本發(fā)明屬于高分子材料的技術(shù)領(lǐng)域范疇，特別涉及到一種pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇的紫杉醇載藥體系的設(shè)計(jì)與合成。

背景技術(shù)：

納米技術(shù)(nanotechnology)是20世紀(jì)80年代末崛起的新科技，是研究結(jié)構(gòu)尺寸在1nm至1000nm范圍內(nèi)材料性質(zhì)和應(yīng)用的一種技術(shù)，適用于材料合成、生物和醫(yī)藥學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。目前，納米載體已成為藥學(xué)領(lǐng)域的重要研究熱點(diǎn)。它能夠解決藥物溶解性問(wèn)題，優(yōu)化藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征，延長(zhǎng)血液半衰期t_1/2，擴(kuò)大治療窗。此外，納米載體的被動(dòng)(enhanced permeability and retention,，EPR效應(yīng))和主動(dòng)靶向作用，使它具有腫瘤特異性，能在腫瘤局部富集，減小了對(duì)正常組織的毒性，提高了生物利用度。最典型的例子是紫杉醇，它不溶于水，靜脈給藥時(shí)需要使用毒性溶劑Cremophor-EL(蓖麻油和乙醇的混合物)增加溶解性，這種溶劑會(huì)引起嚴(yán)重的過(guò)敏和骨髓抑制等副作用。

目前，納米載體廣泛的用于常規(guī)化療藥物運(yùn)輸?shù)难芯?，如紫杉醇、順鉑、阿霉素、喜樹(shù)堿等，部分有價(jià)值的成果已經(jīng)進(jìn)展到臨床實(shí)驗(yàn)階段。但是在超效化療藥物納米載體的研究方面，由于藥物來(lái)源困難(非商業(yè)性)，基本處于空白階段。許多納米載體的關(guān)鍵問(wèn)題如載體的選擇、納米粒子構(gòu)建、抗腫瘤活性和毒性的系統(tǒng)評(píng)估、藥物代謝特征等都是未知數(shù)。

腫瘤部位的pH低于正常組織，大多數(shù)實(shí)體瘤的pH值小于6.5，低于周?chē)＝M織(pH為7.4)。腫瘤的細(xì)胞內(nèi)pH和正常組織相近，但細(xì)胞外pH比正常組織低，這就引起腫瘤與正常組織的跨膜pH梯度不同。同時(shí)，細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)、核內(nèi)體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體及細(xì)胞核都保持各自獨(dú)特的pH值，pH值從4.5(溶酶體)到8.0(線粒體)不等。納米載體可以通過(guò)摻入或者結(jié)合上pH敏感性物質(zhì)以達(dá)到將大分子高效傳遞到相關(guān)細(xì)胞及在細(xì)胞內(nèi)準(zhǔn)確定位的效果。

pH敏感型納米載體的物理性質(zhì)例如膨脹或退脹、粒子的分散和聚集都對(duì)環(huán)境條件的變化產(chǎn)生響應(yīng)。這些物理性質(zhì)的改變也會(huì)使納米載體與細(xì)胞之間的相互作用發(fā)生改變，從而導(dǎo)致藥物在腫瘤部位不同速度的釋放。但是，目前pH敏感型納米載體關(guān)于控釋機(jī)制、聚合物的選擇、毒理學(xué)等方面仍然不成熟。

本專(zhuān)利擬合成新型具有生物相容性、生物降解性和pH與非pH敏感型的納米粒子作為載體用于腫瘤靶向的藥物運(yùn)輸。該納米微球載體以葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇為基本結(jié)構(gòu)，分別接上甲氧基丙烯、丙酸酐使其擁有pH敏感性和非pH敏感性，這些結(jié)構(gòu)能使載體擁有良好的生物相容性和生物降解性。同時(shí)，本專(zhuān)利還以紫杉醇為例，從細(xì)胞、動(dòng)物水平，闡述納米紫杉醇的抗腫瘤活性及毒性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的是為克服現(xiàn)有技術(shù)不足而提供的一種抗腫瘤的pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇納米微球載體的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇納米微球載體，具有下述式結(jié)構(gòu)：

