本發(fā)明屬于基因工程藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種基因工程菌vnp20009-m在制備預(yù)防和治療惡性肉瘤藥物中的新應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：癌癥已經(jīng)成為人類死亡的重要原因，2005年至2015年間癌癥發(fā)病率增加了33％。世界衛(wèi)生組織(who)發(fā)表的《全球癌癥報(bào)告2014》預(yù)測(cè)全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，由2012年的1400萬(wàn)人，逐年遞增至2025年的1900萬(wàn)人，到2035年將達(dá)到2400萬(wàn)人。肉瘤(sarcoma)是來(lái)源于間葉組織(包括結(jié)締組織和肌肉)的惡性腫瘤，多發(fā)生于脂肪、筋膜、肌肉、纖維、淋巴及血管、骨膜及長(zhǎng)骨兩端。每種肉瘤都有不同的組織學(xué)、生物學(xué)特性和不一樣的局部浸潤(rùn)、血行和淋巴轉(zhuǎn)移傾向，其中肉瘤向肺轉(zhuǎn)移較為常見(jiàn)。肉瘤的臨床表現(xiàn)是腫塊，當(dāng)腫塊增大壓迫周圍組織時(shí)產(chǎn)生癥狀。肉瘤的發(fā)病率很低，年發(fā)病率為2.4-5例/10萬(wàn)人，約占成人惡性腫瘤的1％，占兒童惡性腫瘤的15％，但卻占所有癌癥相關(guān)死亡率的2％。由于肉瘤亞型眾多，生物學(xué)行為多種多樣，因此診斷比較困難，往往發(fā)現(xiàn)時(shí)病情較晚，約1/3-1/2的患者死于肉瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)有醫(yī)療手段對(duì)晚期肉瘤的治療發(fā)展一直停滯不前，化療仍然是標(biāo)準(zhǔn)的治療方法，例如含阿霉素的治療是標(biāo)準(zhǔn)方案，經(jīng)治患者的總生存期大概只有12-16個(gè)月?？傮w來(lái)說(shuō)，早期患者5年生存率約60％-80％，晚期患者5年生存率不足20％。現(xiàn)有技術(shù)表明，甲硫氨酸依賴是絕大部分腫瘤細(xì)胞的特性，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞對(duì)甲硫氨酸的過(guò)分需求，在去除甲硫氨酸或以其前體--同型半胱氨酸替代的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞增殖受到抑制；而在甲硫氨酸存在的環(huán)境下則能正常生長(zhǎng)，其中包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌等十多種惡性腫瘤細(xì)胞。但是，正常細(xì)胞不存在甲硫氨酸依賴性。造成甲硫氨酸缺乏的方法主要包括去除膳食中的甲硫氨酸，或者利用甲硫氨酸酶分解甲硫氨酸。然而單獨(dú)限制飲食中甲硫氨酸的攝入來(lái)降低甲硫氨酸水平效果有限，而長(zhǎng)期限制甲硫氨酸的攝入會(huì)引起機(jī)體營(yíng)養(yǎng)不良、代謝障礙。相比于飲食限制甲硫氨酸攝入，利用甲硫氨酸酶(methioninase)不會(huì)引發(fā)過(guò)度的代謝問(wèn)題，并具抗腫瘤效應(yīng)。沙門菌屬是一群在人和動(dòng)物腸道內(nèi)寄生的革蘭氏陰性、侵襲性細(xì)胞內(nèi)兼性厭氧菌。其中，已知菌株vnp20009是一種高腫瘤靶向性、安全性以及具有抗腫瘤效應(yīng)的載體。它對(duì)惡性黑色素瘤、肺癌等多種小鼠實(shí)體瘤模型有顯著的抑制腫瘤生長(zhǎng)效果。美國(guó)進(jìn)行的兩項(xiàng)ⅰ期臨床研究表明其可以用于人體，具有安全性，但是沒(méi)有觀察到抗腫瘤效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種基因工程菌vnp20009-m在制備預(yù)防和治療肉瘤藥物中的新應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了所述的基因工程菌vnp20009-m在制備預(yù)防和治療惡性肉瘤藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步的，所述肉瘤為來(lái)源于結(jié)締組織和肌肉等間葉組織的惡性肉瘤。進(jìn)一步的，所述肉瘤包括發(fā)生于脂肪、筋膜、肌肉、纖維、淋巴及血管、骨膜及長(zhǎng)骨兩端的肉瘤。進(jìn)一步的，所述肉瘤包括軟組織肉瘤和骨肉瘤?，F(xiàn)有軟組織肉瘤患者中，以多形性未分化肉瘤(undifferentiatedpleomorphicsarcoma，ups)最多見(jiàn)，占25-35％；其次是脂肪肉瘤(1iposarcoma，lps)，占25-30％；平滑肌肉瘤(1eiomyosarcoma，lms)12％；滑膜肉瘤(synovialsarcoma，ss)占10％；惡性周圍神經(jīng)鞘膜瘤(malignantperipheralnervesheathtumor，mpnst)占6％。