本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。更具體地，涉及一種增強型抗菌止血生物海綿的制備方法。
背景技術(shù)：
：外傷引起的傷口出血和術(shù)后的傷口感染是影響創(chuàng)口愈合以及恢復(fù)健康的重要威脅。如何快速有效的對傷口進(jìn)行止血、抑菌為后續(xù)治療創(chuàng)造條件非常重要。因此，對具有相關(guān)性能的生物醫(yī)用材料的研究也是生物醫(yī)用材料的一大研究熱點。目前醫(yī)用止血材料主要有明膠海綿、藻酸鈣纖維、殼聚糖等。這些材料由于結(jié)構(gòu)的差異，具有不同的止血效果和功能，且在實際應(yīng)用中也都取得了良好的效果。但是也各自存在一定的弊端。例如，明膠含有異種蛋白，易引發(fā)過敏反應(yīng)；純的殼聚糖海綿機械性能差，止血效果有限，且術(shù)后抗感染性能較差，此外殼聚糖的價格較高，這使得其作為止血材料使用的成本高，如何能降低殼聚糖止血材料的成本是需要解決的技術(shù)問題之一。已有的研究中，有通過使用小分子醛類交聯(lián)劑獲得交聯(lián)的殼聚糖止血綿，例如以京尼平或戊二醛為交聯(lián)劑制備復(fù)合海綿。但這些交聯(lián)劑存在一定的細(xì)胞毒性，應(yīng)用具有局限性，且小分子的交聯(lián)劑容易從止血棉上脫落，止血棉強度不高，也會影響止血棉的止血性能；還有研究通過將殼聚糖鹽酸鹽與醛化的透明質(zhì)酸或葡萄糖進(jìn)行交聯(lián)從而獲得交聯(lián)的殼聚糖快速止血棉。但這種方法獲得的止血棉的抑菌效果還有待進(jìn)一步改善。且殼聚糖鹽酸鹽本身就是一種具有強陽離子性的殼聚糖衍生物，相比較殼聚糖，其本身具有更好的止血效果。此外，這些方法獲得的止血棉的止血性有一定的改善，但還需要進(jìn)一步的提高，且獲得的止血棉并不能同時達(dá)到很好的抑菌效果。針對以上問題，需要提供一種成本較低、強度好的、止血效果突出的、且抑菌效果明顯的止血棉。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的在于提供一種增強型抗菌止血生物海綿的制備方法，該制備方法成本低，且制備獲得的止血生物海綿同時具有優(yōu)異的止血及抑菌的作用，且該止血生物海綿機械性能及可降解性較好。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種增強型抗菌止血生物海綿的制備方法制備得到的增強型抗菌止血生物海綿。為達(dá)到上述第一個目的，本發(fā)明提供一種增強型抗菌止血生物海綿的制備方法，該方法包括如下步驟：將殼聚糖溶于醋酸溶液中，再向其中加入改性淀粉，攪拌反應(yīng)后，將反應(yīng)液置于模具中，經(jīng)低溫冷凍、冷凍干燥，再進(jìn)行熱處理、輻照滅菌，得到增強型抗菌止血生物海綿。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述攪拌反應(yīng)的溫度為20～50℃，時間為0.5～5h。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述改性淀粉為醚化淀粉或醛基化醚化淀粉；所述醛基化醚化淀粉為通過將所述醚化淀粉經(jīng)醛化得到。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述醚化淀粉的制備包括將淀粉溶于氫氧化鈉溶液中，加入醚化劑，于50～80℃反應(yīng)2～24h后透析，冷凍干燥得醚化淀粉。此方法制備得到的醚化淀粉與殼聚糖之間不發(fā)生交聯(lián)作用，將其與殼聚糖復(fù)合后，制備得到的生物海綿對血細(xì)胞的凝聚及細(xì)菌的抑制均有促進(jìn)作用，而且生物可降解性能優(yōu)異。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述醛基化醚化淀粉的制備包括將所述醚化淀粉溶于去離子水中，向其中加入高碘酸鈉溶液，于20～50℃反應(yīng)1～10h，再加入乙二醇，繼續(xù)反應(yīng)1～5h后透析，冷凍干燥得醛基化醚化淀粉。也即，將淀粉溶于氫氧化鈉溶液中，加入醚化劑，于50～80℃反應(yīng)2～24h后透析，冷凍干燥得醚化淀粉，再將所述醚化淀粉溶于去離子水中，向其中加入高碘酸鈉溶液，于20～50℃反應(yīng)1～10h，再加入乙二醇，繼續(xù)反應(yīng)1～5h后透析，冷凍干燥得醛基化醚化淀粉。