殖系統(tǒng)疾病的藥物或保健品中，發(fā)揮對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的損傷具有修復(fù)作用，促進(jìn)生精功能，提高性行為能力，提高生殖能力，增加體內(nèi)睪酮水平，從而避免了直接食用巴戟天生藥具有肝腎毒性的技術(shù)難題。

附圖說(shuō)明

附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是空白對(duì)照組的HE染色結(jié)果；

圖2是精索靜脈曲張模型組的HE染色結(jié)果；

圖3是300mg kg^-1巴戟天多糖給藥組的HE染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例

一、巴戟天多糖的提取方法，包括以下步驟：

(1)將巴戟天粉末用3倍質(zhì)量的95％乙醇沸水浴回流提取2h，重復(fù)一次，除去脂溶性成分以及寡糖；

(2)藥渣自然揮發(fā)至無(wú)醇味，用6倍質(zhì)量的雙蒸水沸水浴提取2h，重復(fù)兩次；

(3)合并藥液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，至比重達(dá)到1.2g/mL；加入無(wú)水乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60％，4℃冰箱過(guò)夜，收集沉淀，得到巴戟天粗糖；

(4)加等量水溶解巴戟天粗糖，加入1/3體積的sevag試劑(氯仿：正丁醇＝1：4)，置于分液漏斗中，振搖，靜置分層1h，除去下層氯仿和中間層變性蛋白質(zhì)，重復(fù)兩次，得脫蛋白的巴戟天總多糖；

(5)調(diào)節(jié)巴戟天總多糖的pH為9.0，采用30％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的H₂O₂60℃除色30min；加入無(wú)水乙醇，使乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到60％，4℃冰箱過(guò)夜，收集沉淀；

(6)沉淀依次以無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，烘箱干燥，得巴戟天多糖粉末。

二、精索靜脈曲張動(dòng)物模型的構(gòu)建

腹部備皮，酒精消毒，腹部正中切口，顯露腹腔，紗布卷將腹腔內(nèi)容推向右側(cè)，顯露腎臟、結(jié)腸和下腔靜脈，分離左側(cè)腎靜脈入下腔靜脈入口處，緊鄰入口處將腎靜脈鈍性分離一通道，去除周圍脂肪組織，置一根直徑約為0.8mm的金屬桿，與左腎靜脈一起結(jié)扎，結(jié)扎后將金屬桿撥出，腹腔內(nèi)注入青霉素后，關(guān)腹。手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)兩個(gè)月，再給予不同濃度的巴戟天多糖灌胃治療一個(gè)月后取材。取材時(shí)采用氯胺酮腹腔注射麻醉大鼠，剖腹觀察，若出現(xiàn)左側(cè)精索內(nèi)靜脈擴(kuò)(左側(cè)精索靜脈直徑至少為右側(cè)精索靜脈直徑的三倍)張且兩個(gè)腎臟重量相似，則表明手術(shù)成功，假手術(shù)組大鼠未見(jiàn)擴(kuò)張。

三、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及處理

45只健康青春期雄性SD大鼠(200±20g)隨機(jī)分假手術(shù)組、VC+生理鹽水組、VC+巴戟天多糖給藥組300mg/kg三組，每組15只：

(1)假手術(shù)組：打開(kāi)腹腔，暴露左腎靜脈，但不進(jìn)行結(jié)扎。

(2)VC+生理鹽水組：VC手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)4周，再給予生理鹽水灌胃4周后取材。

(3)VC+巴戟天多糖給藥組300mg/kg：VC手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)4周，再給予300mg/kg巴戟天多糖給灌胃治療4周后取材。

四、HE染色及附睪精子數(shù)測(cè)定

(1)左側(cè)睪丸組織塊，經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片。切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗：二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸餾水洗2min。蘇木素染色5min，自來(lái)水沖洗。鹽酸乙醇分化30s(提插數(shù)下)。自來(lái)水浸泡15min或溫水(約50℃)5min，然后置伊紅液2min，水洗5min。常規(guī)脫水，透明，封片：95％乙醇(I)min→95％乙醇(Ⅱ)1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3：1)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性樹(shù)脂封固。

(2)30d后處死動(dòng)物，取一側(cè)附睪尾稱量后置于37℃的2mL生理鹽水中，剪碎，再加2mL生理鹽水，吸管吹打30次，混勻，稍停，用4層擦鏡紙過(guò)濾，再用1mL生理鹽水沖平皿，過(guò)濾。移液管移取濾液1mL，另取37℃生理鹽水9mL混勻，制備成10mL精子懸液(以上操作均在37℃電熱恒溫水溫箱中進(jìn)行)。

用定量移液管吸取少量精子懸液，緩慢加在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，靜置半分鐘，按紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)5個(gè)中方格的精子數(shù)，高倍鏡下計(jì)數(shù)精子總數(shù)為R，精子密度＝R×50×稀釋倍數(shù)×10⁶/mL，即獲得每側(cè)附睪精子懸液每毫升精子數(shù)。

