本發(fā)明涉及中藥組合物領(lǐng)域，具體涉及一種防治弧菌病組合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：弧菌病是對蝦養(yǎng)殖過程中最常見的問題之一，不論在過去還是現(xiàn)在，國內(nèi)或國外都認為其是阻礙對蝦養(yǎng)殖事業(yè)發(fā)展的重要原因之一，目前尚缺乏較理想的藥物。我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)曾創(chuàng)造過輝煌的業(yè)績，成為經(jīng)濟效益最好的產(chǎn)業(yè)之一，為繁榮沿海經(jīng)濟、豐富國內(nèi)外市場做出了重要貢獻。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(fao)估計，外海漁蝦業(yè)的過度開發(fā)導(dǎo)致捕撈量下降，到2020年全球的海產(chǎn)食品中將有一半來自于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。2007年中國對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達到126萬噸，約占世界養(yǎng)殖總產(chǎn)量的37％，出口額達到11.4億美元，近百萬農(nóng)漁民通過從事對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)擺脫了貧困，走上了致富道路。隨著對蝦集約化養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的形成與發(fā)展和對蝦種苗與商品蝦的進出口，對弧菌病的爆發(fā)越來越頻繁，傳播速度也越來越快，近年蝦的養(yǎng)成率不到20％。2007年7月，廣東部分地區(qū)南美白對蝦紅體病的發(fā)病率達到95％，病蝦的死亡率達到100％。2013年4～5月份，廣東江門睦州市場2個區(qū)域中的棚尾蝦出現(xiàn)70～80％排塘率，以20～40天的蝦為主。不少養(yǎng)殖業(yè)者，經(jīng)濟損失嚴重，甚至不少養(yǎng)殖場破產(chǎn)倒閉，給整個養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成嚴重的威脅，已引起全社會關(guān)注。調(diào)查發(fā)現(xiàn)對蝦養(yǎng)殖失敗原因中，弧菌感染性疾病占85％以上。農(nóng)業(yè)部提倡研究中草藥在水產(chǎn)行業(yè)的作用，發(fā)掘能對抗水產(chǎn)病害的中草藥。市面水產(chǎn)類抗菌中成藥，抑菌效果并不理想，原因主要是組方隨意，加工粗，給藥方式潑灑不合理，夸大產(chǎn)品功效。因此，為了使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)地發(fā)展，研究開發(fā)出一種毒副作用小、無殘留、病原體不易產(chǎn)生耐藥性的中草藥成為當前抗對蝦弧菌感染性疾病藥物研究很有必要。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種防治弧菌病中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)予以實現(xiàn)：一種防治弧菌病中藥組合物，其有效成分包含下述重量份的下述組分：半邊蓮花200～300重量份、檵木葉400～500重量份、x200～500重量份，其中x為黃芪、牡荊花、地膽草花、黃連葉、黃芩中的一種或多種。