將采用上述方法醚化后的得到的醚化淀粉再進(jìn)一步醛基化處理得到醛基化醚化淀粉后，可在添加很少量殼聚糖成本較低的條件下使得制備得到的止血生物海綿具有優(yōu)異的止血、抑菌效果。且醛基化醚化淀粉中的醛基還能與殼聚糖中的氨基官能團發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步改善其機械性能。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述醚化劑與所述淀粉的質(zhì)量比為0.2～10:1，例如，所述醚化劑與所述淀粉的質(zhì)量還可為0.2～5:1、0.2～2:1、1～2:1等；在制備醛基化醚化淀粉的過程中，醚化淀粉與高碘酸鈉的質(zhì)量比為0.2～10:1，例如，所述醚化淀粉與高碘酸鈉的質(zhì)量比還可為0.2～5:1、0.2～2:1、0.2～1:1等。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，所述醚化劑為叔胺烷基醚化劑或季銨烷基醚化劑，優(yōu)選為叔胺烷基醚化劑。例如，本發(fā)明中的叔胺烷基醚化劑可包含但不限于選自2-氯乙基二乙胺、n,n-二甲氨基氯丙烷鹽酸鹽等。本發(fā)明中所述季銨烷基醚化劑可包含但不限于選自2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨等。但當(dāng)叔胺烷基醚化劑或季銨烷基醚化劑選自這幾種物質(zhì)時，得到的止血生物海綿的止血、抑菌效果更佳。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，所述淀粉選自羥丙基淀粉、可溶性淀粉、玉米淀粉和馬鈴薯淀粉中的一種。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，所述殼聚糖與改性淀粉的質(zhì)量比為0.1～20:1。更優(yōu)選地，所述殼聚糖與改性淀粉的質(zhì)量比為1～8:1，此時的抑菌、止血效果更佳，且殼聚糖的添加量少，制備成本得到降低。例如，所述殼聚糖與改性淀粉的質(zhì)量比還可為3～8:1等。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，所述殼聚糖的脫乙酰度為70％～95％，分子量為2萬～100萬，更優(yōu)選地，所述殼聚糖的分子量為2萬～10萬，最優(yōu)選為2萬～5萬。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述熱處理的溫度為25～90℃，時間為1～4天；更優(yōu)選地，所述熱處理的溫度為40～80℃。熱處理的溫度還可進(jìn)一步為40～70℃等。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述低溫冷凍的條件為在-10～-80℃溫度下冷凍1～12h。更優(yōu)選地，所述低溫冷凍的冷凍溫度為-40～-80℃；最優(yōu)選地，所述低溫冷凍的冷凍溫度為-50～-80℃時更有助于改善得到的止血生物海綿的良好海綿形貌特性。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述醋酸溶液的質(zhì)量濃度為0.1％～5％。例如，醋酸溶液的質(zhì)量濃度還可為0.1～3％、0.1～2％等。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述輻照滅菌采用的是co60輻照滅菌。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述制備方法中，在向殼聚糖的醋酸溶液中加入甘油、淀粉后，還包括加入甘油和發(fā)泡劑中的一種或兩種的步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體的實際需要進(jìn)行添加并確定其具體可選的物質(zhì)及添加量。示例的當(dāng)加入甘油時，殼聚糖與甘油的質(zhì)量比可為4～20:1。示例的發(fā)泡劑可為泊洛沙姆發(fā)泡劑，如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407等。為達(dá)到上述第二個目的，本發(fā)明還提供上述制備方法制備得到的增強型抗菌止血生物海綿。