本發(fā)明涉及一種載有囊泡的多囊脂質(zhì)體的制備方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

多囊脂質(zhì)體(multivesicular,mvls)是目前發(fā)展較為成熟的一種緩控釋制劑，于1983年由英國skyepharmaplc公司采用貯庫泡沫技術(shù)(depofoam^tm)成功研制。其是由多個水性腔室以非同心圓的形式構(gòu)成，各個腔室之間以脂質(zhì)雙分子層相隔，中性脂質(zhì)作為固定連接物分布在相鄰腔室的交接點處，從而可形成牢固的拓樸結(jié)構(gòu)。多囊脂質(zhì)體作為親水性藥物的載體，其可大大提高水溶性藥物的包封率，同時減少滲漏，在釋放過程中，隨著含藥的小室逐漸破裂而釋放藥物，但完整的球狀結(jié)構(gòu)仍能保持原狀，以達(dá)到緩釋目的。

目前，多囊脂質(zhì)體包埋藥物的報道仍局限在對于普通水溶性藥物或蛋白多肽的研究，如：張淼，于月玲，唐星.阿糖胞苷多囊脂質(zhì)體的制備及體外釋放度考察[j],2009,26(1):1-5.陶昱斐.酪絲亮肽多囊脂質(zhì)體的研究[d]，2007。在上述及多篇多囊脂質(zhì)體研究報道中，藥物在體外釋放時間一般為3-5天，緩釋時間較短。藥物突釋現(xiàn)象仍較明顯，這對于某些治療窗要求嚴(yán)格的疾病治療上還存在重大隱患。對于生物大分子藥物而言，怎樣盡可能保證藥物在制備前后活性不喪失，以達(dá)到良好的治療效果是一個熱點問題。但生物大分子自身結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，很容易在制備、保存或釋放過程中由于體內(nèi)外環(huán)境而經(jīng)受化學(xué)降解或物理變化，從而喪失活性，尤其是多囊脂質(zhì)體制備均是采用w/o/w復(fù)乳法，在油水界面，蛋白多肽類藥物易發(fā)生結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致其喪失部分生物活性。

因此，有必要研發(fā)一種新型緩控釋制劑，使其在提高藥物包封率，解決藥物突釋及保證藥物活性方面具有較好優(yōu)勢。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種可解決突釋現(xiàn)象且包封率高，制備過程中保證藥物良好活性的載有囊泡的多囊脂質(zhì)體的制備方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

一種載有囊泡的多囊脂質(zhì)體的制備方法，步驟如下：

(1)三相溶液的制備

分別是溶液a：制備含有包埋小分子藥物和/或生物大分子藥物的囊泡和蔗糖的內(nèi)水相；其中，所述溶液a含蔗糖質(zhì)量濃度為2-10％；

溶液b：制備含有脂質(zhì)及有機(jī)溶劑的脂質(zhì)相；其中，所述脂質(zhì)包括二油?；字Ｄ憠A，二棕櫚酰磷脂酰甘油，膽固醇和三油酸甘油酯；所述二油?；字Ｄ憠A占脂質(zhì)總質(zhì)量的百分比為20-60％，所述三油酸甘油酯占脂質(zhì)總質(zhì)量的百分比為5-20％，二棕櫚酰磷脂酰甘油占脂質(zhì)總質(zhì)量的百分比為5-20％，所述膽固醇占脂質(zhì)總質(zhì)量的百分比為10-50％；

溶液c：制備含有葡萄糖和賴氨酸的外水相；其中，所述溶液c含葡萄糖質(zhì)量濃度為5-15％，含賴氨酸質(zhì)量濃度為10-80mmol/l；

(2)w/o初乳的制備

合并、混合所述溶液a和所述溶液b，高速剪切攪拌得到w/o初乳；其中，溶液a和溶液b的體積比為1∶0.5-1∶20；

(3)w/o/w多囊脂質(zhì)體的制備

將w/o初乳分散到溶液c中，高速剪切攪拌，形成w/o/w型復(fù)乳；w/o/w型復(fù)乳再分散到溶液c中，30-40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或氮吹，去除有機(jī)溶劑；將w/o/w型復(fù)乳進(jìn)行離心，取沉淀加生理鹽水重新分散，得到多囊脂質(zhì)體；其中，w/o初乳和溶液c的體積比為1∶1-1∶10。

