本發(fā)明屬于脫細胞支架組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種脫細胞膠原凝膠微球支架的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

脫細胞支架是常見的組織工程支架。脫細胞支架的來源主要有天然組織和體外組織工程。但是都存在一些問題。由于來源問題，人源天然組織比較少見。大多采用異種來源，豬眼角膜，牛心包等產(chǎn)品都非常常見。但是，異種來源的組織，更加容易出現(xiàn)排斥反應(yīng)。體外組織工程也可以獲得滿足一定功能的組織，比如脂肪、軟骨、骨，相比天然來源更加容易獲得和大批量生產(chǎn)。脫細胞是制備脫細胞支架最關(guān)鍵的一步，細胞的脫除和基質(zhì)以及生物因子的保存都非常重要。過分脫細胞，會導(dǎo)致基質(zhì)和因子被破壞，無法保留脫細胞支架的生物學(xué)性能。細胞脫除不干凈，殘余的dna等物質(zhì)會導(dǎo)致排斥反應(yīng)。常見的手段，就是將天然組織或者組織工程獲得的組織破碎成小塊，再進行脫細胞處理。破碎過程的發(fā)熱和機械力會導(dǎo)致包括生物因子的基質(zhì)和微細結(jié)構(gòu)變性或者被破壞。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種脫細胞膠原凝膠微球支架的制備方法，通過直接制備包裹細胞的膠原凝膠微球，在體外培養(yǎng)得到微米級的組織塊。在快速得到大量微米級組織的同時，能避免后續(xù)的破碎過程，可以直接進行脫細胞操作，更好的保留了組織中的基質(zhì)以及微細結(jié)構(gòu)。本發(fā)明目的通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種脫細胞膠原凝膠微球支架的制備方法，包括細胞-膠原混合液的制備，細胞-膠原凝膠微球的制備以及脫細胞膠原凝膠微球支架的制備。

作為本發(fā)明一種脫細胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個具體實施例，所述細胞-膠原混合液的制備為：將膠原溶液ph調(diào)節(jié)至6.5～7.5，并將細胞懸液均勻混合到膠原溶液中即得細胞-膠原混合液；所述細胞-膠原凝膠微球的制備為：將細胞-膠原混合液加入到油相溶液中，生成穩(wěn)定懸浮液后，提供合適的成膠條件使微球凝膠化，然后經(jīng)離心或過濾收集、清洗后即得細胞-膠原凝膠微球。

作為本發(fā)明一種脫細胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個具體實施例，所述脫細胞膠原凝膠微球支架的制備為：將上述制備的細胞-膠原凝膠微球在體外培養(yǎng)后收集所需的膠原凝膠微球，在液氮及水中反復(fù)冷凍-溶解1～10次，經(jīng)清洗ⅰ、震蕩ⅰ后將膠原凝膠微球加入到dnase1的水溶液中震蕩1～24h，最后經(jīng)清洗ⅱ、戊二醛處理及培養(yǎng)基清洗即得脫細胞膠原凝膠微球支架。本步驟中將dnase1的處理時間設(shè)定為1～24h小時，是因為當處理時間大于24小時會對基質(zhì)造成很大的破壞。

作為本發(fā)明一種脫細胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個具體實施例，所述戊二醛處理后還包括酒精浸泡及超聲處理，最后再用培養(yǎng)基清洗。

作為本發(fā)明一種脫細胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個具體實施例，所述液氮及水中反復(fù)冷凍-溶解前還包括用加有蛋白酶抑制劑的去離子水將凝膠微球清洗1～6次。

作為本發(fā)明一種脫細胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個具體實施例，所述水的溫度為25～37℃；所述清洗ⅰ為用0.1％～2％的tritonx-100水溶液中清洗1～3次；所述震蕩ⅰ為在100～1000rpm轉(zhuǎn)速下震蕩1～60min。

