本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種兔的視網(wǎng)膜色素變性模型的制備方法。

背景技術(shù)：

視網(wǎng)膜色素變性是當(dāng)前主要致盲性疾病之一。視網(wǎng)膜色素變性是一種進(jìn)行性退行視網(wǎng)膜變性類疾病，它主要累及光感受器和色素上皮功能，是一種遺傳性眼病。目前視網(wǎng)膜色素變性仍無(wú)明確有效的治療藥物和治療方法，開發(fā)穩(wěn)定可重復(fù)的理想的動(dòng)物模型是解決相關(guān)研究和藥物臨床前藥物評(píng)價(jià)的關(guān)鍵。

兔眼球大，背景數(shù)據(jù)清晰、豐富，是適合眼科研究及臨床前藥物評(píng)價(jià)。碘酸鈉進(jìn)入眼循環(huán)后可破壞視網(wǎng)膜色素上皮。目前已有利用兔通過(guò)靜脈注射碘酸鈉誘導(dǎo)建立視網(wǎng)膜色素變性疾病模型，靜脈注射碘酸鈉方法雖然操作更簡(jiǎn)單，但由于碘酸鈉隨靜脈血液回流，再通過(guò)心臟進(jìn)入機(jī)體各組織，進(jìn)入眼組織的碘酸鈉只是很少一部分，為到達(dá)視網(wǎng)膜色素變性的要求，必須給予較高劑量的碘酸鈉，在該條件下可見(jiàn)明顯的全身毒性，特別是肝臟、腎臟以及消化道，極易引起動(dòng)物某種或多種臟器障礙或衰竭，最終導(dǎo)致動(dòng)物死亡。靜脈注射碘酸鈉的方法，其引起視網(wǎng)膜色素變性的劑量與動(dòng)物致死劑量相近，加上動(dòng)物個(gè)體間體質(zhì)差異，導(dǎo)致成模率低，重復(fù)性差，動(dòng)物易死亡。1996年陳勤等，在“表皮生長(zhǎng)因子治療碘酸鈉誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮層掃描電鏡觀察”（眼科研究，第4期）文章中報(bào)道了通過(guò)耳緣靜脈給新西蘭兔注入10 mg/ml碘酸鈉（劑量30 mg/kg）誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素變性，但該方法劑量偏低，故需要重復(fù)注射，而且重復(fù)注射間隔時(shí)間對(duì)結(jié)果影響較大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種兔的視網(wǎng)膜色素變性模型的制備方法，能用于視網(wǎng)膜色素變性的研究和治療藥物開發(fā)及臨床前評(píng)價(jià)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種兔的視網(wǎng)膜色素變性模型的制備方法，包括步驟為：將碘酸鈉溶液以頸內(nèi)動(dòng)脈注入的方式實(shí)施于兔，所述碘酸鈉溶液到達(dá)兔的眼內(nèi)。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述碘酸鈉溶液是濃度為10 mg/ml的劑量為15 mg/kg的碘酸鈉溶液；所述碘酸鈉溶液由生理鹽水配制。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述兔的視網(wǎng)膜色素變性模型的制備方法的具體步驟為：將兔的頸動(dòng)脈暴露，阻斷兔的頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，將所述碘酸鈉溶液注入頸內(nèi)動(dòng)脈，注射結(jié)束后解除兔的頸外動(dòng)脈阻斷，再解除兔的頸總動(dòng)脈阻斷。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述碘酸鈉溶液經(jīng)頸總動(dòng)脈注入兔的頸內(nèi)動(dòng)脈，推注時(shí)間為25-35秒。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，解除兔的頸外動(dòng)脈阻斷后，45~90秒后再解除兔的頸總動(dòng)脈阻斷。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，注射結(jié)束后用止血海綿壓迫注射點(diǎn)5~10分鐘止血。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明使用的碘酸鈉劑量小，對(duì)動(dòng)物全身毒性小，不影響動(dòng)物生命安全，操作簡(jiǎn)單可行，可重復(fù)性好，個(gè)體間模型差異小，成功率高。能為視網(wǎng)膜色素變性的研究提供一種可靠的模型，同時(shí)為治療視網(wǎng)膜色素變性藥物研發(fā)和臨床前評(píng)價(jià)提供了動(dòng)物模型。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中：