優(yōu)選地，所述組合物還包含輔料100～700重量份，輔料為魚粉、粗蛋白、豆粕、面粉、糊精、葡萄糖、礦物質(zhì)中的一種或多種。優(yōu)選地，所述組合物包含下述重量份的下述組分：半邊蓮花230～270重量份、檵木葉440～460重量份、x200～400重量份、輔料250～500重量份。本發(fā)明所述防治弧菌病中藥組合物的制備方法，包括如下步驟：s1、以8～18倍藥材原料重量的水提取檵木葉、半邊蓮花混合物1-3次，每次1～2小時，濾過；合并濾液，50～80℃減壓濃縮成第一稠膏，快速攪拌下向第一稠膏內(nèi)加入乙醇，使乙醇的體積含量為60～80％，靜置過夜，取上清液濾過，濾液回收乙醇，50～80℃減壓濃縮成第二稠膏；s2、以8～10倍量85～95％乙醇、60～80％乙醇提取x2次，每次1～2小時，濾過；合并濾液，50～80℃減壓回收乙醇、濃縮成第三稠膏；合并第二稠膏和第三稠膏得到稠膏混合物；s3、將稠膏混合物與輔料配制成防治弧菌病中藥組合物。優(yōu)選地，步驟s3中稠膏混合物與輔料采用如下之一方法配制成防治弧菌病中藥組合物：方法a：取水加熱至80～90℃，加入葡萄糖、礦物質(zhì)，快速攪拌至完全溶解，加入稠膏混合物，45～60℃保溫攪勻，得到防治弧菌病中藥組合物液體劑；方法b：取魚粉、粗蛋白、豆粕、面粉混勻，加入稠膏混合物，攪勻制粒烘干得到防治弧菌病中藥組合物顆粒劑；方法c：取水加熱至80～90℃，加入糊精、葡萄糖、礦物質(zhì)，快速攪拌至完全溶解，加入稠膏混合物，45～60℃保溫攪勻，得到防治弧菌病中藥組合物膏劑。優(yōu)選地，方法a和方法c中水的用量為稠膏混合物重量的15～30％。優(yōu)選地，方法a和方法c中在50℃保溫攪勻。優(yōu)選地，方法a、方法b和方法c中添加防腐劑攪拌均勻。防腐劑用量優(yōu)選為組合物重量的0.01～0.05％，防腐劑可以抑制微生物生長，防止組合物腐敗變質(zhì)，延長組合物的保質(zhì)期。優(yōu)選地，稠膏混合物與總藥材原料的重量比為0.8～1.5:5。優(yōu)選地，稠膏混合物與總藥材原料的重量比為1:5。優(yōu)選地，第一稠膏與藥材原料的重量比為0.8～1.2:1，第二稠膏與其藥材原料的重量比為0.5～1.5:3，第三稠膏與其藥材原料的重量比為0.5～1.5:4。上述組合物在制備用于防治弧菌病的藥物中的應(yīng)用。所述弧菌病為水產(chǎn)動物的弧菌病，優(yōu)選為對蝦的弧菌病。本發(fā)明處方配伍既有中醫(yī)的清熱解毒、驅(qū)蟲之功，又有現(xiàn)代醫(yī)學的抗菌抗病毒、殺蟲、調(diào)節(jié)免疫功能之效，又有現(xiàn)代醫(yī)學的抗菌抗病毒、殺蟲、調(diào)節(jié)免疫功能之效，是防治弧菌病的良方。其中檵木葉味苦、澀，性寒，解毒，收斂，止血；半邊蓮花清熱解毒，利尿散結(jié)，具有抗菌、抗腫瘤和利膽作用；黃芪味甘，性微溫，能增強機體免疫功能，具有保肝、利尿、抗衰老、抗應(yīng)激、降壓和較廣泛的抗菌作用；杜荊花味苦、性寒，解表化濕，祛痰平喘，殺毒，抗菌，止痛，能增強機體免疫功能；黃連味苦、性寒，清熱瀉火，燥濕解毒，具有抗菌、抗病毒和抗原蟲的作用；地膽草花味苦辛、性寒，清熱解毒，涼血消腫?，F(xiàn)代化學和藥理學研究表明：半邊蓮具有較強的殺菌、抑菌活性；檵木葉具有廣譜抗菌作用，葉的提取物在試管內(nèi)對鏈球菌、葡萄球菌、傷寒及大腸桿菌等均有抑制作用，煎劑可作皮膚消毒劑；地膽草花具有較強的抗菌、抗細胞毒和腫瘤作用；佐以黃芪增強機體免疫功能、抗應(yīng)激、保肝，牡荊花抗菌、驅(qū)蟲。