本發(fā)明屬于天然藥物或天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一種竹葉蘭提取物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：竹葉蘭(arundinagraminifolia)，別名長桿蘭，為蘭科竹葉蘭屬多年生草本植物，生于草坡、溪谷旁、灌叢下或林中。傣族人民稱之為“農(nóng)尚嗨”、“百樣解”。“農(nóng)尚嗨”意為吃了就好，“百樣解”意為解百毒，可以治療食物中毒、毒蛇咬傷、瘡癰腫毒，是傣醫(yī)別具特色的解毒良藥。沙門氏菌屬于腸桿菌科，是一種常見的食源性致病菌。在世界各國的細(xì)菌性食物中毒種類中，沙門氏菌引起的食物中毒常居榜首。我國內(nèi)陸地區(qū)食物中毒也以沙門氏菌為首位。除了感染人類外，沙門氏菌還可感染很多動(dòng)物包括哺乳類、鳥、爬行類、魚、兩棲類及昆蟲。人畜感染后可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾，它可能加重病情或死亡率，或者降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種竹葉蘭提取物的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述制備方法制備得到的竹葉蘭提取物。該提取物具有抑制沙門氏菌的作用。本發(fā)明的另一目的在于提供上述竹葉蘭提取物的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種竹葉蘭提取物的制備方法，包括如下步驟：(1)竹葉蘭干燥粉碎，按每克原料藥1～100ml的用量加入體積濃度10％～100％的乙醇溶劑浸泡0～24h，熱回流提取1～4次，每次0.5～6h，過濾，合并提取液，減壓濃縮，得到竹葉蘭乙醇提取物濃縮液；(2)將步驟(1)得到的竹葉蘭乙醇提取物濃縮液按照干膏與硅膠質(zhì)量比1:0.1～1:100，拌勻，蒸干，依次先用石油醚熱回流洗脫0.5～48h，再用乙酸乙酯熱回流洗脫0.5～48h，除雜；(3)最后用丙酮或甲醇熱回流洗脫0.5～30h，收集丙酮或甲醇洗脫液，減壓濃縮，干燥，即得到竹葉蘭提取物；或者，先用丙酮熱回流洗脫2～20h，再用甲醇熱回流洗脫10～20h，收集甲醇洗脫液，減壓濃縮，干燥，即得到竹葉蘭提取物。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的粉碎為粉碎至2～3cm長度的小段。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的乙醇溶劑的用量為6～12ml/g竹葉蘭。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的乙醇溶劑的體積濃度為70～95％。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的浸泡的時(shí)間為1～12h；更優(yōu)選為2～12h。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的提取是提取次數(shù)2～3次，每次2h；更優(yōu)選是提取次數(shù)3次，每次2h。優(yōu)選的，步驟(2)中所述的硅膠為100～300目硅膠；更優(yōu)選為100～200目硅膠；優(yōu)選的，步驟(2)中所述的濃縮液干膏與硅膠質(zhì)量比1:1～1:5；更優(yōu)選為1:1～1:3。優(yōu)選的，步驟(2)中所述的用石油醚熱回流洗脫的時(shí)間為2～16h；更優(yōu)選為2～10h；優(yōu)選的，步驟(2)中所述的用乙酸乙酯熱回流洗脫的時(shí)間為2～16h；更優(yōu)選為10～16h。優(yōu)選的，步驟(3)中所述的用丙酮或甲醇熱回流洗脫的時(shí)間為2～20h；更優(yōu)選為15～20h。優(yōu)選的，步驟(3)中所述的先用丙酮熱回流洗脫10～15h，再用甲醇熱回流洗脫20h。一種竹葉蘭提取物，通過上述制備方法制備得到。所述的竹葉蘭提取物能夠抑制沙門氏菌的增殖，可以用于制備防治沙門氏菌感染的產(chǎn)品。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：(1)本發(fā)明通過一定濃度的乙醇提取，提取濃縮液用粗硅膠吸附分散后，裝入恒壓分液漏斗，結(jié)合“固液萃取和連續(xù)回流洗脫技術(shù)”，先用石油醚、乙酸乙酯洗脫除雜，最后用丙酮或甲醇回流洗脫，收集洗脫物，得到竹葉蘭提取物，對(duì)沙門氏菌具有抑菌作用。(2)本發(fā)明的制備方法操作簡單，連續(xù)性強(qiáng)，耗時(shí)短，效率高，節(jié)約溶劑。本發(fā)明的提取物可用于制備防治沙門氏菌感染的產(chǎn)品。附圖說明圖1是竹葉蘭提取物a、竹葉蘭提取物b、氨芐青霉素鈉對(duì)沙門氏菌的抑菌效果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1竹葉蘭提取物的制備取干燥粉碎竹葉蘭100g，用體積分?jǐn)?shù)70％的乙醇溶劑1000ml浸泡2h后，加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮。所得濃縮液與100～200目硅膠按質(zhì)量比1:1吸附混勻，蒸干，裝入恒壓分液漏斗，先用石油醚熱回流洗脫10h，再用乙酸乙酯熱回流洗脫16h，隨后用丙酮熱回流洗脫10h，最后用甲醇熱回流洗脫20h，收集甲醇洗脫液，減壓濃縮干燥，得到竹葉蘭提取物，記作：竹葉蘭提取物a。實(shí)施例2竹葉蘭提取物的制備取干燥粉碎竹葉蘭100g，用體積分?jǐn)?shù)70％的乙醇溶劑1100ml浸泡4h后，加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮。所得濃縮液與100～200目硅膠按質(zhì)量比1:1吸附混勻，蒸干，裝入恒壓分液漏斗，先用石油醚熱回流洗脫10h，再用乙酸乙酯熱回流洗脫16h，然后用丙酮熱回流洗脫20h，收集丙酮洗脫液，減壓濃縮干燥，得到竹葉蘭提取物，記作：竹葉蘭提取物b。實(shí)施例3竹葉蘭提取物的制備取干燥粉碎竹葉蘭100g，用體積分?jǐn)?shù)80％的乙醇溶劑600ml浸泡6h后，加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮，所得濃縮液與100～200目硅膠按質(zhì)量比1:2吸附混勻，蒸干，裝入恒壓分液漏斗，先用石油醚熱回流洗脫5h，再用乙酸乙酯熱回流洗脫14h，然后甲醇熱回流洗脫15h，收集甲醇洗脫液，減壓濃縮干燥，得到竹葉蘭提取物。實(shí)施例4竹葉蘭提取物的制備取干燥粉碎竹葉蘭100g，用體積分?jǐn)?shù)95％的乙醇溶劑1200ml浸泡12h后，加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮，所得提取液與200～300目硅膠按質(zhì)量比1:3吸附混勻，蒸干，裝入恒壓分液漏斗，先用石油醚熱回流洗脫2h，再用乙酸乙酯熱回流洗脫10h，隨后用丙酮熱回流洗脫15h，最后用甲醇熱回流洗脫20h，收集甲醇洗脫液，減壓濃縮干燥，得到竹葉蘭提取物。實(shí)施例5竹葉蘭提取物體外抑制沙門氏菌的實(shí)驗(yàn)研究沙門氏菌s.choleraesuisatcc13312購自廣州微生物研究所；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基依藥典配制；氨芐青霉素鈉由上海mym生物科技有限公司提供；dmso購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司。從保存完好的固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)16～18h，轉(zhuǎn)速100rpm，調(diào)整菌液濃度為106cfu/ml。樣品的處理：按實(shí)施例1方法制得竹葉蘭提取物a，實(shí)施例2方法制得竹葉蘭提取物b，加入適量dmso溶解，濃度為10mg/ml。采用牛津杯法測定抑菌圈大小。取100μl106cfu/ml菌懸液加入滅菌凝固后的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，均勻涂布。將直徑為6mm的牛津杯置于平板上，每個(gè)牛津杯中加入100μl10mg/ml的供試品溶液，37℃恒溫培養(yǎng)24h后用直尺測量抑菌圈大小。每個(gè)平板放三個(gè)牛津杯作為平行。以dmso為陰性對(duì)照，氨芐青霉素鈉為陽性對(duì)照。結(jié)果如表1和圖1所示。表1竹葉蘭提取物對(duì)沙門氏菌的抑菌圈直徑(n＝3)抑菌圈直徑/mm竹葉蘭提取物a(10mg/ml)16竹葉蘭提取物b(10mg/ml)13氨芐青霉素鈉(10μg/ml)14dmso0竹葉蘭提取物對(duì)沙門氏菌的最小抑菌濃度及最小殺菌濃度的測定。二倍稀釋法測最小抑菌濃度：100μl牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基逐孔加入96孔板，然后取100μl供試品溶液(10mg/ml)加入第1孔，吹打均勻后，吸取100μl加入第2孔，第2孔混勻后，取100μl加入第3孔，依次類推至第6孔，第7孔、第8孔不加藥液。取100μl制備好的105cfu/ml的菌懸液加入第1至7孔，第8孔不加菌液。將96孔板置于恒溫震蕩器中37℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)后培養(yǎng)液澄清，即無明顯細(xì)菌生長的最低濃度為最小抑菌濃度。吸取培養(yǎng)24h后仍然澄清的培養(yǎng)液100μl，涂布于固體平板上，37℃于恒溫震蕩器中傳代培養(yǎng)24h。無菌落生長的最低濃度記為最小殺菌濃度。每組實(shí)驗(yàn)三個(gè)平行樣，以5％～0.16％的dmso為陰性對(duì)照。表2竹葉蘭提取物對(duì)沙門氏菌的最小抑菌濃度及最小殺菌濃度最小抑菌濃度(μg/ml)最小殺菌濃度(μg/ml)竹葉蘭提取物a2500>2500竹葉蘭提取物b2500>2500dmso無無從表1、表2、圖1得知，抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果與最小抑菌濃度、最小殺菌濃度測定結(jié)果具有一致性，表明本發(fā)明提供的竹葉蘭提取物能夠抑制沙門氏菌的增殖。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12