優(yōu)選地，所述囊泡為膠束或納米粒。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述溶液a和所述溶液b高速剪切攪拌條件為：剪切速度3000-15000rpm，時間2-15min。

優(yōu)選地，步驟(3)中將所述初乳分散到所述溶液c中，條件為：剪切速度為3000-12000rpm，時間10-100秒。

有益效果：本發(fā)明采用內(nèi)水相含囊泡，油相含脂質(zhì)成分，形成了多囊脂質(zhì)體小室包含囊泡的復(fù)合結(jié)構(gòu)。該制備方法主要解決了以下兩方面問題：(1)解決了脂溶性藥物難以制成多囊脂質(zhì)體的技術(shù)問題，可先將脂溶性藥物制備成囊泡，然后再制成多囊脂質(zhì)體；(2)解決了藥物突釋的普遍情況，保證藥物在體內(nèi)外生物活性，延長藥物的半衰期，達(dá)到緩慢釋放的目的。所述的多囊脂質(zhì)體不僅可保證加載藥物的包封率，還可提高生物大分子的生物活性，降低其免疫原性，減少突釋效應(yīng)，保證藥物的持續(xù)緩慢釋放。

附圖說明

后文將參照附圖以示例性而非限制性的方式詳細(xì)描述本發(fā)明的一些具體實施例。附圖中相同的附圖標(biāo)記標(biāo)示了相同或類似的部件或部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，這些附圖未必是按比例繪制的。附圖中：

圖1為本發(fā)明實施例一中的載有艾塞那肽的明膠納米粒透射電鏡照片；

圖2為本發(fā)明實施例一中的載有艾塞那肽明膠納米粒多囊脂質(zhì)體的光學(xué)顯微鏡照片；

圖3為本發(fā)明實施例一中的載有艾塞那肽明膠納米粒多囊脂質(zhì)體的體外釋放曲線；

圖4為本發(fā)明對比例一中的載有艾塞那肽多囊脂質(zhì)體的顯微鏡照片；

圖5為本發(fā)明對比例一中的載有艾塞那肽多囊脂質(zhì)體的體外釋放曲線。

具體實施方式

本發(fā)明提供了用于制備可以以延遲特性釋放物質(zhì)如藥物、蛋白質(zhì)和多肽或活性成分的新型制劑方法，即提供了一種載有囊泡的多囊脂質(zhì)體的制備方法。步驟如下：

(1)三相溶液的制備

分別是溶液a：制備含有包埋小分子藥物和/或生物大分子藥物的囊泡和蔗糖的內(nèi)水相；

其中，所述溶液a含蔗糖質(zhì)量濃度為2-10％(w/v)；

溶液b：制備含有脂質(zhì)及有機(jī)溶劑的脂質(zhì)相；

其中，所述脂質(zhì)包括二油?；字Ｄ憠A，二棕櫚酰磷脂酰甘油，膽固醇和三油酸甘油酯；所述二油?；字Ｄ憠A占脂質(zhì)總質(zhì)量的百分比為20-60％，所述三油酸甘油酯占脂質(zhì)總質(zhì)量的百分比為5-20％，二棕櫚酰磷脂酰甘油占脂質(zhì)總質(zhì)量的百分比為5-20％，所述膽固醇占脂質(zhì)總質(zhì)量的百分比為10-50％；

溶液c：制備含有葡萄糖和賴氨酸的外水相；

其中，所述溶液c含葡萄糖質(zhì)量濃度為5-15％(w/v)，含賴氨酸質(zhì)量濃度為10-80mmol/l(w/v)；

(2)w/o初乳的制備

合并、混合所述溶液a和所述溶液b，高速剪切攪拌得到w/o初乳；

其中，溶液a和溶液b的體積比為1∶0.5-1:20；

所述溶液a和所述溶液b高速剪切攪拌條件為：剪切速度3000-15000rpm，時間2-15min；

(3)w/o/w多囊脂質(zhì)體的制備

將w/o初乳分散到溶液c中，高速剪切攪拌，剪切速度為3000-12000rpm，時間10-100秒，形成w/o/w型復(fù)乳；w/o/w型復(fù)乳再分散到溶液c中，30-40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或氮吹，去除有機(jī)溶劑；將w/o/w型復(fù)乳進(jìn)行離心，取沉淀加生理鹽水重新分散，得到多囊脂質(zhì)體；

