本發(fā)明涉及抑制細胞增殖、增強肺癌放療敏感性、抑制細胞DNA損傷修復能力的香草木素，通過檢測某些特定的生物標志物，用于評價香草木素的抑制放療抵抗肺癌細胞DNA損傷修復能力和放療增敏效應。

背景技術：

在臨床上，放射治療可以作為早期、晚期肺癌的有意義的治療策略，特別是對于有手術高風險的肺癌患者。然而，有部分患者，放射治療之后，仍然會發(fā)生腫瘤復發(fā)和遠處轉移的風險，降低放療療效，這其中原因之一就是腫瘤內存在一部分亞細胞克隆，具有放療抵抗性。因而，放療抵抗已成為臨床上治療肺癌患者所面臨的主要挑戰(zhàn)，而闡明肺癌細胞放療抵抗的調控機理，有助于開發(fā)有效的放療增敏劑。

DNA損傷反應(DNA damage response，DDR)是真核細胞中重要的生命活動過程，其在蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)、核轉錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、JAK家族酪氨酸激酶(janus activated kinase，JAK)等多條信號通路的調節(jié)作用下，來感應和傳遞刺激引起的DNA損傷信號，啟動DNA損傷修復反應(DNA-damage repair，DDR)，進行有效的DNA損傷修復或誘導細胞發(fā)生凋亡，維持基因組穩(wěn)定性和細胞內穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，異常的DNA損傷修復反應會影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療預后。損傷的DNA鏈如果未被正確修復就可能引起細胞內基因組不穩(wěn)定性，最終增加腫瘤發(fā)生的風險；同時，異常的DNA損傷修復能力也影響了腫瘤細胞對放化療的敏感性。探討DNA損傷修復機制，將有助于開發(fā)有效的DNA損傷修復干預策略，增加放化療的細胞毒性作用。

Akt在腫瘤細胞內異常活化，有利于成為了腫瘤治療的潛在靶點。作為重要的細胞內信號通路，Akt信號通路參與細胞增殖、凋亡、DNA損傷反應，進而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、放化療抵抗，而Akt抑制劑表現(xiàn)出有效的拮抗腫瘤活性。例如，Akt抑制劑MK-2206明顯地抑制了肺癌腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡。某些植物化學成分通過抑制Akt信號通路的活化，進而克服了腫瘤細胞的放療抵抗。另外，Akt抑制劑也能夠下調DNA損傷修復基因的磷酸化活化，增強放療誘導的DNA損傷和細胞死亡。因而，對Akt信號通路調節(jié)機制研究的成果正在轉化為腫瘤治療的新靶點。

香草木素(diosmetin)是豆科、橄欖科植物來源的黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，在體內外實驗中香草木素表現(xiàn)出良好的抗炎、抗腫瘤活性。在乳腺癌細胞中，香草木素通過誘導細胞色素P450的生物活化，進而導致抗乳腺癌活性。而且，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)香草木素也能導致肺癌細胞產生G1/S期阻滯，導致細胞凋亡。然而，尚未有香草木素在肺癌放療抵抗效應中的研究發(fā)現(xiàn)。因而，闡明香草木素增強肺癌細胞放療敏感性的具體分子機理，將有助于天然化合物香草木素開發(fā)成為制備肺癌細胞放療增敏藥物。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供香草木素作為放療抵抗肺癌細胞DNA損傷修復抑制劑和放療增敏劑的應用。所述化合物香草木素為植物來源的天然化合物，其放療增敏機制主要是改變細胞DNA損傷修復反應相關的生物標志物Akt、ATM、p53、γH2AX中的一種或幾種，優(yōu)選為磷酸化的Akt Ser473、ATM Ser1981、p53 Ser15和γH2AX中的一種或幾種。通過檢測這些特定的生物標志物的磷酸化水平，用于評價香草木素的抑制放療抵抗肺癌細胞DNA損傷修復能力和放療增敏效應。下面對本發(fā)明作進一步說明：

本發(fā)明確定了香草木素抑制細胞DNA損傷修復能力和增強肺癌放療敏感性的新的分子機制，明確香草木素的應用改變了細胞DNA損傷修復能力與肺癌細胞放療敏感性，評價香草木素作為新的DNA損傷修復抑制劑和肺癌放療增敏劑的可行性。