作為本發(fā)明一種脫細胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個具體實施例，所述dnase1的水溶液中dnase1的濃度為10～500units/ml；所述dnase1的水溶液中震蕩溫度為20～37℃，轉(zhuǎn)速為10～140rpm，并間隔0.5～12h更換一次新鮮dnase1溶液，每次更換dnase1溶液前用0.05％～2％的tritonx-100水溶液清洗0～5min。

作為本發(fā)明一種脫細胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個具體實施例，所述清洗ⅱ為采用edta溶液清洗0～10次；所述戊二醛處理為采用0.1％戊二醛處理0～24小時；所述酒精浸泡為采用用75％酒精浸泡0～1小時；所述超聲處理時間為0～10min。

本發(fā)明還提供一種脫細胞膠原凝膠微球支架，所述膠原凝膠微球支架采用上述制備方法制備得到。

本發(fā)明還提供所述脫細胞膠原凝膠微球支架的應(yīng)用，所述脫細胞凝膠微球支架在軟骨及軟骨下骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明通過直接制備包裹細胞的膠原凝膠微球，在體外培養(yǎng)得到微米級的組織塊。在快速得到大量微米級組織的同時，可以直接進行脫細胞操作，避免后續(xù)的破碎過程，更好的保留了組織中的基質(zhì)以及微細結(jié)構(gòu)。本發(fā)明制備的脫細胞膠原凝膠微球支架無dna殘留，可以將排斥反應(yīng)降到最低。本發(fā)明還提供所述脫細胞膠原凝膠微球支架的應(yīng)用，將其應(yīng)用于軟骨及軟骨下骨缺損修復(fù)。本發(fā)明脫細胞膠原凝膠微球支架尺寸為微米級別，將其應(yīng)用于軟骨及軟骨下骨缺損修復(fù)，有利于細胞的粘附及組織愈合，有利于后期形成均勻分布的組織，避免空心化現(xiàn)象，可以在關(guān)節(jié)鏡下操作減少手術(shù)創(chuàng)傷和后期感染的概率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明脫細胞膠原凝膠微球支架制備方法的流程圖。

圖2為實施例1制備的骨髓間充質(zhì)干細胞-膠原凝膠微球在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天、10天和15天的細胞狀態(tài)；

圖3為骨髓間充質(zhì)干細胞-膠原凝膠微球脫細胞前后的dapi染色，其中(a)表示脫細胞前，(b)表示脫細胞后；

圖4為脫細胞前后骨髓間充質(zhì)干細胞-膠原凝膠微球的tb染色，其中(a)表示脫細胞前，(b)表示脫細胞后；

圖5為脫細胞膠原凝膠微球支架種植骨髓間充質(zhì)干細胞得到的塊狀組織；

圖6為脫細胞膠原凝膠微球支架種植骨髓間充質(zhì)干細胞得到組織的fda染色；

圖7為脫細胞膠原凝膠微球支架種植骨髓間充質(zhì)干細胞得到組織的tb染色；

圖8為在關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)時，植入脫細胞膠原凝膠微球支架的操作示意圖；

圖9為對比例四種脫細胞流程處理方式得到的脫細胞支架樣品dapi染色。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例1

按以下步驟制備裝載骨髓間充質(zhì)干細胞的膠原凝膠微球

1、取濃度為15mg/ml的膠原溶液，在冰水浴中用少量1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph到7.0，稀釋膠原溶液到8mg/ml；

2、將提前準備好的骨髓間充質(zhì)干細胞，計數(shù)并且用α-mem培養(yǎng)基制備成細胞懸液，加入到膠原溶液中并分散均勻，膠原終濃度為6.5mg/ml，細胞密度為5×10⁶個/ml；

3、選擇粘度為100mpa·s的甲基硅油70ml，加入0.05％(v/v)的span-80，用磁力攪拌器以500rpm的轉(zhuǎn)速攪拌；

4、在冰水浴條件下，將細胞-膠原混合液滴加到油相中，繼續(xù)攪拌30分鐘；然后將水相-油相混合體系升溫至37度，繼續(xù)攪拌20分鐘；攪拌完成后，將水相-油相混合液離心，將底層沉淀分散到α-mem培養(yǎng)基中清洗；