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明組合物采用檵木葉、半邊蓮花等中草藥作為有效成分，對弧菌病的防治效果好，且毒副作用小，無殘留，病原體不易產(chǎn)生耐藥性。本發(fā)明組合物的原料來源廣泛，成本低，可以制成多種劑型，應(yīng)用更靈活。本發(fā)明所述防治弧菌病組合物具有抗弧菌病、抗原蟲、增強機體免疫力的作用，可用于制備防治弧菌病的藥物，具有推廣應(yīng)用價值。附圖說明圖1為體外抑弧菌比較試驗結(jié)果示意圖。圖2為各待測樣品在96h內(nèi)的溶菌酶變化趨勢圖。圖3為各待測樣品在96h內(nèi)的谷草轉(zhuǎn)氨酶變化趨勢圖。圖4為各待測樣品在96h內(nèi)的酸性磷酸酶變化趨勢圖。具體實施方式為了更好的說明本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施方式做進一步說明。本發(fā)明中所用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領(lǐng)域所熟知的，在此不再贅述。本發(fā)明中水提、醇提等操作及條件，除特別說明外，采用現(xiàn)有技術(shù)。實施例1一種防治弧菌病中藥組合物，其是由檵木葉、半邊蓮花、黃芪、葡萄糖、礦物質(zhì)按下述重量份配比制備而成：以下詳細說明本發(fā)明組合物的制備方法：s1、將檵木葉、半邊蓮花混合，以12倍藥材原料重量的水提取2次，每次1.5小時，濾過；合并濾液，65℃減壓濃縮成第一稠膏，第一稠膏與藥材原料的重量比為1:1；快速攪拌下向第一稠膏內(nèi)加入乙醇使含醇量為70％，靜置過夜，取上清液濾過，濾液在65℃減壓回收乙醇、濃縮成第二稠膏，第二稠膏與藥材原料的重量比為1:3；s2、將地黃連葉、黃芪、黃芩混合，以10倍藥材原料重量的90％乙醇、70％乙醇各提取1次，每次1.5小時，濾過；合并濾液，65℃減壓回收乙醇、濃縮成第三稠膏，第三稠膏與藥材原料的重量比為1:4；合并第二稠膏和第三稠膏得到稠膏混合物；s3、溶解：取稠膏混合物重量20％的水加熱至80～90℃，加入葡萄糖、礦物質(zhì)，快速攪拌至完全溶解，加入稠膏混合物，50℃保溫攪勻，加入防腐劑攪勻，防腐劑用量為組合物重量的0.05％，將混合藥液放冷置灌裝機中，灌裝，封口，即得防治弧菌病中藥組合物液體劑。實施例2一種防治弧菌病中藥組合物，其是由半邊蓮花、檵木葉、牡荊花、黃連葉、魚粉、粗蛋白、豆粕、面粉按下述重量份配比制備而成：以下詳細說明本發(fā)明組合物的制備方法：s1、將檵木葉、半邊蓮花混合，以8～18倍藥材原料重量的水提取2次，每次1小時，濾過；合并濾液，80℃減壓濃縮成第一稠膏，第一稠膏與藥材原料的重量比為1.2:1；快速攪拌下向第一稠膏內(nèi)加入乙醇，使乙醇體積含量為60％，靜置過夜，取上清液濾過，濾液在80℃減壓回收乙醇、濃縮成第二稠膏，第二稠膏與藥材原料的重量比為0.5:3；s2、將牡荊花、黃連葉混合，以8倍量95％乙醇、75％乙醇各提取1次，每次2小時，濾過；合并濾液，50～80℃減壓回收乙醇、濃縮成第三稠膏，第三稠膏與藥材原料的重量比為1.5:4；合并第二稠膏和第三稠膏得到稠膏混合物；s3、取魚粉、粗蛋白、豆粕、面粉混勻，加入稠膏混合物攪勻，加入防腐劑，防腐劑用量為組合物重量的0.01％，攪勻，制成顆粒，70℃烘干，分裝，封口，即得防治弧菌病中藥組合物顆粒劑。