其中，w/o初乳和溶液c的體積比為1∶1-1∶10。

本發(fā)明所述小分子藥物，選自抗生素類藥物，化學(xué)治療藥物，治療脈絡(luò)膜新生血管藥物如地塞米松。

所述生物大分子藥物選自治療性肽或蛋白質(zhì)或單克隆抗體或核酸，如貝伐珠單抗，雷珠單抗，阿柏西普，sirna和質(zhì)粒dna。利用本發(fā)明制備成的復(fù)合多囊脂質(zhì)體，其脂質(zhì)材料具有較好生物相容性，不會對皮膚、肌肉和局部組織造成刺激，生物大分子藥物被雙層包裹，保證活性不喪失，并且每個小室逐漸破裂釋放囊泡，囊泡再逐一釋放藥物，以達(dá)到緩釋目的。其重點解決了藥物突釋情況，保證藥物活性，使藥物可以在體內(nèi)保持緩慢釋放。

所述囊泡為膠束或納米粒。

所述膠束由嵌段共聚物構(gòu)成，如片段中包含聚乳酸-羥基乙酸、透明質(zhì)酸，優(yōu)選為mpeg-plga膠束。

所述納米粒選自脫乙酰殼聚糖納米粒、明膠納米粒、透明質(zhì)酸納米粒、聚乳酸-羥基乙酸納米粒以及它們材料修飾改造后形成的納米粒。

所述有機(jī)溶劑為三氯甲烷、乙醚、甲醇或丙酮中的一種或多種。

需要理解的是，本發(fā)明中，所述二油酰基磷脂酰膽堿，其是形成多囊脂質(zhì)體的主要成分，只有具有含有雙分子層的磷脂，藥物才能被包封在其中。

本發(fā)明中，所述三油酸甘油酯，其是形成多囊脂質(zhì)體的關(guān)鍵因素，否則，只能得到普通脂質(zhì)體；三油酸甘油酯填充于多囊脂質(zhì)體囊與囊之間的空隙中，起著連接穩(wěn)定各個小室的作用；不同鏈長的三甘油酯，影響藥物的體外釋放速率。

本發(fā)明中，所述二棕櫚酰磷脂酰甘油，其作用是增強(qiáng)所形成的多囊脂質(zhì)體之間的穩(wěn)定性，主要是由于中性磷脂由于范德華力作用易產(chǎn)生凝聚效應(yīng)，相同電荷之間的排斥力可更好防止顆粒的凝集。其在脂質(zhì)相中的濃度為1-10mg/ml,荷負(fù)電磷脂效果更佳。經(jīng)過實驗對比發(fā)現(xiàn)，含有二棕櫚酰磷脂酰甘油的多囊脂質(zhì)體比不含有的在球形圓整及分散程度上均有較明顯優(yōu)勢，前者粘連在一起，分散性不好。

本發(fā)明中，所述膽固醇作為膜穩(wěn)定劑，可改善磷脂膜的流動性，減少藥物的滲漏率，用量過多或過少都會影響多囊脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和包封率，脂質(zhì)相中膽固醇的濃度在5-20mg/ml，實驗發(fā)現(xiàn)若不加膽固醇，所制得的多囊脂質(zhì)體很快便破碎，達(dá)不到緩釋效果。

本發(fā)明中，所述內(nèi)水相中的滲透壓調(diào)節(jié)劑為蔗糖,所述外水相中的滲透壓調(diào)節(jié)劑為葡萄糖。所述的內(nèi)水相滲透壓調(diào)節(jié)劑、外水相滲透壓調(diào)節(jié)劑的存在，是保證內(nèi)外水相壓力差在一定范圍內(nèi)，增加多囊脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，盡可能減少發(fā)生藥物泄露。