本發(fā)明中，如無特殊說明，使用的原料均可通過市售商購獲得。且本發(fā)明中未具體提及的制備工藝或設(shè)備本領(lǐng)域技術(shù)人員均可通過本領(lǐng)域的常規(guī)手段進(jìn)行。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明的制備方法中，通過對反應(yīng)原料及反應(yīng)步驟的控制，從而制備得到強度較好、止血及抑菌性能均優(yōu)異同時還具有一定的生物降解能力的抗菌止血生物海綿。本發(fā)明的制備方法操作簡單，易于實施。且制備得到的增強型抗菌止血生物海綿相比較現(xiàn)有報導(dǎo)的殼聚糖海綿具有更突出的止血效果，以及意料不到的抑菌效果，同時其強度也更好。將對創(chuàng)傷止血和創(chuàng)口感染都有很好的治療效果，有望應(yīng)用于臨床。附圖說明下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1示出采用本發(fā)明實施例2中的抑菌止血生物海綿與市售殼聚糖海綿進(jìn)行止血處理后的效果。具體實施方式為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1增強型抗菌止血生物海綿的制備方法，步驟如下：1)稱取6g馬鈴薯淀粉溶于200ml去離子水中，1.8g氫氧化鈉溶于40ml去離子水中，6g2-氯乙基二乙胺溶于10ml去離子水中；依次將naoh溶液和2-氯乙基二乙胺溶液滴加到淀粉溶液中，于50℃溫度下攪拌反應(yīng)4h；透析，凍干后得到改性淀粉a(即醚化淀粉)；2)將2.0g殼聚糖(脫乙酰度為85％，分子量為2萬)溶于100ml醋酸溶液(0.5％)中，向其中滴加0.5g甘油，0.5g改性淀粉a，50ml泊洛沙姆發(fā)泡劑(0.4g)溶液，常溫攪拌反應(yīng)4h，得發(fā)泡液，將得到的發(fā)泡液倒入模具中，后于-80℃冰箱里冷凍12h，并于凍干機中冷凍干燥，再經(jīng)40℃熱處理3天后，用co60輻照滅菌即可得到非交聯(lián)型的增強型抗菌止血生物海綿，該抗菌止血生物海綿具有好的可生物降解性，且形貌規(guī)整。實施例2增強型抗菌止血生物海綿的制備方法，步驟如下：1)稱取6g馬鈴薯淀粉溶于200ml去離子水中，6g醚化劑2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨溶于10ml去離子水中，1.8g氫氧化鈉溶于40ml去離子水中，分別將其滴加到淀粉溶液中，于40℃溫度下攪拌反應(yīng)8h；透析，凍干后得到改性淀粉a(即醚化淀粉)；2)稱取1.5g改性淀粉a溶于150ml去離子水中，向其中加10ml高碘酸鈉溶液(0.5g/ml)，40℃攪拌反應(yīng)2h，向其中滴加4ml乙二醇，攪拌反應(yīng)1h后，透析，凍干后得到改性淀粉b(即醛基化醚化淀粉)；3)將3.0g殼聚糖(脫乙酰度為90％，分子量為5萬)溶于120ml醋酸溶液(0.7％)中，向其中滴加0.5g甘油，0.4g改性淀粉b，40ml泊洛沙姆發(fā)泡劑(0.4g)溶液，常溫攪拌反應(yīng)2h，將發(fā)泡液倒入模具中，后于-80℃冰箱里冷凍12h，并于凍干機中冷凍干燥，經(jīng)50℃熱處理4天后，co60輻照滅菌即可得到交聯(lián)型增強型抗菌止血生物海綿，且該生物海綿具有規(guī)整的形貌。實施例3增強型抗菌止血生物海綿的制備方法，步驟如下：1)稱取6g玉米淀粉溶于200ml去離子水中，1.8g氫氧化鈉溶于40ml去離子水中，6g2-氯乙基二乙胺溶于10ml去離子水中；依次將naoh溶液和2-氯乙基二乙胺溶液滴加到淀粉溶液中，于50℃溫度下攪拌反應(yīng)4h；透析，凍干后得到改性淀粉a(醚化淀粉)；2)將2.0g殼聚糖(脫乙酰度為90％，分子量為5萬)溶于100ml醋酸溶液(0.5％)中，向其中滴加0.5g甘油，0.5g改性淀粉a，常溫攪拌反應(yīng)4h，將得到的反應(yīng)液倒入模具中，后于-80℃冰箱里冷凍12h，并于凍干機中冷凍干燥，再經(jīng)50℃熱處理3天后，用co60輻照滅菌即可得到非交聯(lián)型的增強型抗菌止血生物海綿。