實施例3一種防治弧菌病中藥組合物，其是由檵木葉、半邊蓮花、黃芪、牡荊花、糊精、葡萄糖、礦物質(zhì)按下述重量份配比制備而成：以下詳細說明本發(fā)明組合物的制備方法：s1、將檵木葉、半邊蓮花混合，以18倍藥材原料重量的水提取2次，每次1小時，濾過；合并濾液，50～80℃減壓濃縮成第一稠膏，第一稠膏與藥材原料的重量比為1.2:1；快速攪拌下向第一稠膏內(nèi)加入乙醇，使乙醇體積含量為60％，靜置過夜，取上清液濾過，濾液在50～80℃減壓回收乙醇、濃縮成第二稠膏，第二稠膏與藥材原料的重量比為1.5:3；s2、將黃芪、牡荊花混合，以8～10倍量90％乙醇、70％乙醇各提取1次，每次1小時，濾過；合并濾液，50～80℃減壓回收乙醇、濃縮成第三稠膏，第三稠膏與藥材原料的重量比為0.5:4；合并第二稠膏和第三稠膏得到稠膏混合物；s3、取水加熱至80～90℃，加入糊精、葡萄糖、礦物質(zhì)，快速攪拌至完全溶解，加入稠膏混合物，50℃保溫攪勻，加入防腐劑，防腐劑用量為組合物重量的0.03％，攪勻，放冷置灌裝機中，灌裝，封口，即得防治弧菌病中藥組合物膏劑。實例4、體外抑弧菌比較試驗取池塘水，分為6組，每組2l。6組分別使用本發(fā)明防治弧菌病中藥組合物、中藥三黃散、六黃液、弧菌克星、板藍根末、空白組(不用藥)，按標示量投藥后，再各取50μl均勻涂布于tcbs弧菌培養(yǎng)皿上，20h后觀察結(jié)果如圖1所示。圖1從左至右依次為本發(fā)明防治弧菌病中藥組合物組、三黃散組、六黃液組、弧菌克星組、板藍根末組和空白組。本發(fā)明防治弧菌病中藥組合物抑制弧菌效果明顯，無弧菌生長，其他各組藥物抑菌效果差，有大量弧菌生長。實例5、蝦體弧菌試驗研究取初期弧菌感染發(fā)病的對蝦(仍能攝食)，平均分到2個桶中作為實驗組和對照組，每桶25只。對照組不用藥，正常喂料。實驗組采用本發(fā)明防治弧菌病中藥組合物，采用如下方法喂料：第一天停止喂料。上午，取防治弧菌病中藥組合物液體劑和顆粒劑按照重量比1:3混合，取混合后的防治弧菌病中藥組合物0.3ml與飼料1g拌勻投喂；傍晚，取防治弧菌病中藥組合物液體劑和顆粒劑按照重量比1:3混合，混合后的防治弧菌病中藥組合物0.3ml與飼料1g拌勻，投喂。第二天上午給飼料前，取防治弧菌病中藥組合物液體劑和顆粒劑按照重量比1:3混合，混合后的防治弧菌病中藥組合物0.3ml與飼料1g拌勻投喂，后正常喂料；傍晚給飼料前，取防治弧菌病中藥組合物液體劑和顆粒劑按照重量比1:3混合，混合后的防治弧菌病中藥組合物0.3ml與飼料1g拌勻投喂，后正常喂料。第三天起正常喂料。觀察并記錄各組對蝦存活數(shù)、吃料情況和肝、胃、腸情況。吃料情況為喂料后半小時觀察的對蝦吃料情況，肝、胃、腸情況是觀察對蝦是否出現(xiàn)斷腸、空腸，空胃，肝萎縮、紅腫等情況。結(jié)果如表1所示。由表1可知，對照組對蝦存活數(shù)逐漸減少，第4天僅剩余5只，吃料情況先減少，第2天起不吃料，出現(xiàn)空胃、空腸、肝臟萎等現(xiàn)象。實驗組對蝦死亡率低，第4天存活數(shù)為12只，吃料情況先減少，至第4天起恢復(fù)正常，絕大部分胃腸飽滿、肝臟正常。表1、對蝦各指標情況實施例6、提高酶活性實驗選取大小比較均勻的健康對蝦200尾，平均質(zhì)量為(6.22±1.37)g、體長(7.16±0.52)cm，隨機分成2組，分別為對照組和實驗組，每組100尾，于100l圓柱形桶(直徑50cm)中進行養(yǎng)殖。對照組：采用溶藻弧菌(1×108cfu/ml)腹腔注射0.1ml感染；實驗組：進行弧菌感染，第一餐采用本發(fā)明防治弧菌病中藥組合物拌飼料(100g/kg)后投喂，余下均正常投喂飼料；以上各組每餐飼料投喂量均為對蝦體重的20％。