骨肉瘤又稱為成骨肉瘤，多發(fā)生在20歲以下的青少年或兒童。骨肉瘤是從間質(zhì)細(xì)胞系發(fā)展而來(lái)，由于腫瘤經(jīng)軟骨階段直接或間接形成腫瘤骨樣組織和骨組織使得腫瘤迅速生長(zhǎng)。骨肉瘤在小兒骨惡性腫瘤中最為常見(jiàn)，約為小兒腫瘤的5％。所述肉瘤包括原發(fā)肉瘤、術(shù)后復(fù)發(fā)肉瘤、或術(shù)后轉(zhuǎn)移至其他部位的肉瘤。進(jìn)一步的，所述肉瘤為惡性肉瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移至肺部的腫瘤。優(yōu)選的，所述基因工程菌vnp20009-m的最低有效施用劑量為6.4×107cfu/m2。上述腫瘤預(yù)防和治療的給藥方式可通過(guò)多種途徑進(jìn)行給藥，包括但不限于：口服給藥、局部給藥、注射給藥(包括但不限于經(jīng)靜脈、腹膜、皮下、肌肉、瘤內(nèi)給藥)等。如現(xiàn)有技術(shù)中已知的，本發(fā)明上述基因工程菌vnp20009-m為已知菌株，其性能、形狀、構(gòu)建方法均如中國(guó)專利cn105983103a中所記載。所述基因工程菌vnp20009-m為克隆有l(wèi)-methioninase基因的減毒鼠傷寒沙門氏菌vnp20009。進(jìn)一步的，所述的基因工程菌vnp20009-m為攜帶了質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌vnp20009，其中，所述質(zhì)粒上克隆有l(wèi)-methioninase基因。所述的基因工程菌vnp20009-m按照如下方法構(gòu)建得到：將l-methioninase基因亞克隆至質(zhì)粒中，得到l-methioninase表達(dá)質(zhì)粒，將lmethioninase表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌vnp20009，即得。所述質(zhì)粒包括但不限于psvsport質(zhì)粒、ptrc99a質(zhì)粒、pcdna3.1質(zhì)粒、pbr322質(zhì)?；騪et23a質(zhì)粒。最為優(yōu)選的是，在構(gòu)建基因工程菌vnp20009-m的過(guò)程中，當(dāng)選用psvsport質(zhì)粒時(shí)，將l-methioninase基因亞克隆至質(zhì)粒中，得到l-methioninase表達(dá)質(zhì)粒，然后將lmethioninase表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌vnp20009中得到基因工程菌。其中，所述的電轉(zhuǎn)化條件為電壓2400v，電阻400ω，電容25μf，放電時(shí)間4ms。本發(fā)明還公開(kāi)了基因工程菌vnp20009-m在制備甲硫氨酸酶劑中的應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)了所述基因工程菌vnp20009-m在現(xiàn)有基礎(chǔ)上用于治療惡性肉瘤的新應(yīng)用，所述基因工程菌vnp20009-m能夠有效殺傷腫瘤細(xì)胞，消除腫瘤病灶，對(duì)于原發(fā)性肉瘤、術(shù)后復(fù)發(fā)腫瘤、以及惡性肉瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移至其他部位的腫瘤細(xì)胞，都具有較好的殺傷效果，治療效果較佳；尤其是對(duì)于軟組織肉瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移至肺部的腫瘤，具有較好的殺傷效果；而且所述基因工程菌對(duì)人體無(wú)明顯毒副作用，為惡性肉瘤的治療提供了安全有效的新途徑。附圖說(shuō)明為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中，圖1為質(zhì)粒psvsport-l-methioninase酶切鑒定1％瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為本發(fā)明是westernblot鑒定methioninase表達(dá)結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明檢測(cè)沙門氏菌中methioninase活性結(jié)果圖；圖4為實(shí)施例2中患者治療前的胸部ct檢查病灶狀況；圖5為實(shí)施例2中患者治療4周后的胸部ct檢查結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1基因工程菌vnp20009-m的構(gòu)建本發(fā)明所述基因工程菌vnp20009-m的構(gòu)建方法和過(guò)程如中國(guó)專利cn105983103a中實(shí)施例中所記載。(1)構(gòu)建表達(dá)l-methioninase基因的質(zhì)粒。