本發(fā)明涉及醫(yī)學領域，尤其涉及ezh2抑制劑化合物在制備治療眼部黑色素瘤的藥物中的應用。

背景技術：

眼部黑色素瘤包括葡萄膜黑色素瘤(uvealmelanoma,um)與結膜黑色素瘤(conjuctivalmelanoma，cm)。其中um是成人發(fā)生率最高的眼內惡性腫瘤，起源于葡萄膜層，惡性程度高，極易發(fā)生早期轉移，預后差，死亡率高，嚴重威脅患者視力與生命。cm起病較為隱匿，早期不影響視力，發(fā)現(xiàn)時常有擴散轉移，嚴重影響患者生命安全。因此，研究眼部黑色素瘤發(fā)生機制，對探尋眼部黑色素瘤早期診斷和治療新靶點，提高治療有效性，降低眼球摘除率以及轉移率，提高患者視覺預后以及生存壽命，具有十分重要的臨床指導和科學意義。

目前，針對該腫瘤的治療主要為手術和放化療等非病因治療，缺乏針對其病因的治療手段。zeste基因增強子同源物2(ezh2)為多梳蛋白復合體(pcg)家族的成員之一，是多梳蛋白抑制復合體2(prc2)的催化活性亞單位。ezh2是細胞內的一種組蛋白甲基轉移酶，它可促進細胞內組蛋白h3的第27個氨基酸上三甲基(h3k27me3)的甲基化，并被證明是一種原癌基因，與多種腫瘤的生長和轉移相關。ezh2可通過提高細胞中h3k27me3甲基化水平，抑制抑癌基因表達，從而導致腫瘤發(fā)生。通過高通量篩選小分子化合物庫，可發(fā)現(xiàn)ezh2小分子抑制劑效果比較好，但迄今為止，尚沒有ezh2的抑制劑在脈絡膜黑色素瘤中應用的報道，其對脈絡膜黑色素瘤和結膜黑色素瘤的療效和作用機制尚不清楚。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種ezh2抑制劑化合物在制備治療眼部黑色素瘤的藥物中的應用，其特征在于，所述的ezh2抑制劑化合物為gsk503、gsk343、epz005687、epz-6438，分子式分別為c31h38n6o2、c31h39n7o2、c34h44n4o4、c32h37n5o3，分子結構式分別為：

較佳地，所述的ezh2抑制劑化合物的濃度為至少10μm。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，gsk503、gsk343、epz-6438、epz005687能顯著抑制脈絡膜黑色素瘤以及結膜黑色素瘤的生長，通過抑制ezh2，使細胞內h3k27me3甲基化程度降低，從而使抑癌基因重新表達，達到抑制腫瘤生長的效果。該發(fā)明旨在為眼部黑色素瘤的臨床治療提供新的靶點和治療藥物，提高治療有效性，降低眼球摘除率，提高患者視覺預后，前所未有的開拓了一個新的領域。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明實施例中h3k27me3甲基化程度在脈絡膜黑色素瘤以及結膜黑色素瘤中顯著升高的效果示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例中gsk503、gsk343、epz005687、epz-6438能抑制眼部黑色素瘤細胞增殖能力效果示意圖。

圖3為本發(fā)明實施例中ezh2抑制劑能顯著抑制視網膜母細胞瘤的增殖的曲線圖。

圖4為本發(fā)明實施例中10umezh2抑制劑(gsk503、gsk343、epz-6438、epz005687)可以顯著的抑制眼部黑色素瘤細胞遷移能力效果示意圖。

圖5為本發(fā)明實施例中ezh2抑制劑可以有效的降低眼部黑色素瘤h3k27me3水平效果示意圖。

具體實施方式

下面結合具體的實施例對本發(fā)明作進一步地說明，以更好地理解本發(fā)明。

本發(fā)明的ezh2抑制劑化合物為gsk503、gsk343、epz005687、epz-6438，分子式分別為c31h38n6o2、c31h39n7o2、c34h44n4o4、c32h37n5o3，分子結構式分別為：

實施例1

免疫熒光實驗

實驗材料：脈絡膜黑色素瘤組織芯片(me1004a)，購自西安艾麗生物科技有限公司；h3k27me3抗體及第二抗體，購自abcam(艾博抗(上海)貿易有限公司)。

將組織芯片置于濕盒內，鋪加pbs于組織芯片上。稀釋的h3k27me3抗體于4℃，13500g離心2min。在組織芯片的一端吸去玻片上的pbs緩沖液，并從另一端加上抗體，蓋上加濕盒，室溫溫育1h。以pbs冼玻片3次(5min/次)，從切片一端加入新的pbs緩沖液，由另一端吸去舊的緩沖液。稀釋的第二抗體于4℃，13500g離心2min。將第二抗體加于組織芯片上，置加濕盒中室溫溫育1h，以pbs洗玻片3次(5min/次)。蓋蓋玻片，顯微鏡下觀察結果，結果如圖1所示?？梢奾3k27me3甲基化程度在脈絡膜黑色素瘤以及結膜黑色素瘤中顯著升高

實施例2

平板克隆形成實驗

實驗材料：人脈絡膜黑色素瘤ocm1、om431細胞，人結膜黑色素瘤crmm1、cm2005.1細胞，37℃，5％co2常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為10％胎牛血清(fbs)的dmem(gibco)；gsk503、gsk343、epz005687、epz-6438購自medchemexpress(mce中國)；六孔板購自thermofisher(美國賽默飛)；結晶紫購自生工公司(生工中國)；

ocm1、om431、crmm1、cm2005.1培養(yǎng)至密度為70％-80％，生長狀態(tài)良好，折光率高時消化離心，用10％fbsdmem重懸。細胞計數取1000細胞/孔鋪于六孔板上，六孔板每孔含2毫升10％dmem培液。待2周后用結晶紫染色，pbs清洗2遍，拍照計算細胞克隆團數，結果如圖2所示?？煽闯鰃sk503、gsk343、epz005687、epz-6438能抑制眼部黑色素瘤細胞增殖能力