本發(fā)明研究探討了香草木素增強肺癌細胞放療敏感性的分子機制，結果顯示香草木素通過抑制Akt信號通路活性，進而下調DNA損傷修復能力，誘導肺癌細胞放療增敏。研究明確了香草木素應用于改變細胞DNA損傷修復水平與肺癌細胞放療敏感性的相關性。

本發(fā)明首先確定肺癌細胞A549/IR的放療抗性，克隆形成實驗和單擊多靶模型確認了A549/IR具有明顯的放療抗性表型。

通過細胞克隆形成實驗、細胞增殖實驗、細胞周期實驗等技術，分析香草木素對放療抵抗肺癌細胞A549/IR的抑制作用，結果發(fā)現(xiàn)香草木素顯著地抑制肺癌放療抵抗細胞A549/IR的增殖，誘導G1/S期細胞阻滯。當香草木素與放療聯(lián)合作用時，顯著提高了電子輻射(ionization radiation，IR)對肺癌細胞的細胞毒作用。

利用Western blot技術評價DNA損傷修復分子，特別是磷酸化的Akt Ser473、ATM Ser1981、p53 Ser15；利用熒光可視化的γH2AX技術評價DNA損傷效應。結果發(fā)現(xiàn)香草木素抑制DNA損傷修復相關分子的磷酸化水平(ATM Ser1981、p53 Ser15)，同時上調DNA損傷標記分子γH2AX的熒光信號。提示香草木素抑制了放療所引起的抵抗細胞系中DNA損傷修復能力，提示香草木素可以作為DNA損傷修復的抑制劑。

由于Akt信號參與DNA損傷反應，利用Western blot技術和Akt的抑制劑(LY294002、MK-2206)作為陽性對照，評價香草木素對Akt信號的影響。結果發(fā)現(xiàn)，香草木素能夠抑制放療抵抗細胞A549/IR中的Akt磷酸化水平(Akt Ser473)。同時，香草木素對放療引起的DNA損傷修復能力的抑制效應與Akt的抑制劑(LY294002、MK-2206)相似。進一步，聯(lián)合放療和香草木素，或者Akt的抑制劑(LY294002、MK-2206)，通過細胞增殖實驗分析發(fā)現(xiàn)香草木素和Akt的抑制劑(LY294002、MK-2206)均能夠增強肺癌細胞A549/IR的放療敏感性，且聯(lián)合作用更明顯。

總之，本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)香草木素能夠通過抑制放療引起的DNA損傷修復能力，進而增強肺癌細胞的放療敏感性。DNA損傷調控信號(Akt Ser473)、DNA損傷相關分子(ATM Ser1981、p53 Ser15)和熒光可視化的γH2AX變化是其作用的分子基礎，而細胞增殖、細胞周期、單擊多靶模型等功能變化是其作用的生物學表征。因此，肺癌細胞中DNA損傷反應相關的生物標志物Akt Ser473、ATM Ser1981、p53 Ser15、γH2AX的變化可以用來評估香草木素對腫瘤細胞DNA損傷修復能力的影響，細胞增殖、細胞周期、單擊多靶模型等功能試驗可以用來評價香草木素的放療增敏作用。

附圖說明

圖1為香草木素抑制肺癌放療抵抗細胞的增殖。A圖顯示不同放射劑量下，放療敏感細胞A549、肺癌放療抵抗細胞A549/IR的細胞克隆形成；B圖單擊多靶模型顯示A549/IR具有明顯的放療抵抗性；C圖顯示香草木素濃度依賴性的抑制放療抵抗細胞A549/IR的增殖率；D-E圖顯示香草木素抑制放療抵抗細胞系A549/IR的克隆形成。

圖2為香草木素誘導肺癌放療抵抗細胞A549/IR發(fā)生G1/S期阻滯。A圖流式細胞術顯示香草木素導致A549/IR G1/S期阻滯；B圖評價細胞周期檢測點相關分子變化，顯示香草木素抑制G1/S期細胞周期檢測點分子CDK4、CKD6、CyclinD1的表達，而對G2/M期檢測點CDC2的表達無影響。且與放療聯(lián)合作用時，這種細胞周期阻滯效應最明顯。

圖3為香草木素增強了肺癌放療抵抗細胞A549/IR的放療敏感性。A圖顯示香草木素增強了放療對A549/IR細胞增殖抑制效應；B-C圖顯示香草木素增強了放療對A549/IR細胞克隆形成能力的抑制效應。