先合成l-methioninase(genbank：l43133.1)基因亞克隆至puc57質(zhì)粒(金斯瑞公司)，接著通過(guò)kpni和hindiii酶切位點(diǎn)亞克隆至psvsport質(zhì)粒(invitrogen)，得到psvsport-l-methioninase表達(dá)質(zhì)粒。具體構(gòu)建過(guò)程如下：將psvsport質(zhì)粒用kpni和hindiii雙酶切，酶切體系為：2μg質(zhì)粒dna，3μl10×buffer，1.5μlkpni酶，1.5μlhindiii酶，加入ddh2o補(bǔ)足體積至30μl，37℃溫浴3h。然后將酶切體系在1％的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離，切出4.1kb大小的dna條帶，用膠回收純化試劑盒純化dna。通過(guò)全基因合成得到l-methioninase編碼區(qū)域dna片段亞克隆至puc57質(zhì)粒(金斯瑞公司)，用kpni和hindiii雙酶切，酶切體系為：3μg質(zhì)粒dna，3μl10×buffer，1.5μlkpni酶，1.5μlhindiii酶，加入ddh2o補(bǔ)足體積至30μl，37℃溫浴3h。然后將酶切體系在1％的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離，切出1.2kb大小的dna條帶，用膠回收純化試劑盒純化dna。將psvsport(kpni/hindiii)和l-methioninase編碼區(qū)域dna片段(kpni/hindiii)連接，連接反應(yīng)中加入2μl載體、6μl插入片段、1μlt4dna連接酶，16℃溫浴16h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到e.colidh5α(takara)的感受態(tài)細(xì)胞中。取一管50μl的dh5α感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，待其融化后，向其中加入5μl上述連接產(chǎn)物，輕彈混勻，后于冰上孵育30min；42℃熱擊60s，后冰上靜置2min；加入500μl無(wú)抗性的lb液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)1h后涂布在含氨芐青霉素抗性的lb培養(yǎng)基平板上，過(guò)夜培養(yǎng)。克隆生長(zhǎng)出來(lái)后，挑單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)16h，提取質(zhì)粒dna，用kpni和hindiii酶切鑒定，陽(yáng)性克隆中可得到4.1kb、1.2kb的兩條dna條帶，如圖1所示。再通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆的序列完全正確。(2)構(gòu)建攜帶質(zhì)粒的vnp20009菌和攜帶克隆有l(wèi)-methioninase的基因的質(zhì)粒的vnp20009菌。將psvsport和psvsport-l-methioninase表達(dá)質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至vnp20009菌株(ys1646，atcc號(hào)202165)，分別命名為vnp20009-v和vnp20009-m。具體構(gòu)建過(guò)程如下：將感受態(tài)細(xì)菌vnp20009置于冰上，待其融化后移入預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，向其中加入2μl質(zhì)粒，輕彈混勻，于冰上孵育1min。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀，條件設(shè)置為電壓2400v，電阻400ω，電容25μf，放電時(shí)間4ms。電擊完立刻加入1mlsoc培養(yǎng)基，輕輕混勻。37℃震蕩培養(yǎng)1h；用移液器將細(xì)菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨芐青霉素抗性的lb-o培養(yǎng)基平板上。然后將平板置于37℃溫箱培養(yǎng)16h。vnp20009-v和vnp20009-m用lb-o培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確。取1×108沙門菌用蛋白裂解液提取蛋白，進(jìn)行10％sds-page電泳，再穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至pvdf膜，bsa室溫封閉1h后，tbst漂洗3×5min，加入兔抗l-methioninase抗體(1：1000)，4℃孵育過(guò)夜。tbst漂洗3次，每次5min再加hrp標(biāo)記的抗兔二抗(1：10000)，室溫孵育1h，tbst漂洗3次，每次5min，ecl化學(xué)發(fā)光法顯影。