實驗周期為4天，在實驗過程中分別于2、4、8、12、24、48、96h依次處死各組別對蝦10尾，分別用1ml注射器從頭胸甲后部插入心區(qū)采血及割取部分肝組織、低溫勻漿，注入無菌離心管中，于4℃、6000r/min離心15min，分離血清于-80℃冰箱保存，用于相關(guān)免疫指標的測定。對蝦血清的谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast/got)、酸性磷酸酶(acp)、溶菌酶(lzm)等免疫因子活性的測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，具體方法依該試劑盒說明操作。(1)溶菌酶(lzm)檢測溶菌酶活性反映吞噬細胞的活化狀態(tài)，是對蝦抗菌防御機能力的體現(xiàn)。所測樣品在不同時間點測得的具體溶菌酶值見表2，變化趨勢見圖2。表2、各待測樣品在不同時間點測得的lzm值lzm(u/ml)實驗組對照組2h0.061±1.640.049±1.914h0.088±3.07*0.041±2.708h0.091±2.1*0.039±1.7012h0.08±1.72*0.028±1.9324h0.068±1.23*0.022±1.6648h0.061±3.41*0.019±2.1096h0.059±1.44*0.019±2.32注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(n＝6)，*表示與對照組比較p＜0.05。由圖2和表2可見，在觀察期內(nèi)，實驗組的lzm在8h達到最佳水平，與對照組差距達0.043u/ml；而后逐漸降低，但均高于正常水平。對照組的lzm活性在2h時為最佳，而后逐漸降低，但均低于正常水平。(2)谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast/got)的檢測谷草轉(zhuǎn)氨酶酶活性的高低與肝細胞的解毒功能關(guān)系密切，是反映肝細胞受損的指標。所測樣品在不同時間點測得的具體谷草轉(zhuǎn)氨酶值見表3，變化趨勢見圖3。分析表3和圖3數(shù)據(jù)可知，24h之后，實驗組與對照組受試動物體內(nèi)的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性出現(xiàn)顯著差異(p<0.05)；直至96h，實驗組的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性仍然維持稍高于正常水平。表3、各待測樣品在不同時間點測得的got/ugot值got/ugot實驗組對照組2h60±3.7356±2.184h62±5.0355±3.208h61±3.5154±2.3312h62±4.7255±3.0224h63±5.27*51±3.1948h63±1.79*28±3.6096h61±3.55*26±3.77注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(n＝6)，*表示與對照組比較p＜0.05。(3)酸性磷酸酶(acp)的檢測酸性磷酸酶作為動物體內(nèi)重要的調(diào)控酶，也常用acp作為評價動物免疫功能的指標。所測樣品在不同時間點測得的具體酸性磷酸酶值見表4，變化趨勢見圖4。表4、各待測樣品在不同時間點測得的acp值acp/uacp實驗組對照組2h8.9±1.918.8±1.724h9.2±2.138.5±1.898h10.8±1.87*6.6±1.6012h11.7±2.76*6.5±1.5924h10.7±2.71*5.9±1.9148h10.1±1.98*5.8±2.3096h9.0±2.32*5.8±2.07注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(n＝6)，*表示與對照組比較p＜0.05。