5、將上述含有膠原微球的α-mem培養(yǎng)基經(jīng)過40微米篩網(wǎng)過濾，用培養(yǎng)基沖洗3次即得本實施例骨髓間充質(zhì)干細胞-膠原凝膠微球。

實施例2

按以下步驟制備裝載軟骨細胞的膠原凝膠微球

1、取濃度為15mg/ml的膠原溶液，在冰水浴中用少量1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph到7.0，稀釋膠原溶液到8mg/ml；

2、將提前準備好的軟骨細胞，計數(shù)并且用α-mem培養(yǎng)基制備成細胞懸液，加入到膠原溶液中并分散均勻，膠原終濃度為5mg/ml，細胞密度為1×10⁷個/ml；

3、選擇粘度為100mpa·s的甲基硅油70ml，加入0.1％(v/v)的span-80，用磁力攪拌器以600rpm的轉(zhuǎn)速攪拌；

4、在冰水浴條件下，將細胞-膠原混合液滴加到油相中，繼續(xù)攪拌30分鐘；然后將水相-油相混合體系升溫至37度，繼續(xù)攪拌20分鐘；攪拌完成后，將水相-油相混合液離心，將底層沉淀分散到α-mem培養(yǎng)基中清洗；

5、將上述含有膠原凝膠微球的α-mem培養(yǎng)基經(jīng)過40微米篩網(wǎng)過濾，用培養(yǎng)基沖洗3次即得本實施例軟骨細胞-膠原凝膠微球。

實施例3

骨髓間充質(zhì)干細胞-膠原凝膠微球的體外培養(yǎng)實驗

將實施例1制備出骨髓間充質(zhì)干細胞-膠原凝膠微球在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天、10天和15天，對樣品進行熒光素雙醋酸酯(fda)染色觀察細胞狀態(tài)，其結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，實施例1制備的骨髓間充質(zhì)干細胞-膠原凝膠微球從第5天開始細胞形態(tài)都保持為圓球形態(tài)，說明干細胞已經(jīng)向軟骨細胞分化，而且細胞密度逐漸降低。微球的尺寸在第一天有一點收縮，因為此時細胞開始粘附還沒有向軟骨細胞分化，在第五天以后尺寸基本穩(wěn)定。

實施例4

按照以下步驟對實施例1制備的骨髓間充質(zhì)干細胞-膠原凝膠微球?qū)嵤┟摷毎幚?，制備脫細胞膠原凝膠微球支架

1、將實施例1制備得到的骨髓間充質(zhì)干細胞-膠原凝膠微球放入低粘附培養(yǎng)皿中，在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基下培養(yǎng)。經(jīng)過一定培養(yǎng)時間后，取50mg的骨髓間充質(zhì)干細胞-膠原凝膠微球，用pbs清洗干凈；

2、用加有蛋白酶抑制劑的去離子水和1mol/l氯化鈉鹽溶液中清洗3分鐘，反復(fù)3次；然后將微球移至離心管中并放入液氮中冷凍，再放入37攝氏度熱水浴中溶解，反復(fù)3次；

3、將微球移入到0.5％tritonx-100水溶液中(添加0.15％的氨水)清洗3次，并在500轉(zhuǎn)速下震蕩20分鐘；然后加入到200u/ml的dnase1溶液中，在37℃下，轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)條件下震蕩12小時，間隔4小時換液一次新鮮dnase1溶液，更換dnase1溶液前用0.05％的tritonx-100水溶液清洗5min。

4、將微球移入到10nmol/l的edta溶液中，震蕩清洗5分鐘，然后放入0.1％的戊二醛溶液中處理2小時，用pbs清洗6次即得本實施例脫細胞膠原凝膠微球支架，將脫細胞膠原凝膠微球支架用液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