其中n>1、m>1、X>1

所述的pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇納米載體，包含步驟：

1)以式I所示的聚乙二醇和聚乳酸為原料，在辛酸亞錫的作用下，聚合形成式II所示的聚乳酸-聚乙二醇聚合物

其中n>1、m>1

2)所述式II的聚乳酸-聚乙二醇聚合物與丁二酸酐的作用形成式III所示的羧酸化的聚乳酸-聚乙二醇聚合物衍生物

其中n>1、m>1

3)所述式III的羧酸化的聚乳酸-聚乙二醇聚合物衍生物與葡聚糖、N,N'-羰基二咪唑(CDI)的作用下形成式IV所示的的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇聚合物

其中n>1、m>1、X>1

4)所述式IV的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇聚合物分別與甲氧基丙烯、丙酸酐得到pH敏感V和非pH敏感VI的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇納米載體

5)所述式pH敏感V和非pH敏感VI的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇納米載體負(fù)載不同比例的紫杉醇。

所述的方法，其特征在于步驟1)中的開(kāi)環(huán)反應(yīng)溫度在90-140℃，反應(yīng)時(shí)間8-12h。

所述的方法，其特征在于步驟2)中的丁二酸酐與所述式II的聚乳酸-聚乙二醇聚合物的摩爾比為0.8-1.5。

所述的方法，其特征在于步驟3)中的聚乳酸-聚乙二醇聚合物衍生物與葡聚糖聚合物的摩爾比為0.8-1.3。聚乳酸-聚乙二醇聚合物衍生物與N,N'-羰基二咪唑(CDI)摩爾比為0.8-1.3。

所述的方法，其特征在于步驟4)中的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇聚合物與甲氧基丙烯的反應(yīng)時(shí)間為2-4h，葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇聚合物與丙酸酐反應(yīng)時(shí)間為3-24h。

所述的方法，其特征在于步驟5)中的重量配比組分為3-20％的紫杉醇、80-97％的載藥材料混合組成，特征步驟包括：配藥、溶藥、稀釋、純化、過(guò)濾、干燥。

有益效果：

1、本發(fā)明的是為克服現(xiàn)有技術(shù)不足而提供的一種抗腫瘤的pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇納米微球載體的制備方法，該納米載體制備方法簡(jiǎn)單，毒性小、較高的載藥率，原料廉價(jià)易得，制備過(guò)程操作簡(jiǎn)單，適合用做臨床藥物的載體。

2、采用高分子化學(xué)合成方法，以價(jià)廉易得的聚乙二醇為起始原料，與乳酸開(kāi)環(huán)聚、甲氧基丙烯、丙酸酐通過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)制備pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇納米載體，通過(guò)對(duì)紫杉醇進(jìn)行負(fù)載，驗(yàn)證了負(fù)載紫杉醇的納米載體對(duì)治療腫瘤效果的作用。

附圖說(shuō)明

1.圖1是本發(fā)明提供的一種抗腫瘤的pH敏感和非pH敏感載藥微球的制備方法流程示意圖。

2.圖2是納米TEM圖，其中圖2a是本發(fā)明的pH敏感型納米載藥微球的納米TEM圖；圖2b是本發(fā)明的非pH敏感型納米載藥微球的納米TEM圖。

3.圖3是紅外圖，其中圖3a為本發(fā)明的pH敏感型納米載藥微球的紅外圖；圖3b為本發(fā)明的非pH敏感型納米載藥微球的紅外圖。

4.圖4是本發(fā)明的負(fù)載紫杉醇的非pH敏感載藥微球、本發(fā)明的負(fù)載紫杉醇的pH敏感載藥微球、紫杉醇在不同濃度紫杉醇條件下的細(xì)胞抑制率圖。

5.圖5是本發(fā)明的pH敏感和非pH敏感載藥微球的抑瘤的效果評(píng)價(jià)圖，其中圖5a為高劑量組；圖5b為低劑量組。

具體實(shí)施方式

一種抗腫瘤的pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇的紫杉醇載藥微球的制備方法，其具體步驟如下：

實(shí)施例1:

(1)mPEG-PLA的合成

mPEG(2.4g，0.48mmol)，D，L-lactide(2g,13.8mmol)和Sn(Oct)₂(0.2％，w/w)，140℃油浴的條件下攪拌反應(yīng)8h。將反應(yīng)液傾倒入冰水浴中，向其中加入二氯甲烷來(lái)提取反應(yīng)液中的聚合物，分離有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液用乙醚與甲醇的混合液進(jìn)行沉降，過(guò)濾收集濾渣，干燥得白色固體。