下面通過實施例來具體闡述本發(fā)明所述一種載有囊泡的多囊脂質(zhì)體的制備方法。

實施例一

載有艾塞那肽的明膠納米粒的多囊脂質(zhì)體

(1)制備溶液a：1份載有艾塞那肽的明膠納米粒和滲透壓調(diào)節(jié)劑的內(nèi)水相，具體為將制備好的納米粒分散于溶有滲透壓調(diào)節(jié)劑的水相中；

制備溶液b：含有200份的脂質(zhì)有機(jī)溶劑；

制備溶液c：含有滲透壓調(diào)節(jié)劑和輔助乳化劑的外水相；

(2)合并、混合溶液a和溶液b，12000rpm高速剪切攪拌得到w/o初乳；

其中，溶液a和溶液b的體積比為1:0.5-1:20；

溶液a含蔗糖質(zhì)量濃度為2-10％(w/v)；

溶液b中含二棕櫚酰磷脂酰甘油質(zhì)量濃度為0.01-1％(w/v)；

(3)將w/o初乳分散到溶液c中，剪切速度為5000rpm，時間10秒，形成w/o/w型復(fù)乳；

其中，w/o初乳和溶液c的體積比為1:1-1:10進(jìn)行；

溶液c含葡萄糖質(zhì)量濃度為5-15％(w/v)，含賴氨酸質(zhì)量濃度為10-80mmol/l(w/v)；

(4)將w/o/w型復(fù)乳再分散到溶液c中，30-40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或氮吹，去除有機(jī)溶劑；

其中，w/o/w型復(fù)乳與溶液c的體積比為1:1-1∶100；

(5)將w/o/w型復(fù)乳進(jìn)行2000rpm離心，取沉淀加生理鹽水重新分散，得到多囊脂質(zhì)體混懸液。

圖1為載有艾塞那肽的明膠納米粒透射電鏡照片，從圖1可以看出，載有艾塞那肽的明膠納米粒形態(tài)圓整。圖2為載有艾塞那肽明膠納米粒的多囊脂質(zhì)體的光學(xué)顯微鏡照片，從圖2可以看出，多囊脂質(zhì)體的粒徑大小均一、球形圓整。圖3為載有艾塞那肽明膠納米粒的多囊脂質(zhì)體的體外釋放曲線。

實施例二

載有石杉堿甲的mpeg-plga膠束的多囊脂質(zhì)體

(1)制備溶液a：1份載有石杉堿甲的mpeg-plga膠束和滲透壓調(diào)節(jié)劑的內(nèi)水相，具體為將制備好的納米粒分散于溶有滲透壓調(diào)節(jié)劑的水相中；

溶液b：含有200份的脂質(zhì)有機(jī)溶劑；

溶液c：含有滲透壓調(diào)節(jié)劑和輔助乳化劑的外水相；

(2)合并、混合溶液a和溶液b，12000rpm高速剪切攪拌得到w/o初乳；

其中，溶液a和溶液b的體積比為1:0.5-1:20；

溶液a含蔗糖質(zhì)量濃度為2-10％(w/v)；

溶液b中含二棕櫚酰磷脂酰甘油質(zhì)量濃度為0.01-1％(w/v)；

(3)將w/o初乳分散到溶液c中，剪切速度為5000rpm，時間10秒，形成w/o/w型復(fù)乳；

其中，w/o初乳和溶液c的體積比為1∶1-1∶10；

溶液c含葡萄糖質(zhì)量濃度為5-15％(w/v)，含賴氨酸質(zhì)量濃度為10-80mmol/l(w/v)；

(4)將w/o/w型復(fù)乳再分散到溶液c中，30-40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或氮吹，去除有機(jī)溶劑；