五、大鼠性行為能力測(cè)定及大鼠生殖能力的測(cè)定

在安靜的室內(nèi)輪流將每組動(dòng)物中的每只雄性大鼠放入45cm×25cm×20cm的干凈的大鼠籠中適應(yīng)5min,隨后投入同批飼養(yǎng)的未經(jīng)輻射的雌性大鼠形成1對(duì)1配對(duì),觀察30min。觀察指標(biāo):

(1)撲捉潛伏期:(capture incubationperiod,CIP)自雌鼠投入至雄鼠第一次撲捉雌鼠的時(shí)間。

(2)撲捉次數(shù):(capture times,CT)自雌鼠投入30min內(nèi)，雄鼠撲捉雌鼠或爬背或舔陰動(dòng)作次數(shù)。

(3)母鼠懷孕率：將挑選好的動(dòng)物于下午5-6點(diǎn)，按1公1母比例放在準(zhǔn)備好的鼠籠中，第二天早上7-8點(diǎn)檢查陰栓，計(jì)算每組懷孕母鼠個(gè)數(shù)。

六、大鼠睪丸內(nèi)睪酮水平及血清睪酮水平測(cè)定

(1)新鮮睪丸組織取材：大鼠禁食24h，稱重記錄后用10％水合氯醛(3～6mL/kg)腹腔注射麻醉。仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，打開(kāi)腹腔檢查模型是否制作成功，制作成功的模型剪開(kāi)左側(cè)陰囊，暴露睪丸，將睪丸上部血管結(jié)扎后，取下左側(cè)睪丸，取大約100mg睪丸組織，用1mLPBS溶液研磨睪丸組織，5000rmp離心15min，去除睪丸組織塊，留上清。上清中的總蛋白濃度采用BCA試劑盒測(cè)定。

(2)取血：打開(kāi)胸腔，暴露心臟，用5mL注射器自右心房進(jìn)針取血3～5mL，置于冰上冷卻的EP管中，冰上靜置30min；經(jīng)4℃離心機(jī)，2500rpm離心15min，取上清血清置于另一EP管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

睪丸及血清中的睪酮水平采用ELISA方法測(cè)定，具體步驟按說(shuō)明書(shū)操作。

七、統(tǒng)計(jì)分析

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS version 21.0進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)，P＜0.05視為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一、HE染色結(jié)果及附睪精子數(shù)

圖1、圖2和圖3分別表示空白對(duì)照組、精索靜脈曲張模型組、300mg kg^-1巴戟天多糖給藥組。H&E染色結(jié)果顯示VC會(huì)造成大鼠睪丸生精上皮結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為生精上皮變薄、生殖細(xì)胞及成熟精子數(shù)量減少、生精小管萎縮、各級(jí)生殖細(xì)胞排列紊亂、官腔中出脫落的未成熟精子(圖1)。300mg kg^-1巴戟天多糖對(duì)VC引起的損傷具有修復(fù)作用(圖3)，表現(xiàn)為生精上皮厚度增加、生殖細(xì)胞數(shù)量及成熟精子數(shù)量增加、減少未成熟生殖細(xì)胞的脫落。同時(shí)精索靜脈曲張會(huì)引起左側(cè)附睪精子計(jì)數(shù)減少，巴戟天多糖能增加精子數(shù)量。

表1各組大鼠附睪精子計(jì)數(shù)結(jié)果(n＝8)

與空白組比較(P<0.05)；#與VC模型組比較(P<0.05).

二、大鼠性行為學(xué)及生殖能力

VC引起大鼠性行為能力及生殖能力降低，表現(xiàn)為撲捉潛伏期增加，撲捉次數(shù)減少，懷孕母鼠個(gè)數(shù)減少。給予巴戟天多糖后，與VC模型組相比，撲捉潛伏期減少，撲捉次數(shù)增加，懷孕母鼠個(gè)數(shù)增加。

表2大鼠性行為學(xué)及生殖能力(n＝10)

*與空白組比較(P<0.05)；#與VC模型組比較(P<0.05).

三、大鼠睪丸及血清睪酮水平

精索靜脈曲張會(huì)引起睪丸內(nèi)及血清內(nèi)睪酮濃度降低，給予巴戟天多糖之后，兩項(xiàng)指標(biāo)增加。

表3大鼠睪丸及血清睪酮水平(n＝8)

*與空白組比較(P<0.05)；#與VC模型組比較(P<0.05).

本發(fā)明將巴戟天多糖直接用于制備預(yù)防和治療雄性生殖系統(tǒng)疾病的藥物或保健品中，發(fā)揮對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的損傷具有修復(fù)作用，促進(jìn)生精功能，提高性行為能力，提高生殖能力，增加體內(nèi)睪酮水平，從而避免了直接食用巴戟天生藥具有肝腎毒性的技術(shù)難題。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。