(2)mPEG-PLA-COOH的合成

mPEG-PLA(500mg)溶解在無(wú)水DMSO中，向上述反應(yīng)液中依次加入丁二酸酐(500mg)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)(10mg)，三乙胺(0.2mL)，混合液室溫下攪拌5小時(shí)后，反應(yīng)液用分子量3.5K的透析膜在去離子水中透析3天，透析液在-50℃條件下凍干，得到白色粉末狀產(chǎn)物。

(3)Dextran-mPEG-PLA合成

將葡聚糖(Mr＝6K，200mg)，mPEG-PLA-COOH(200mg)，N，N’-羰基二咪唑(CDI)(5mg，物質(zhì)的量比CDI:COOH＝1.2:1)溶解在無(wú)水DMSO中。將混合液置于60℃攪拌過(guò)夜。進(jìn)一步提純，將反應(yīng)混合液用分子量3.5K的透析膜在去離子水中進(jìn)行透析，透析3天。透析后的溶液在-50℃條件下凍干，最終得到白色粉末狀產(chǎn)物。

(4)Acetalated-Dextran-PEG-PLA(ADP)納米粒子的制備

Dextran-PEG-PLA(50mg)，甲氧基丙烯(1mL)，吡啶-苯磺酸(5mg)加入到無(wú)水DMSO中，混合均勻。反應(yīng)液在室溫下攪拌反應(yīng)3小時(shí)。多余的甲氧基丙烯減壓旋轉(zhuǎn)蒸除去，進(jìn)一步提純，將反應(yīng)混合液用分子量3.5K的透析膜在PBS(pH7.4)中進(jìn)行透析，透析3天。透析液在-50℃條件下凍干，得到白色粉末狀產(chǎn)物。

(5)丙酸酐改性的Dextran-PEG-PLA(PDP)納米粒子的制備

Dextran-PEG-PLA(50mg)，丙酸酐(0.5mL)，N,N-二甲基吡啶(DMAP)(10mg)，三乙胺(0.1mL)加入到無(wú)水DMSO中，混合均勻。反應(yīng)液在室溫下攪拌反應(yīng)5小時(shí)。進(jìn)一步提純，將反應(yīng)混合液用分子量3.5K的透析膜在去離子水中進(jìn)行透析，透析3天。透析液在-50℃條件下凍干，得到白色粉末狀產(chǎn)物。

(6)ADPP-taxol和PDPP-taxol Nanoparticles的合成

ADPP-taxol Nanoparticles的制備：將ADP(10mg)和taxol的(2mg)溶解在DMSO(2mL)中。將反應(yīng)混合液用分子量3.5K的透析膜在PBS(pH＝7.4)中進(jìn)行透析，透析24小時(shí)，透析液在-50℃條件下凍干，PDPP-taxol納米顆粒的制備反應(yīng)同上。圖3紅外圖中1585.30nm是紫杉醇的苯環(huán)特征峰，證明了藥物已經(jīng)被包裹。

實(shí)施例2:

(1)mPEG-PLA的合成

mPEG(5g,1mmol)，D，L-lactide(4g,27.6mmol)和Sn(Oct)₂(0.2％，w/w)，90℃油浴的條件下攪拌反應(yīng)12h。將反應(yīng)液傾倒入冰水浴中，向其中加入三氯甲烷來(lái)提取反應(yīng)液中的聚合物，分離有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液用乙醚與甲醇的混合液進(jìn)行沉降，過(guò)濾收集濾渣，干燥得白色固體。

(2)mPEG-PLA-COOH的合成

mPEG-PLA(500mg)溶解在無(wú)水DMSO中，向上述反應(yīng)液中依次加入丁二酸酐(500mg)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)(10mg)，三乙胺(0.2mL)，混合液室溫下攪拌5小時(shí)后，反應(yīng)液用分子量3.5K的透析膜在去離子水中透析3天，透析液在-50℃條件下凍干，得到白色粉末狀產(chǎn)物。

(3)Dextran-mPEG-PLA合成

將葡聚糖(Mr＝6K，250mg)，mPEG-PLA-COOH(200mg)，N，N’-羰基二咪唑(CDI)(5mg，物質(zhì)的量比CDI:COOH＝1.2:1)溶解在無(wú)水DMSO中。將混合液置于60℃攪拌過(guò)夜。進(jìn)一步提純，將反應(yīng)混合液用分子量3.5K的透析膜在去離子水中進(jìn)行透析，透析3天。透析后的溶液在-50℃條件下凍干，最終得到白色粉末狀產(chǎn)物。