實施例5

脫細胞膠原凝膠微球支架的表征

按照實施例4中的操作，制備出脫細胞膠原凝膠微球支架。利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染料來確認殘余的dna，利用甲苯胺藍(tb)來反應(yīng)微球中軟骨特異性多糖的情況。實驗結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3為骨髓間充質(zhì)干細胞-膠原微球脫細胞前后的dapi染色，其中(a)表示脫細胞前，(b)表示脫細胞后。從圖3可以看出，圖(a)中大量藍色熒光說明脫細胞前存在大量dna；圖(b)中幾乎沒有藍色熒光存在，說明實施例4中骨髓間充質(zhì)干細胞-膠原微球支架的dna已經(jīng)脫除干凈。

圖4為脫細胞前后髓間充質(zhì)干細胞-膠原微球脫的tb染色，其中(a)表示脫細胞前，(b)表示脫細胞后。從圖4中可以看出，脫細胞前膠原微球內(nèi)存在大量的多糖基質(zhì)，顯示為深紫色，脫細胞后膠原微球的tb染色顯示為淡紫色，說明有部分基質(zhì)在脫細胞過程中被洗脫掉了。

實施例6

按照以下步驟對實施例4制備的脫細胞膠原凝膠微球支架種植細胞

1、取10mg實施例4制備的脫細胞膠原凝膠微球支架，用75％的乙醇溶液浸泡15分鐘，用dmem培養(yǎng)基清洗6次，放入15ml離心管中備用；

2、將提前準備好的骨髓間充質(zhì)干細胞，計數(shù)并且用α-mem完全培養(yǎng)基制備成細胞懸液，滴加到上述脫細胞膠原凝膠微球支架上，細胞密度為1×10⁴個/mg，培養(yǎng)24小時，每間隔8小時震蕩一次；

3、將微球周圍的培養(yǎng)基吸凈，更換為未添加生長因子的軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)28天。對組織進行fda染色和切片染色來檢測其中細胞形態(tài)和基質(zhì)分泌狀態(tài)。其檢測結(jié)果如圖5、圖6及圖7所示。

圖5為脫細胞膠原凝膠微球支架種植細胞得到的塊狀組織，從圖5可以看出，微球已經(jīng)長成一個直徑超過4mm的塊狀組織。

圖6為脫細胞膠原凝膠微球支架種植細胞得到組織的fda染色，從圖6可以看出，fda染色反應(yīng)骨髓間充質(zhì)干細胞為圓球表型。

圖7為脫細胞膠原凝膠微球支架種植細胞得到組織的tb染色，從圖7可以看出，在脫細胞膠原凝膠微球支架周圍有大量的新生基質(zhì)產(chǎn)生，說明種植的骨髓間充質(zhì)干細胞已經(jīng)分化為軟骨細胞，并開始分泌軟骨特異性基質(zhì)。

圖8是在關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)時，植入脫細胞膠原凝膠微球支架的操作示意圖，該支架可以通過注射的方法進行微創(chuàng)手術(shù)。

對比例脫細胞流程順序?qū)Ρ?/p>

為了說明本發(fā)明脫細胞流程順序的有益效果，發(fā)明人設(shè)計了四組脫細胞流程與本專利脫細胞流程進行對比，四組脫細胞實驗的dnase1處理時間24小時。

a組采用凍融-dnase1-tritonx100；

b組采用凍融-交聯(lián)-dnase1-tritonx100；

c組采用tritonx100-dnase1；

d組采用交聯(lián)-tritonx100-dnase1。

對采用上述四種脫細胞流程處理方式得到的脫細胞支架樣品進行dapi染色，其結(jié)構(gòu)如圖9所示。從圖9可以看出，四組不同脫細胞流程處理的脫細胞支架都還有剩余的dna沒有被完全除去，其dna的清洗效果是c>a>d>b，說明tritonx100對于細胞膜的破壞作用比凍融要強，dnase1要在tritonx100處理后才能更好的降解dna，交聯(lián)的作用是減少基質(zhì)的流失，但是必須在脫細胞流程后操作，否則會影響脫細胞效果。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。