圖4為香草木素抑制了肺癌放療抵抗細胞A549/IR中的細胞DNA損傷修復能力。A圖顯示香草木素增強了放療對A549/IR細胞中DNA損傷修復分子ATM Ser1981和p53 Ser15的抑制作用；B-C圖顯示香草木素增強了放療誘導A549/IR細胞中DNA損傷標記分子γH2AX的熒光信號。

圖5為香草木素通過Akt信號抑制放療抵抗細胞系的DNA損傷修復能力。A圖顯示香草木素對Akt信號(Akt Ser473磷酸化活化)的抑制作用；B圖顯示Akt抑制劑LY294002增強了放療對A549/IR細胞中DNA損傷修復能力(ATM Ser1981、p53 Ser15磷酸化活化)的抑制作用；C圖顯示Akt抑制劑MK-2206增強了放療對A549/IR細胞中DNA損傷修復能力(ATM Ser1981、p53 Ser15磷酸化活化)的抑制作用。

圖6為抑制Akt信號增強了肺癌細胞的放療敏感性。A圖顯示與放療聯(lián)用時，香草木素、LY294002均下調了A549/IR細胞中DNA損傷修復分子ATM Ser1981、p53 Ser15的磷酸化、上調DNA損傷標記分子γH2AX的表達；B圖顯示與放療聯(lián)用時，香草木素、MK-2206均下調了A549/IR細胞中DNA損傷修復分子ATM Ser1981、p53 Ser15的磷酸化、上調DNA損傷標記分子γH2AX的表達；C圖顯示香草木素、LY294002均能增強放療對A549/IR細胞的殺傷作用；D圖顯示香草木素、MK-2206均能增強放療對A549/IR細胞的殺傷作用。

圖中Un代表未處理組(Untreated group)，DIO代表香草木素，LY代表Akt抑制劑LY204002，MK代表Akt抑制劑MK-2206。

具體實施方式

本發(fā)明所用肺癌細胞系A549細胞為ATCC細胞系(CCL-185)，A549/IR細胞系為Emory University構建的放療抵抗細胞系。

實施例1香草木素抑制肺癌放療抵抗細胞系的增殖

實驗方法如下：首先分析A549/IR細胞的放療抗性表型，肺癌細胞系A549、A549/IR分別經過O、2、4、8Gy的不同放射劑量的照射處理，進行細胞克隆形成實驗和單擊多靶模型的分析，評價A549/IR細胞的放療抗性；然后分析香草木素對肺癌細胞系A549、A549/IR的毒性作用，0、5、10、25、50μM的香草木素處理細胞24h，進行細胞增殖實驗和克隆形成實驗分析。

結果顯示，在不同的放射劑量作用下，與放療敏感細胞A549相比，A549/IR細胞具有顯著的放療抗性表型。而香草木素能夠呈現(xiàn)濃度依賴性地抑制肺癌放療抵抗細胞的增殖率和克隆形成率(結果見圖1)。

實施例2香草木素導致肺癌放療抵抗細胞系G1/S期阻滯

細胞增殖受細胞周期的影響，而研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期檢測點分子CDK4、CKD6和CyclinD1調節(jié)細胞從G1期到S期的轉換，CDC2調節(jié)細胞從G2期到M期的轉換。

實驗方法如下：A549/IR細胞，在6Gy放療處理1h、10μM香草木素處理24h、6Gy放療與香草木素聯(lián)合處理24h的條件下，流式細胞術評價香草木素對A549/IR細胞周期分布的影響；Western blot檢測細胞周期檢測點分子CDK4、CKD6、CyclinD1、CDC2的表達。

結果顯示，香草木素單獨使用，或者與放療聯(lián)合使用，均能夠導致肺癌放療抵抗細胞A549/IR發(fā)生G1/S期阻滯。同時，顯著抑制G1/S期檢測點分子CDK4、CKD6、CyclinD1的蛋白表達水平，而不影響G2/M期檢測點分子CDC2的蛋白表達水平(結果見圖2)。

實施例3香草木素增強肺癌放療抵抗細胞系的放療敏感性

實驗方法如下：A549/IR細胞，在6Gy放療處理1h、10μM香草木素處理24h、6Gy放療與香草木素聯(lián)合處理24h的條件下，取1×10³狀態(tài)良好的細胞，接種于96孔板上，加入20μl的MTS試劑，孵育0、24、48、72h，于490nm的波長下測量吸光度值，計算細胞增殖率。取2×10³狀態(tài)良好的細胞，接種于六孔板上，CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-15天，冰甲醇固定15min，結晶紫染色，以≥50個細胞為一個克隆，計數(shù)每孔的細胞克隆數(shù)。以未處理組為對照，計算各組的克隆形成率。

