技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因表達調(diào)控領(lǐng)域，具體涉及一種用于調(diào)高PTEN基因表達的多肽復(fù)合物的制備方法。
背景技術(shù)：
：PTEN是第一個同時兼具脂質(zhì)和蛋白雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，于1997年從人類第10q23.3染色體位點分離并得到，可參與細胞周期調(diào)控并抑制腫瘤細胞增殖及促進腫瘤細胞凋亡。在研究新的抗癌藥物時，可以其是否可以調(diào)高PTEN的表達來進行。目前，在研究可以調(diào)高PTEN表達的試劑或者組合物領(lǐng)域中，多直接將各組分直接進行混合，不僅效率較低，而且不利于實際應(yīng)用。另一方面，據(jù)發(fā)明所知，目前尚未發(fā)現(xiàn)設(shè)計特定多肽來實現(xiàn)調(diào)控PTEN表達的報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：根據(jù)本領(lǐng)域的需求和現(xiàn)有技術(shù)的缺點和技術(shù)空白，本發(fā)明的目的在于提供一種用于調(diào)高PTEN基因表達的多肽復(fù)合物的制備方法，所述方法為：（1）制備聚合物顆粒，所述聚合物為PLA或PCL；所述聚合物顆粒中包埋有質(zhì)量分數(shù)為0.5-0.8%的雷公藤甲素；（2）將步驟（1）所得顆粒與多肽混合，所述多肽的序列如SEQIDNO.1所示；所述顆粒的粒徑為1-3μm，所述顆粒與多肽的質(zhì)量比為1000-5000:1。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當將本發(fā)明所述的多肽與本發(fā)明所述聚合物顆?；旌蠒r，可以顯著的調(diào)高PTEN的表達。本發(fā)明所述聚合物顆粒中的雷公藤甲素可以緩慢的釋放，且包埋量僅需0.5-0.8%。值得說明的是，本發(fā)明所用的聚合物具有很好生物相容性，所制備得到的復(fù)合物可以直接注射至腫瘤部位。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，當不包埋雷公藤甲素時，對PETN幾乎不產(chǎn)生調(diào)控作用。其中的機制還需進一步的研究。優(yōu)選的，步驟（1）中，雷公藤甲素的質(zhì)量分數(shù)為0.55%。優(yōu)選的，所述顆粒與多肽的質(zhì)量比為2000-4000:1。更優(yōu)選的，所述顆粒與多肽的質(zhì)量比為3500:1。所述聚合物為聚乳酸（PLA）。優(yōu)選的，所述PLA的分子量為5000-8000。更優(yōu)選的，所述PLA的分子量為6000。當PLA的分子量如上述范圍時，在制備顆粒時較為容易且粒徑較為可控；當分子量為6000時最好。本發(fā)明的有益效果：1、本發(fā)明可以顯著的調(diào)高PTEN的表達，可以有效的實現(xiàn)抑瘤效果；2、本發(fā)明對藥物的使用量很小，可大幅度的降低藥物的相關(guān)副作用。具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述
發(fā)明內(nèi)容所做出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例1（1）制備聚合物顆粒，所述聚合物為PLA（分子量為6000）；所述聚合物顆粒中包埋有質(zhì)量分數(shù)為0.55%的雷公藤甲素；（2）將步驟（1）所得顆粒與多肽混合，所述多肽的序列如SEQIDNO.1所示；所述顆粒的粒徑為1-3μm，所述顆粒與多肽的質(zhì)量比為3500:1。實施例2（1）制備聚合物顆粒，所述聚合物為PLA（分子量為5000）；所述聚合物顆粒中包埋有質(zhì)量分數(shù)為0.8%的雷公藤甲素；（2）將步驟（1）所得顆粒與多肽混合，所述多肽的序列如SEQIDNO.1所示；所述顆粒的粒徑為1-3μm，所述顆粒與多肽的質(zhì)量比為5000:1。實施例3（1）制備聚合物顆粒，所述聚合物為PLA（分子量為8000）；所述聚合物顆粒中包埋有質(zhì)量分數(shù)為0.5%的雷公藤甲素；（2）將步驟（1）所得顆粒與多肽混合，所述多肽的序列如SEQIDNO.1所示；所述顆粒的粒徑為1-3μm，所述顆粒與多肽的質(zhì)量比為1000:1。實施例4（1）制備聚合物顆粒，所述聚合物為PCL（分子量為5000）；所述聚合物顆粒中包埋有質(zhì)量分數(shù)為0.6%的雷公藤甲素；（2）將步驟（1）所得顆粒與多肽混合，所述多肽的序列如SEQIDNO.1所示；所述顆粒的粒徑為1-3μm，所述顆粒與多肽的質(zhì)量比為3000:1。實驗例取對數(shù)生長期Lewis肺癌細胞，胰酶消化后離心收集細胞（1800r/min離心5min），用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸洗滌并調(diào)整細胞濃度為1×107個/mL，用1mL注射器吸取細胞懸液0.2mL（含細胞數(shù)2×106個）注射于C57BL/6小鼠左側(cè)腋部皮下，建立小鼠皮下移植瘤動物模型。接種10d后，檢測小鼠成瘤狀況，將符合要求的成瘤小鼠分為實驗組和對照組，各組均在接種10d后晨起空腹給藥。①對照組：0.2mL/10g0.9%氯化鈉溶液灌胃10d，并分別在第1、3、5天腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.4mL；②實驗組（實施例1-4）：0.02g·復(fù)合物/10g灌胃10d，并分別在第1、3、5天腹腔注射0.4mL；稱取瘤質(zhì)量，計算抑瘤率給藥第11天處死小鼠，完整剝?nèi)∫覆科は履[瘤組織，精密電子天平稱重，分別計算各組抑瘤率，抑瘤率（%）=（對照組平均瘤質(zhì)量-實驗組平均瘤質(zhì)量/對照組平均瘤質(zhì)量）×100%。Westernblot法檢測腫瘤組織PTEN蛋白表達剪取腫瘤組織約0.1g，加入RIPA細胞裂解液1mL（內(nèi)含1mmol/LPMSF）進行裂解，離心收集組織總蛋白樣品。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白組分，將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗（PTEN：500倍稀釋）4℃孵育過夜，再加入HRP標記的二抗（1∶10000比例稀釋），室溫封閉2h，洗滌干凈，ECL顯色后膠片曝光并用ImageJ軟件分析結(jié)果。稱取腫瘤組織0.1g液氮研磨，加入1mLTrizol提取總RNA。根據(jù)RevertAidTMfirstStrandcDNASynthesisKit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA作為熒光定量模板，按照特定的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行擴增，引物序列是Forwardprimer5’-TTTGGTCACCCTTTGAGTCC-3’，Reverseprimer5’-GCTTTTACCTAGGGGGCAAG-3’，以β-actin作為內(nèi)參，RelativeQuantificationStudy為分析方法，最終計算取2-△△Ct。實驗結(jié)果如表1和表2所示。表1抑瘤率實施例1實施例2實施例3實施例4對比實施例1對比實施例2抑瘤率（%）66.159.462.268.49.75.5表2PTEN蛋白、PTENmRNA的表達實施例1實施例2實施例3實施例4對照組PTEN蛋白2.152.112.031.830.23PTENmRNA3.633.573.353.561.05序列表SEQIDNO.1YKKQQCRRCRYRR當前第1頁1 2 3