由圖4和表4可看出，防治弧菌病中藥組合物在4-12h的acp逐漸上升，12-96h逐漸下降至恢復(fù)正常水平，同時在第12h時達最大值11.7uacp/ml，相比對照組僅為6.5uacp/ml，acp活性升高80.0％，具有顯著差異(p＜0.05)；對照組acp水平在4-8h逐漸下降，48h達到最低值，均顯著低于正常水平。通過上述分析可知，本發(fā)明防治弧菌病中藥組合物能顯著提高蝦血清中酸性磷酸酶、溶菌酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性，保護機體肝臟免受損害。實施例7、預(yù)防性實驗共分為4組，其中一組為對照組，另外三組為實驗組1-3。每組隨機選取健康對蝦160尾，于水泥養(yǎng)殖池(廣東汕尾市紅海灣澳龍苗場)中進行網(wǎng)箱(0.16m3)養(yǎng)殖，鹽度28‰，水溫28℃，增氧泵增氧，養(yǎng)殖7d。對照組：按照正常養(yǎng)殖方式進行飼料投喂，4餐/天，2.5g/餐，總投料量為10g，不添加任何藥物。實驗組：除正常投料外，采用“2+4”給藥模式，在每天早上第一餐前1h按照本發(fā)明防治弧菌病中藥組合物液體劑和顆粒劑重量比4:1進行投喂，1餐用量為0.8g，連用2天，間隔4天后再次給藥?？瞻捉M和組合物組每天的飼料投喂總量相同。在此期間，考察對蝦的蝦體弧菌數(shù)量、體征、攝食、增重、死亡情況。水體弧菌檢測：實驗第1天，分別從養(yǎng)殖池中進行水體樣本采集后，采用移液器吸取0.1ml養(yǎng)殖用水原液(另用無菌生理鹽水稀釋至適當濃度以計數(shù))，滴至tcbs固體培養(yǎng)基上，一次性無菌涂布器均勻涂布，室溫培養(yǎng)24h，觀察、計算菌落數(shù)量。觀察到培養(yǎng)基上有大量弧菌生長，確認水體中有大量弧菌。蝦體弧菌檢測：在實驗第1天、第3天、第6天，分別從7個實驗組中各隨機選取10尾蝦，純凈水浸泡5分鐘，濾紙吸干蝦體表面水分，稱重后置組織研磨器中搗碎成勻漿，移液器吸取0.1ml勻漿原液(另用無菌生理鹽水稀釋至適當濃度以計數(shù))至tcbs固體培養(yǎng)基上，一次性無菌涂布器均勻涂布，室溫培養(yǎng)24h，觀察、計算菌落數(shù)量。結(jié)果如表5所示。表5、各組對蝦蝦體攜帶弧菌數(shù)(cfu/g)組別對照組實驗組1實驗組2實驗組3第1天2.0×1042.3×1041.7×1042.2×104第3天2.5×1047.0×103★3.0×103★4.5×103★第6天3.4×1041.0×1044.0×1036.0×103注：★表示與空白組相比p<0.05。分析表5數(shù)據(jù)可知，與對照組相比，連續(xù)給藥2天后，實驗物組均表現(xiàn)出明顯的體內(nèi)抑殺弧菌效果，顯著地降低弧菌數(shù)量；給藥第6天，實驗組仍能夠較好地抑制對蝦體內(nèi)的弧菌生長，維持在較低的數(shù)量水平。對蝦體征評價：觀察、記錄各實驗組對蝦每天的活動行為、組織器官發(fā)育等情況，給予打分評價；其中以第3天、第6天為關(guān)鍵點進行分析。具體的體征評分見表6。第3天、第6天對蝦體征評分見表7。表6、對蝦體征評分注：總分8～10分屬正常健康蝦；6～7分為輕度病蝦；4～5分為中度病蝦；0～3分為重度瀕死蝦。