(4)Acetalated-Dextran-PEG-PLA(ADP)納米粒子的制備

Dextran-PEG-PLA(50mg)，甲氧基丙烯(0.5mL)，吡啶-苯磺酸(5mg)加入到無(wú)水DMSO中，混合均勻。反應(yīng)液在室溫下攪拌反應(yīng)5小時(shí)。多余的甲氧基丙烯減壓旋轉(zhuǎn)蒸除去，進(jìn)一步提純，將反應(yīng)混合液用分子量3.5K的透析膜在PBS(pH7.4)中進(jìn)行透析，透析3天。透析液在-50℃條件下凍干，得到白色粉末狀產(chǎn)物。

(5)丙酸酐改性的Dextran-PEG-PLA(PDP)納米粒子的制備

Dextran-PEG-PLA(50mg)，丙酸酐(1mL)，N,N-二甲基吡啶(DMAP)(10mg)，三乙胺(0.1mL)加入到無(wú)水DMSO中，混合均勻。反應(yīng)液在室溫下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。進(jìn)一步提純，將反應(yīng)混合液用分子量3.5K的透析膜在去離子水中進(jìn)行透析，透析3天。透析液在-50℃條件下凍干，得到白色粉末狀產(chǎn)物。

(6)ADPP-taxol和PDPP-taxol Nanoparticles的合成

ADPP-taxol Nanoparticles的制備：將ADP(10mg)和taxol的(1mg)溶解在DMSO(2mL)中。將反應(yīng)混合液用分子量3.5K的透析膜在PBS(pH＝7.4)中進(jìn)行透析，透析24小時(shí)，透析液在-50℃條件下凍干，PDPP-taxol Nanoparticles的制備反應(yīng)同上。TEM結(jié)果見(jiàn)圖2a和圖2b。

體外細(xì)胞毒性分析

通過(guò)進(jìn)行細(xì)胞毒性分析來(lái)測(cè)試free taxol，ADPP-taxol以及PDPP-taxol nanoparticles對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。在進(jìn)行藥物處理的前一晚，將生長(zhǎng)在含有10％FBS的培養(yǎng)液中的KB-3-1細(xì)胞按照一個(gè)孔洞5000個(gè)細(xì)胞的密度種到96孔板中。taxol，ADPP-taxol以及PDPP-taxol nanoparticles的樣品溶液用培養(yǎng)基稀釋使taxol得濃度在3.75–60ng/mL范圍內(nèi)。結(jié)果見(jiàn)圖4，與單獨(dú)使用紫杉醇相比，用pH敏感和非pH敏感載藥微球負(fù)載紫杉醇后，藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷性明顯降低，體外細(xì)胞毒性減小。

體內(nèi)抗腫瘤療效分析

實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物被飼養(yǎng)在正常狀態(tài)下，保持12小時(shí)晝夜交替，并給予充足的水和食物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(年齡四到六周，雄性)所有的過(guò)程都經(jīng)由埃默里大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。通過(guò)向小鼠的右背注射濃度為每100μl含有5000KB-3-1細(xì)胞的懸液使小鼠攜帶KB-3-1。將完成注射的小鼠隨機(jī)分成八個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組五只小鼠。四組高劑量組：空白對(duì)照組、Taxol組、ADPP-taxol NPs組、PDPP-taxolNPs組，每組注射劑量按taxol的注射量為20mg/Kg計(jì)算。四組低劑量組：空白對(duì)照組、Taxol組、ADPP-taxol NPs組、PDPP-taxol NPs組，每組注射劑量按taxol的注射量為10mg/Kg計(jì)算。在開(kāi)始處理前，小鼠身上的腫瘤需要生長(zhǎng)到100-200mm³。對(duì)小鼠進(jìn)行處理，先以每周兩次的頻率處理五次，后以每周一次的頻率處理四次。腫瘤的大小在每次注射前測(cè)量，通過(guò)用游標(biāo)卡尺測(cè)量長(zhǎng)和寬，并根據(jù)公式：體積＝長(zhǎng)*寬*寬/2進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)圖5a和圖5b，無(wú)論是高劑量組還是低劑量組，pH敏感和非pH敏感的納米載藥微球負(fù)載紫杉醇后，抑瘤效果與單獨(dú)的紫杉醇相比相差不多甚至有比較明顯的優(yōu)勢(shì)。