結(jié)果如圖2所示，在分子量約43kd處有特異性條帶，說(shuō)明vnp20009-m與vnp20009、vnp20009-v相比，l-methioninase表達(dá)量顯著提高。將l-甲硫氨酸和吡哆醛分別與vnp20009-v和vnp20009-m菌體混合，37℃孵育10min后用50％三氯乙酸終止，離心取上清，與3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物(mbth)充分混勻，50℃孵育30min后，測(cè)定320nm處的吸光值，以每分鐘催化轉(zhuǎn)化1μmolα-酮丁酸的酶量定義為1個(gè)酶活性單位。結(jié)果顯示(如圖3所示)，沙門菌vnp20009-m的甲硫氨酸酶活性比vnp20009-v高10倍。可見(jiàn)，所構(gòu)建基因工程菌沙門菌vnp20009-m具有較高的甲硫氨酸酶活性，可作為甲硫氨酸酶劑的制備之用。實(shí)施例2基因工程菌vnp20009-m治療軟組織肉瘤的效果1)過(guò)往病史及診斷臨床一男性患者，64歲，左腿腫塊在南京市鼓樓醫(yī)院經(jīng)穿刺活檢鑒定為梭形細(xì)胞肉瘤。后行腫瘤切除術(shù)，再次取組織分析病理，顯示腫瘤細(xì)胞sma(－)、des(－)、myod1(－)、fn(+)、stat6(－)、cd34(－)、s100(－)、ckpan(－)、ema(－)、vimentin(++)，結(jié)合he切片，符合惡性纖維組織細(xì)胞瘤。后定期隨訪復(fù)查ct發(fā)現(xiàn)右肺上葉軟組織占位，穿刺活檢病理顯示梭形細(xì)胞肉瘤。根據(jù)患者既往治療及相關(guān)檢查，診斷梭形細(xì)胞肉瘤術(shù)后復(fù)發(fā)肺轉(zhuǎn)移。2)治療方案以250ml生理鹽水稀釋的基因工程菌vnp20009-m通過(guò)靜脈輸入體內(nèi)，劑量為6.4×107cfu/m2。每次間隔1周，共輸液5次。3)療效3.1腫瘤大小變化治療前的胸部ct檢查顯示右肺上葉病灶大小約為18*10*10cm(如圖4所示)。治療4周以后，ct檢查顯示右肺上葉病灶大小約為17*10*10cm(如圖5所示)，與治療前相比腫瘤大小無(wú)明顯變化。3.2腫瘤內(nèi)部變化治療前，ct圖像顯示肺部病灶內(nèi)部呈片狀液化壞死。如圖4所示，白線圈出的病灶內(nèi)部呈現(xiàn)不均勻的顏色，較黑區(qū)域表示此處的細(xì)胞已經(jīng)壞死，較亮區(qū)域表示活細(xì)胞。治療4周后，ct圖像顯示病灶內(nèi)部呈均一性結(jié)構(gòu)(如圖5所示)，ct值約為10hu。ct值指示物質(zhì)密度，當(dāng)它低于20hu表示物質(zhì)為液態(tài)，提示該區(qū)域腫瘤細(xì)胞基本壞死呈現(xiàn)液態(tài)。由此說(shuō)明，經(jīng)vnp20009-m治療后，肉瘤患者的腫瘤細(xì)胞快速壞死液化。但是由于病灶在體內(nèi)，無(wú)法抽取液體，所以未能觀察到病灶縮小。3.3副反應(yīng)每次治療當(dāng)日，輸液后5-6小時(shí)，患者發(fā)熱最高39.6度左右，物理降溫可恢復(fù)正常體溫。除此以外，無(wú)其他異常不適感覺(jué)。治療期間，檢查肝、腎功能等各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果如下表1所示。檢測(cè)結(jié)果顯示，與治療前相比，患者身體各項(xiàng)指標(biāo)基本相似。以上結(jié)果說(shuō)明vnp20009-m對(duì)患者沒(méi)有產(chǎn)生額外的毒副作用。表1患者身體各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)項(xiàng)目參考值治療前治療1周治療4周治療8周丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶0--33u/l20261619天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶0--32u/l16201321總膽紅素0--21umol/l8.39.511.715堿性磷酸酶35--104u/l719196140乳酸脫氫酶109--245u/l158160135127白蛋白35--52g/l27302924尿素氮2.86--8.21mmol/l4.362.413.22.23肌酐59-104umol/l55575152鉀3.5--5.1mmol/l3.14.144.013.56鈉136--145mmol/l138134136137血小板125--35010*9/l118153155103以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，vnp20009-m能夠有效殺傷惡性肉瘤細(xì)胞，消除腫瘤病灶，而且對(duì)人體無(wú)嚴(yán)重毒副作用。顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。當(dāng)前第1頁(yè)12