實施例4增強型抗菌止血生物海綿的制備方法，步驟如下：1)稱取6g馬鈴薯淀粉溶于200ml去離子水中，6g醚化劑2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨溶于10ml去離子水中，1.8g氫氧化鈉溶于40ml去離子水中，分別將其滴加到淀粉溶液中，于40℃溫度下攪拌反應(yīng)8h；透析，凍干后得到改性淀粉a(即醚化淀粉)；2)稱取1.6g改性淀粉a溶于150ml去離子水中，向其中加12ml高碘酸鈉溶液(0.5g/ml)，40℃攪拌反應(yīng)2h，向其中滴加3.8ml乙二醇，攪拌反應(yīng)1h后，透析，凍干后得到改性淀粉b(即醛基化醚化淀粉)；3)將2.8g殼聚糖(脫乙酰度為90％，分子量為5萬)溶于120ml醋酸溶液(0.7％)中，向其中滴加0.5g甘油，0.4g改性淀粉b，40ml泊洛沙姆發(fā)泡劑(0.4g)溶液，常溫攪拌反應(yīng)2h，將發(fā)泡液倒入模具中，后于-80℃冰箱里冷凍14h，并于凍干機中冷凍干燥，co60輻照滅菌即可得到交聯(lián)型抗菌止血生物海綿。實施例5淀粉抗菌止血生物海綿的制備方法，步驟如下：1)稱取6g馬鈴薯淀粉溶于200ml去離子水中，1.8g氫氧化鈉溶于40ml去離子水中，6g2-氯乙基二乙胺溶于10ml去離子水中；依次將naoh溶液和2-氯乙基二乙胺溶液滴加到淀粉溶液中，于50℃溫度下攪拌反應(yīng)4h；透析，凍干后得到改性淀粉a(即醚化淀粉)；2)將2g改性淀粉a溶解到50ml水中，攪拌10min后加入3g甘油、0.5g泊洛沙姆發(fā)泡劑，繼續(xù)攪拌40min，隨后將發(fā)泡液倒入模具中，并迅速轉(zhuǎn)移到-30℃冰箱中，冷凍24h，把得到的樣品冷凍干燥，得到淀粉抗菌止血海綿。對比例1殼聚糖抗菌止血生物海綿的制備方法，步驟如下：將2.0g殼聚糖(脫乙酰度為90％，分子量為5萬)溶于100ml醋酸溶液(0.5％)中，向其中滴加0.5g甘油，50ml泊洛沙姆發(fā)泡劑(0.4g)溶液，常溫攪拌反應(yīng)4h，將得到的反應(yīng)液倒入模具中，后于-80℃冰箱里冷凍12h，并于凍干機中冷凍干燥，再經(jīng)50℃熱處理3天后，用co60輻照滅菌即可得到殼聚糖止血生物海綿。實驗例1制備的增強型抗菌止血生物海綿和市售殼聚糖海綿進(jìn)行抑菌效果對比實驗檢測條件：將實施例1～5及對比例1的殼聚糖止血生物海綿進(jìn)行菌液供培養(yǎng)抑菌實驗。檢測用菌為大腸桿菌atcc25922。檢測方法：將培養(yǎng)好的大腸桿菌atcc25922在培養(yǎng)基里稀釋至約1×105cfu/ml，分為7組，分別將15ml的含菌培養(yǎng)液加入到50ml的離心管中。再分別稱取150mg實施例1～5的增強型抗菌止血生物海綿及對比例1的殼聚糖止血生物海綿分別浸泡于前述含菌培養(yǎng)液的離心管中，空白對照組中不添加海綿。再分別將離心管在37℃溫度下輕微振蕩培養(yǎng)18h，然后分別吸取0.1ml培養(yǎng)液加入96孔板中，用酶標(biāo)儀讀取各個孔在600nm處的吸收光強。為確保實驗的準(zhǔn)確性，每組樣品測試5個平行樣本，統(tǒng)計平均值。抑菌率結(jié)果如下表1所示。表1各實施例及對比例樣品的抑菌實驗結(jié)果分組抑菌率(平均值)實施例1樣品80.12％±0.44％實施例2樣品82.97％±0.52％實施例3樣品82.85％±0.45％實施例4樣品81.19％±0.48％實施例5樣品80.09％±0.48％對比例1樣品3.37％±0.64％空白對照組0實驗例2制備的增強型抗菌止血生物海綿和對比例1的殼聚糖生物止血海綿進(jìn)行止血效果對比實驗檢測方法：選取21只2.5kg4～6周健康大耳白兔，隨機分為7組，每組3只大耳白兔。將白兔麻醉后固定于操作臺上，耳部部分去毛后，漏出一側(cè)耳靜脈，橫向切開，令其自由噴血10s，然后根據(jù)分組將實施例1～5抑菌止血海綿及對比例1殼聚糖生物止血海綿進(jìn)行加壓止血處理，記錄止血時間和止血效果(拍照)，空白對照組不做任何止血處理。其中，每組樣品分別測試三個平行樣本，統(tǒng)計平均值。采用實施例2中的抑菌止血生物海綿與對比例1殼聚糖生物止血海綿進(jìn)行止血處理后的效果如圖1所示，從圖1中可知，本發(fā)明實施例所得抗菌止血生物海綿具有優(yōu)異的快速止血效果。實施例及對比例的止血時間如表2所示。表2各實施例及對比例樣品的止血實驗結(jié)果分組止血時間(s)實施例1樣品22±2實施例2樣品18±2實施例3樣品29±4實施例4樣品32±5實施例5樣品48±3對比例1樣品61±6空白對照組不能止血顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。當(dāng)前第1頁12