其中，w/o/w型復(fù)乳與溶液c的體積比為1∶1-1∶100；

(5)將w/o/w型復(fù)乳進(jìn)行2000rpm離心，取沉淀加生理鹽水重新分散，得到多囊脂質(zhì)體混懸液。

其中所述納米粒、膠束可替換為脂質(zhì)體。

對比例一

艾塞那肽多囊脂質(zhì)體

(1)制備溶液a：含1份艾塞那肽及滲透壓調(diào)節(jié)劑的內(nèi)水相，具體為將藥物溶有滲透壓調(diào)節(jié)劑的水相中；

溶液b：含有10份的脂質(zhì)有機(jī)溶劑；

溶液c：含有滲透壓調(diào)節(jié)劑和輔助乳化劑的外水相

(2)合并、混合溶液a和溶液b，12000rpm高速剪切攪拌得到w/o初乳；

其中，溶液a和溶液b的體積比為1∶0.5-1∶20；

溶液a含蔗糖質(zhì)量濃度為2-10％(w/v)；

溶液b中含二棕櫚酰磷脂酰甘油質(zhì)量濃度為0.01-1％(w/v)；

(3)將w/o初乳分散到溶液c中，剪切速度為5000rpm，時間10秒，形成w/o/w型復(fù)乳；

其中，w/o初乳和溶液c的體積比為1∶1-1∶10進(jìn)行；

溶液c含葡萄糖質(zhì)量濃度為5-15％(w/v)，含賴氨酸質(zhì)量濃度為10-80mmol/l(w/v)；

(4)將w/o/w型復(fù)乳再分散到溶液c中，30-40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或氮吹，去除有機(jī)溶劑；

其中，w/o/w型復(fù)乳與溶液c的體積比為1∶1-1∶100；

(5)將w/o/w型復(fù)乳進(jìn)行2000rpm離心，取沉淀加生理鹽水重新分散，得到多囊脂質(zhì)體混懸液。

其顯微鏡照片見圖4，體外釋放曲線見圖5；結(jié)果顯示，艾塞那肽多囊脂質(zhì)體球形較圓整。

通過實施例一與對比例一的體外釋放曲線可知，實施例中藥物累積釋放度變化緩慢，具有明顯的緩釋效果，藥物可持續(xù)釋放15天；對比例中，藥物釋放具有較明顯的突釋現(xiàn)象，且藥物釋放較迅速，可持續(xù)7天左右。

對比例二

牛血清白蛋白多囊脂質(zhì)體

(1)制備溶液a：含有1份牛血清白蛋白及滲透壓調(diào)節(jié)劑的內(nèi)水相，具體為將藥物溶有滲透壓調(diào)節(jié)劑的水相中；

溶液b：含有10份的脂質(zhì)有機(jī)溶劑；

溶液c：含有滲透壓調(diào)節(jié)劑和輔助乳化劑的外水相；

(2)合并、混合溶液a和溶液b，12000rpm高速剪切攪拌得到w/o初乳；

其中，溶液a和溶液b的體積比為1∶0.5-1∶20；

溶液a含蔗糖質(zhì)量濃度為2-10％(w/v)；

溶液b中含二棕櫚酰磷脂酰甘油質(zhì)量濃度為0.01-1％(w/v)；

(3)將w/o初乳分散到溶液c中，剪切速度為5000rpm，時間10秒，形成w/o/w型復(fù)乳；

其中，w/o初乳和溶液c的體積比為1∶1-1∶10進(jìn)行；

溶液c含葡萄糖質(zhì)量濃度為5-15％(w/v)，含賴氨酸質(zhì)量濃度為10-80mmol/l(w/v)；

(4)將w/o/w型復(fù)乳再分散到溶液c中，30-40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或氮吹，去除有機(jī)溶劑；

其中，w/o/w型復(fù)乳與溶液c的體積比為1∶1-1∶100；

(5)將w/o/w型復(fù)乳進(jìn)行2000rpm離心，取沉淀加生理鹽水重新分散，得到多囊脂質(zhì)體混懸液。

所述的載有囊泡的多囊脂質(zhì)體用于玻璃體、口服、肌注、皮下、鞘內(nèi)、腹腔、硬膜外、關(guān)節(jié)腔等多種注射途徑。

本發(fā)明一種載有囊泡的多囊脂質(zhì)體被廣泛用于手術(shù)和臨床治療，其治療范圍包括但不限于，眼科疾病(如老年性黃斑變性、青光眼、眼部炎癥和玻璃體視網(wǎng)膜疾病等)、腫瘤、肝病與神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。

本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來概述。因此，無論從哪一點來看，本發(fā)明的上述實施方案都只能認(rèn)為是對本發(fā)明的說明而不能限制本發(fā)明，權(quán)利要求書指出了本發(fā)明的范圍，而上述的說明并未指出本發(fā)明的范圍，因此，在與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)認(rèn)為是包括在本發(fā)明的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。