實施例3：

細胞平板克隆增殖實驗

實驗材料：cck8購自日本同仁化學

ocm1、cm2005.1細胞如前述，視網膜色素上皮細胞arpe-19與黑色素細胞pig-1用于作正常對照。ocm1、cm2005.1細胞接種于96孔板，每孔2000個細胞，100ul培液，arpe19以及pig-1細胞沒空為4000個細胞37℃，5％co2培養(yǎng)，分別于0h，24h，48h，72h加入10ulcck8，繼續(xù)37℃孵育4h，上機od450nm測吸光度值，結果如圖3所示。ezh2抑制劑能顯著抑制視網膜母細胞瘤的增殖，且抑制效果隨濃度升高而增強。相同濃度的藥物對正常細胞毒性很小。

實施例4

實驗名稱：transwell細胞遷移實驗

實驗材料：37℃，5％co2常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為10％胎牛血清(fbs)的dmem(gibco)；gsk503、gsk343、epz005687、epz-6438購自medchemexpress(mce中國)；六孔板購自thermofisher(美國賽默飛)；結晶紫購自生工公司(生工中國)；transwell小皿購于millipore(美國密理博)。

實驗步驟：使用8μm的24孔板transwell小室。24孔板每孔內加入10％fbs的dmem培養(yǎng)液900μl，將小室懸掛于24孔內，每個小室內接種10000個細胞于200μl的2％fbs的dmem培養(yǎng)液中。培養(yǎng)2～3天后，吸去孔內和小室內培養(yǎng)液，pbs小心洗一次。加入結晶紫染色30min，pbs小心洗一次。將小室內測的細胞全部擦拭干凈。將小室的外側細胞拍照觀察。用33％的乙酸溶液將結晶紫完全溶解，酶標儀630nm吸光值測定od值，行統(tǒng)計分析，結果見圖4所示。10umezh2抑制劑(gsk503、gsk343、epz-6438、epz005687)可以顯著的抑制眼部黑色素瘤細胞遷移能力。

實施例5：

實驗名稱：westernblot

材料準備：核蛋白提取試劑盒購自thermofisher(美國賽默飛)，蛋白loading以及l(fā)adder購自碧云天生物公司，h3k27me3、ezh2、h3、beta-actin、兔二抗抗體購自美國abcam公司，western轉膜、電泳試劑均購自美國bio-rad公司。

實驗步驟：棄原培養(yǎng)液，使用冷的pbs將洗去脫落的細胞碎片，吸凈pbs后，加入適量的含pmsf蛋白裂解液ripa，充分覆蓋細胞表面，置于冰上裂解30min。使用細胞刮將細胞碎片刮下，將全部液體轉移至干凈的ep管內，12000rpm，4℃離心30min后，將上清液體轉移至另一個干凈的ep管內。bsa方法檢測蛋白濃度。根據蛋白體積加入4×sds蛋白loading，沸水內10min蛋白變性。-80℃保存待用。利用thermofisherbioreagents細胞質、細胞核蛋白提取試劑盒，將細胞核蛋白單獨提取。使用10％的sds-聚丙烯酰胺膠行蛋白電泳?？椎纼燃尤?μl蛋白marker，等質量的變性后蛋白。置于800ml電泳緩沖液內[0.1％sds，250mm甘氨酸(ph8.3)25mmtris堿]，80v電壓恒壓電泳約30min，直至蛋白樣品進入下層膠內，電壓換為120v，繼續(xù)電泳40min。將膠取下，切除多余部分，連同海綿和濾紙一起充分浸泡于預冷的轉膜緩沖液中(39mm甘氨酸，10％甲醇，48mmtris堿)。裁剪適當大小的pvdf膜，置于甲醇中激活。按照電源陽極、海綿、濾紙、pvdf膜、page膠、濾紙、海綿和電泳陰極的順序依次擺放，并夾緊成三明治結構。加入冰磚，置于1l轉膜緩沖液中。使用200ma電流恒流轉膜，轉膜時間根據蛋白分子大小調整。將轉膜成功的pvdf膜置于5％tbs配制的bsa中，室溫封閉1h。加入適量使用5％tbs配制的一抗，封于雜交袋中，4℃孵育過夜。取出pvdf膜，使用5％tbst室溫清洗3次，每次10min。加入適量的二抗，封于雜交袋中，室溫避光孵育1h。取出pvdf膜，使用5％tbst室溫避光清洗3次，每次10min。膜待掃描使用。將pvdf膜平鋪于odyssey激光成像系統(tǒng)進行掃描、分析。結果如圖5所示。10umezh2抑制劑可以有效的降低眼部黑色素瘤h3k27me3水平。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，gsk503、gsk343、epz-6438、epz005687能顯著抑制脈絡膜黑色素瘤以及結膜黑色素瘤的生長，通過抑制ezh2，使細胞內h3k27me3甲基化程度降低，從而使抑癌基因重新表達，達到抑制腫瘤生長的效果。該發(fā)明旨在為眼部黑色素瘤的臨床治療提供新的靶點和治療藥物，提高治療有效性，降低眼球摘除率，提高患者視覺預后，前所未有的開拓了一個新的領域。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內。