表7、各組對蝦在第3d、6d的體征評分分析表7數(shù)據(jù)可知，各組別對蝦的體征評分均在健康范圍值(≥8分)之內(nèi)，3個實驗組的評分均高于2個對照組，但未具有顯著性差異。但是，對照組對蝦在實驗第3天換水后均發(fā)生了不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，出現(xiàn)紅須、紅尾等應(yīng)激現(xiàn)象，個別還伴有空胃、斷腸等癥狀；而實驗組在體表、生長、活力、肝臟、腸胃等體征方面均表現(xiàn)得更加健康，如體表透亮、反應(yīng)敏捷、肌肉緊實、胃腸道飽滿、肝臟清晰，未出現(xiàn)任何不良的應(yīng)激反應(yīng)。攝食情況：投料后每隔5min觀察一次，統(tǒng)計實驗組對蝦每天各餐的攝食時間，具體見表8。表8、各組對蝦每天平均攝食時間(min)分析表8數(shù)據(jù)可知，與對照組相比，給藥后，實驗組對蝦在食欲方面均得到了不同程度的提高(特別是給藥后的第2天)，每餐攝食的平均時間減少6～14min，攝食速度稍有提高，但未具有顯著性差異。死亡統(tǒng)計：在整個實驗過程中，記錄各實驗組對蝦每天的死亡例數(shù)，統(tǒng)計存活率，具體見表9。表9、各組對蝦每天死亡情況(尾)組別對照組實驗組1實驗組2實驗組3第1天0000第2天0100第3天0000第4天4000第5天0000第6天0000存活率％96.399.4100.0100.0分析表9數(shù)據(jù)可知，與對照組的存活率96.3％相比，給藥后，實驗組的平均存活率為99.8％，稍有提高，但未具有顯著性差異。對照組在第3天換水后均發(fā)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，引發(fā)對蝦偷死；而實驗組未見任何不良的應(yīng)激癥狀。增重情況：在實驗第1天、第6天，分別對各組對蝦進行稱重，比較增長速度，具體見表10。表10、各組對蝦平均增重情況(g)組別對照組實驗組1實驗組2實驗組3第1天0.1870.1840.1930.184第6天0.5450.5550.6050.585增重g/天0.05960.06190.06870.0668分析表10數(shù)據(jù)可知，與對照組的每天平均增重0.0596克相比，給藥后，實驗組每天的平均增重為0.0658克，生長速度明顯較之提高。實施例8、治療性實驗采用移液器吸取養(yǎng)殖池中養(yǎng)殖用水0.1ml，滴于tcbs固體培養(yǎng)基上進行涂布，室溫培養(yǎng)24h；挑取典型單菌落(菌檢為弧菌)于2216e液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h，采用麥氏比濁管進行菌液濃度比對，同時用無菌生理鹽水稀釋至適宜濃度。采用拌料投喂的感染方式，每克飼料含細菌(溶藻弧菌(vibrioalginolyticus,v.a))數(shù)量為1.0×106cfu，3餐/天，感染養(yǎng)殖1天后進行給藥實驗。對蝦感染弧菌病至給藥前，200尾對蝦中，共計有18尾對蝦死亡，其余均呈現(xiàn)空胃、斷腸或空腸、活力低迷等病癥，表明成功建立對蝦弧菌感染發(fā)病模型。選取感染成功后南美白對蝦選取病癥明顯的對蝦150尾，隨機分成3組，分別為對照組、實驗組1、實驗組2組，每組50尾蝦，置于白色膠桶(0.1m3)中飼養(yǎng)，鹽度28‰，水溫26℃，增氧泵增氧。養(yǎng)殖6d。對照組按照正常養(yǎng)殖方式(3餐/天)進行飼料投喂，不添加任何藥物；實驗組1、2除了中午正常投喂飼料外，在每天早上、下午投喂本發(fā)明防治弧菌病中藥組合物液體劑和顆粒劑重量比4:1的混合物，連用3～5天。