圖1 是本發(fā)明兔的術(shù)前、術(shù)后3天、10天、3周、5周光相干斷層掃描（OCT）圖；

圖2 是本發(fā)明兔的術(shù)前、術(shù)后3天、10天、3周、5周視網(wǎng)膜電流圖（ERG）暗適應(yīng)0.01結(jié)果圖；

圖3 是本發(fā)明兔的術(shù)前、術(shù)后3天、10天、3周、5周視網(wǎng)膜電流圖（ERG）暗適應(yīng)3.0結(jié)果圖；

圖4 是本發(fā)明兔的術(shù)前、術(shù)后3天、10天、3周、5周視網(wǎng)膜電流圖（ERG）暗適應(yīng)10.0結(jié)果圖；

圖5 是本發(fā)明兔的術(shù)前、術(shù)后3天、10天、3周、5周眼底照相圖；

圖6 是本發(fā)明兔的術(shù)前、術(shù)后3天、10天、3周、5周眼底熒光造影圖；

圖7 是本發(fā)明兔的視網(wǎng)膜組織病理學(xué)HE染色圖（200×）；

圖8是本發(fā)明兔的腎臟組織病理學(xué)HE染色圖（100×）。

具體實(shí)施方式

下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

提供一種兔的視網(wǎng)膜色素變性模型的制備方法，具體見(jiàn)下：

一、實(shí)驗(yàn)主要試劑：

熒光素鈉注射液（廣州白云山明興制藥有限公司）、碘酸鈉（Sigma公司，美國(guó)）。

二、主要儀器

光相干斷層掃描儀（海德堡公司，德國(guó)）、眼底數(shù)碼照相機(jī)（重慶康華瑞明）、眼電生理儀（Diagnosys，美國(guó)）。

三、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

兔購(gòu)于青島康大生物科技有限公司；8只，14周齡，體重2.5~3 kg。

（1）動(dòng)物飼養(yǎng)與管理

動(dòng)物飼養(yǎng)與管理按照昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司的SOP執(zhí)行，同時(shí)遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南第8版（Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council; National Academy Press, Washington, D.C., 2010）和動(dòng)物福利管理?xiàng)l例（Public Law 99-198）。昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)（IACUC）批準(zhǔn)已經(jīng)通過(guò)國(guó)際AAALAC組織的認(rèn)證。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用獲得了江蘇省科技廳的批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK (蘇) 2011-0029。

動(dòng)物飼養(yǎng)于具有環(huán)境控制的普通級(jí)動(dòng)物房，聚丙烯塑料籠具（規(guī)格為長(zhǎng)×寬×高＝530 mm×630mm×320 mm），單籠飼養(yǎng)，通風(fēng)良好，除了需要禁食的情況外，動(dòng)物自由攝食和飲水。動(dòng)物房室溫控制在18-26℃，相對(duì)濕度控制在40-70%，光照12 小時(shí)明暗交替。

（2）動(dòng)物福利

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循公眾認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予麻醉劑避免或減少動(dòng)物疼痛、緊張和不舒服。實(shí)驗(yàn)涉及的所有動(dòng)物處理相關(guān)內(nèi)容已由昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)（IACUC）批準(zhǔn)。

四、試驗(yàn)方法

對(duì)頸內(nèi)動(dòng)脈給予碘酸鈉誘導(dǎo)青紫藍(lán)兔視網(wǎng)膜色素變性，具體步驟為：

8只青紫藍(lán)兔分為2組，4只右側(cè)頸動(dòng)脈注射15 mg/kg碘酸鈉（10 mg/ml），4只做正常對(duì)照。

將兔仰面固定于手術(shù)臺(tái)上，盡量暴露頸部，進(jìn)行常規(guī)的皮膚消毒。用動(dòng)脈夾夾住兔的頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈進(jìn)行阻斷。將濃度為10 mg/ml的劑量為15 mg/kg的碘酸鈉溶液經(jīng)頸總動(dòng)脈注入兔的頸內(nèi)動(dòng)脈，所述碘酸鈉溶液由生理鹽水配制。注射時(shí)經(jīng)頸總動(dòng)脈穿刺推注，推注時(shí)間持續(xù)約30秒。推注結(jié)束后解除兔的頸外動(dòng)脈阻斷，繼續(xù)保持頸總動(dòng)脈阻斷，45~90秒后解除阻斷。注射結(jié)束使用止血海綿壓迫注射點(diǎn)5~10分鐘止血。頸動(dòng)脈注射后3天、10天、3周、5周進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖檢測(cè)、光相干斷層掃描（OCT）、眼底照相、眼底熒光造影檢查，5周進(jìn)行眼球、心臟、肝臟、腎臟病理。

五、試驗(yàn)結(jié)果

（1）動(dòng)物死亡情況：試驗(yàn)期間未見(jiàn)動(dòng)物死亡。

（2）光相干斷層掃描（OCT）：結(jié)果見(jiàn)圖1。

光相干斷層掃描（OCT）結(jié)果顯示，注射碘酸鈉3天后視網(wǎng)膜色素上皮層和視網(wǎng)膜感受器開始受到破壞，并逐漸加重。

（3）視網(wǎng)膜電流圖（ERG）：結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3和圖4。

視網(wǎng)膜電流圖（ERG）結(jié)果顯示，注射碘酸鈉3天后視網(wǎng)膜電流圖暗適應(yīng)0.01、暗適應(yīng)3.0和暗適應(yīng)10.0 a波及b波振幅均明顯下降，注射碘酸鈉10天時(shí)視網(wǎng)膜電流圖呈熄滅性，3周~5周暗適應(yīng)3.0和暗適應(yīng)10.0 b波有輕度恢復(fù)。

（4）眼底照相及眼底熒光造影：結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

眼底照相和眼底熒光造影結(jié)果顯示，注射碘酸鈉10天后可見(jiàn)明顯的視網(wǎng)膜色素上皮層色素紊亂，色素沉積。

（5）組織病理學(xué)結(jié)果：結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。

眼球HE染色結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜色素上皮紊亂、丟失，感受器細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣，同時(shí)內(nèi)核層和外核層細(xì)胞也受到破壞。

肝臟和心臟未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)，個(gè)別動(dòng)物腎臟可見(jiàn)腎臟毒性，顯微鏡下的癥狀主要表現(xiàn)為間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管/集合管擴(kuò)張、嗜堿性腎小管、間質(zhì)纖維化、髓質(zhì)灶狀壞死，但發(fā)生率低。

六、結(jié)論

以上結(jié)果表明，將碘酸鈉按15 mg/kg的劑量注入兔頸內(nèi)動(dòng)脈，到達(dá)眼內(nèi)，破壞視網(wǎng)膜色素上皮，造成兔視網(wǎng)膜色素上皮損傷，可建立穩(wěn)定的兔視網(wǎng)膜色素變性模型。

以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。