結果顯示，香草木素單獨使用，或者與放療聯(lián)合使用，均能夠抑制肺癌放療抵抗細胞系的增殖率和克隆形成率，且聯(lián)合作用的抑制效果更明顯(結果見圖3)，提示香草木素有效地增加了肺癌細胞的放療敏感性。

實施例4香草木素抑制肺癌放療抵抗細胞系的DNA損傷修復能力

細胞內異常的DNA損傷修復能力，影響腫瘤細胞對放療的反應。我們接下來分析香草木素是否影響肺癌放療抵抗細胞的放療反應。

實驗方法如下：A549/IR細胞，在6Gy放療處理1h、10μM香草木素處理24h、6Gy放療與香草木素聯(lián)合處理24h的條件下，抽取細胞總蛋白，進行ATM Ser1981、p53 Ser15、γH2AX的Western Blot分析。取2×10²狀態(tài)良好的細胞，通過孵育γH2AX一抗和對應的熒光二抗，進行熒光顯微鏡細胞內γH2AX的熒光強度信號。

結果顯示，香草木素單獨使用，或者與放療聯(lián)合使用，均能夠導致肺癌放療抵抗細胞的DNA損傷修復能力發(fā)生變化：ATM Ser1981和p53 Ser15下調、γH2AX上調，同時增加A549/IR細胞中的γH2AX的熒光信號，且聯(lián)合作用的抑制效率更高(結果見圖4)，提示香草木素抑制了放療抵抗細胞系的DNA損傷修復能力。

實施例5Akt信號通路參與了肺癌放療抗性細胞中DNA損傷修復能力

實驗方法如下：A549/IR細胞，在6Gy放療處理1h、10μM香草木素處理24h、6Gy放療與香草木素聯(lián)合處理24h的條件下，抽取細胞總蛋白，進行Akt磷酸化水平(Akt Ser473)的Western Blot分析，評價香草木素對Akt信號的抑制作用。A549/IR細胞，在6Gy放療處理1h、10μM Akt抑制劑(LY204002或者MK-2206)處理24h、6Gy放療與Akt抑制劑(LY204002或者MK-2206)聯(lián)合處理24h的條件下，抽取細胞總蛋白，進行Akt磷酸化水平(Akt Ser473)、DNA修復能力相關分子(ATM Ser1981、p53 Ser15、γH2AX)的Western Blot分析，評價Akt信號對DNA損傷修復能力的影響。

結果顯示：香草木素能夠顯著抑制肺癌放療抗性細胞系中Akt Ser473的磷酸化水平，同時抑制Akt信號活化，能夠顯著抑制肺癌放療抗性細胞系中DNA損傷修復能力(ATM Ser1981和p53 Ser15下調、γH2AX上調)(結果見圖5)。

實施例6抑制細胞Akt信號，減弱DNA損傷修復能力，進而增強肺癌細胞的放療敏感性

實驗方法如下：A549/IR細胞，在6Gy放療處理1h、10μM香草木素聯(lián)合6Gy放療處理24h、10μM Akt抑制劑(LY294002、MK-2206)聯(lián)合6Gy放療處理24h、6Gy放療與香草木素/Akt抑制劑聯(lián)合處理24h的條件下，抽取細胞總蛋白，進行DNA損傷調控信號(Akt Ser473)、DNA損傷相關分子(ATM Ser1981、p53 Ser15、γH2AX)的Western Blot分析。取1×10³狀態(tài)良好的細胞，接種于96孔板上，加入20μl的MTS試劑，孵育0、24、48、72h，于490nm的波長下測量吸光度值，計算細胞增殖率。

結果顯示，聯(lián)合放療作用時，香草木素與Akt抑制劑(LY294002、MK-2206)，均能夠抑制肺癌放療抵抗細胞中DNA損傷修復能力，同時，明顯地抑制A549/IR細胞的增殖率。且香草木素/Akt抑制劑(LY294002、MK-2206)/放療三者聯(lián)合作用時，對A549/IR的毒性效果最好(結果見圖6)。