在此期間，考察對蝦的蝦體弧菌數(shù)量、體征、攝食、增重、死亡情況。蝦體弧菌檢測：在實驗第1天、第3天、第5天，從3個實驗組別中各隨機選取5尾蝦，純凈水浸泡5分鐘，濾紙吸干蝦體表面水分，稱重后置組織研磨器中搗碎成勻漿，移液器吸取0.1ml勻漿原液(另用無菌生理鹽水稀釋至適當濃度以計數(shù))至tcbs固體培養(yǎng)基上，一次性無菌涂布器均勻涂布，室溫培養(yǎng)24h，觀察、計算菌落數(shù)量，具體見表11。表11、各組對蝦蝦體攜帶弧菌數(shù)(cfu/g)組別對照組實驗組1實驗組2第1天6.0×1056.3×1055.6×105第3天1.2×1065.6×104★4.0×104★第5天1.5×1079.0×103★★7.3×103★★注：★表示與對照組相比p<0.05，★★表示與對照組相比p<0.01。分析表11數(shù)據(jù)可知，各組對蝦在感染后第1天的弧菌數(shù)均超過105cfu/g，屬于輕中度發(fā)病。對照組隨著養(yǎng)殖天數(shù)的增加，弧菌呈級數(shù)遞增，成為重度病蝦(106cfu/g)；實驗組在給藥3天后，均表現(xiàn)出顯著地抑制體內(nèi)弧菌生長作用；連續(xù)給藥5天，實驗組的對蝦蝦體弧菌數(shù)已經(jīng)降至正常范圍值內(nèi)(104cfu/g)。對蝦體征評分：觀察、評價各實驗組對蝦每天的活動行為和組織器官發(fā)育情況，具體見表12～13。表12、對照組對蝦每天的體征評分特征1d2d3d4d5d6d體表111111生長111100活力110000肝臟111000腸胃100000總計653211表13、實驗組1對蝦每天的體征評分體征1d2d3d4d5d6d體表111111生長111111活力122222肝臟112222腸胃112222總計568888表14、實驗組2對蝦每天的體征評分分析表12～14數(shù)據(jù)可知，各組對蝦在感染成功后的第1天已處于中度發(fā)病狀態(tài)，隨著養(yǎng)殖天數(shù)的增加，對照組對蝦出現(xiàn)明顯的紅體、紅須、紅尾、活力微弱、空腸空胃、肝臟萎縮等病癥，相繼死亡；而實驗組1、實驗組2對蝦在給藥第3天的體表、生長、活力、肝臟、腸胃等體征方面均出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，給藥5天后已恢復(fù)到正常指標范圍：體表透亮、活力強、胃腸道飽滿、肝胰腺清晰。攝食情況：投喂后觀察各組攝食表現(xiàn)，結(jié)果如下：對照組：實驗第1～2天的攝食時間顯著延長，第3天已基本停止攝食。實驗組1：實驗第1～2天攝食時間延長，第3～4天恢復(fù)正常攝食。實驗組2：實驗第1天攝食時間延長，第2～3天恢復(fù)正常攝食。死亡統(tǒng)計：在整個實驗過程中，記錄每天各實驗組對蝦死亡例數(shù)，統(tǒng)計存活率，具體見表15。表15、各組對蝦死亡情況(尾)組別對照組實驗組1實驗組2第1天753第2天1122第3天1001第4天1210第5天310第6天000存活率(％)14.0％82.0％★★88.0％★★注：★★表示與對照組相比p<0.01。分析表15數(shù)據(jù)可知，與對照組存活率14.0％相比，實驗組1和實驗組2的存活率為分別為82.0％、88.0％，均顯著地提高了病蝦的存活率。具體表現(xiàn)為：連續(xù)給藥2天，病情已得到有效控制，對蝦死亡例數(shù)顯著降低；給藥3天，已無死蝦出現(xiàn)。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。當前第1頁12