一、技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物、化學(xué)和藥品領(lǐng)域，特別涉及羥基酪醇脂質(zhì)體的制備方法。
二、
背景技術(shù)：
脂質(zhì)體主要是由類脂材料組成的雙分子層空心小球，同時(shí)具有親水性和疏水性兩種性質(zhì)，因此既能包封脂溶性物質(zhì)又能包埋水溶性物質(zhì)。將類脂材料分散于水中時(shí)，水溶性物質(zhì)會自發(fā)地分布在脂質(zhì)體的內(nèi)部，而脂溶性物質(zhì)分布在脂質(zhì)體的親脂端。脂質(zhì)體的制備方法主要有：薄膜分散法、超聲波分散法、凍融法、乙醇注入法、逆相蒸發(fā)法等。其理化性質(zhì)的評價(jià)指標(biāo)主要有：脂質(zhì)體平均粒徑及其粒徑分布、包封率、物化穩(wěn)定性等。制備的脂質(zhì)體具有靶向性、緩釋性、保護(hù)性、低劑量、長效性、低毒性等優(yōu)點(diǎn)。
長循環(huán)脂質(zhì)體又稱長效脂質(zhì)體，是一種表面含有天然或合成聚合物修飾的類脂衍生物的新型脂質(zhì)體。在血液中駐留時(shí)間延長，從而延長藥物作用時(shí)間，具有長效作用。常用的修飾物有聚乙二醇(peg)和神經(jīng)節(jié)甘酯(gm1)。gm1增強(qiáng)膜剛性，減少單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(mps)的攝取，這種長循環(huán)脂質(zhì)體在血液中的滯留量與被mps攝取量的比值高于傳統(tǒng)脂質(zhì)體幾十倍。但gm1難以大量獲得，且有一定的免疫毒性。含有peg的類脂衍生物，它們在脂質(zhì)體表面具有高度修飾的作用，能形成空間位阻層，這種立體位阻能夠保護(hù)脂質(zhì)體不被識別、攝取，使其消除減慢，作用時(shí)間延長。
油橄欖中包含大量的多酚類化合物，如橄欖苦苷、羥基酪醇、毛蕊花苷和酪醇等。尤其是羥基酪醇(3，4-二羥基苯乙醇，hydroxytyrosol，簡稱ht)，清除自由基的能力強(qiáng)，表現(xiàn)出獨(dú)特的生物和藥理活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心臟的冠脈血流、有效地抑制由丙烯醛造成視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的氧化損傷和線粒體功能失調(diào)，保護(hù)軟骨和抗骨質(zhì)疏松等。而且ht還能抑制人類早幼細(xì)胞白血病細(xì)胞hl-60、結(jié)腸癌細(xì)胞ht-29、女性乳腺癌細(xì)胞mcf-7等擴(kuò)散，透過阻滯腫瘤細(xì)胞的循環(huán)及誘發(fā)其凋亡，具有很好的抗癌活性。盡管ht有諸多生物和藥理活性，已逐漸引起研究者的關(guān)注。但是，ht含有3個(gè)酚羥基，暴露在空氣中極易被氧化，性質(zhì)很不穩(wěn)定。且親水性強(qiáng)，難以更好地溶于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)以增強(qiáng)其功效性。如果將ht制備為脂質(zhì)體后，不但能保護(hù)其不受外界環(huán)境因素的影響提高穩(wěn)定性，還能增強(qiáng)其生物利用度(抗癌、抗菌、抗氧化等生物活性)。
國內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道了從油橄欖葉或橄欖果提取分離橄欖苦苷、羥基酪醇、毛蕊花苷和酪醇等多酚類化合物，但目前采用橄欖葉提取油橄欖多酚提取物大多是10～40％橄欖苦苷提取物，羥基酪醇含量小于10％，毛蕊花苷低于5％，限制油橄欖多酚活性的多功能開發(fā)。
三、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決橄欖苦苷、羥基酪醇、毛蕊花苷等高活性多酚穩(wěn)定性與生物活性，本發(fā)明找到一種富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物復(fù)合方法，并且加工成長循環(huán)脂質(zhì)體，因此，本發(fā)明的技術(shù)方案是采用如下步驟來實(shí)現(xiàn)：
第一步：油橄欖多酚提取物制備
取油橄欖葉，加入30～50％乙醇提取，油橄欖葉與30～50％乙醇質(zhì)量體積比(kg∶l)1∶5～20，提取兩次，溫度70～85℃，合并提取液，濾液過陶瓷膜(孔徑50nm)和分子量3000da超濾膜，再用納濾膜濃縮濾液，濾液過納濾膜，橄欖葉與濃縮濾液質(zhì)量體積比(kg∶l)1∶1～3，濃縮液真空干燥，粉碎成粉制成油橄欖多酚提取物，hplc分析，其中橄欖苦苷10～40％，毛蕊花苷3～6％，羥基酪醇2～7％，水溶性為100ml水溶解2～8g；
第二步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物制備
將90％羥基酪醇與10～40％橄欖苦苷提取物及90％毛蕊花苷復(fù)配，按質(zhì)量比例為4～8∶2～5∶1～3，加入3～8倍無水乙醇，60～90℃加熱回流10～30min，樣品充分溶解后過濾，減壓濃縮，制備富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物，其中羥基酪醇為50～70％，橄欖苦苷為10～20％，毛蕊花苷為5～15％；
第三步：薄膜分散-機(jī)械振蕩法制備長循環(huán)油橄欖多酚脂質(zhì)體
以富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物為包封目標(biāo)，設(shè)計(jì)溫度40～70℃、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為1∶1～8∶1，稱卵磷脂與膽固醇質(zhì)量3～10g，表面活性劑吐溫-80體積2～10ml，peg2001～5g，放人圓底燒瓶中，加入適量有機(jī)溶劑，超聲振蕩5～20min，溶解后減壓薄膜蒸發(fā)除去溶劑，再加入1～4mg/ml羥基酪醇(ht)水溶液1～10ml，油橄欖多酚水溶液1～3ml，旋轉(zhuǎn)洗膜水化時(shí)間5～50min，再超聲溶解5～30min可得到脂質(zhì)體。根據(jù)單因素與正交設(shè)計(jì)優(yōu)化，制備均勻的乳白色長循環(huán)脂質(zhì)體，具有穩(wěn)定性、緩釋性、抗氧化性和抑菌性等功能；
第四步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體包封率
取脂質(zhì)體于燒杯中，加入去離子水，脂質(zhì)體與去離子水質(zhì)量體積比濃度為2～15mg/ml，放入透析袋中，在室溫下透析1～15h，hplc分析水溶性中ht濃度(c)和透析濾液中ht濃度(c0)，ht水溶性體積(v)，透析濾液的總體積(v0)，根據(jù)下式計(jì)算富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體包封率為20～80％以上；
第五步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體平均粒度及其分布
將1～10mg/ml脂質(zhì)體放入比色皿中，加入一定量的去離子水，用zetaplus型激光粒度儀在光源波長368nm和散射角90°下室溫測試，制備的脂質(zhì)體的粒徑分布在200～1000nm。
第六步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性
1.物理穩(wěn)定性：取1～8mg/ml脂質(zhì)體懸濁液和相同濃度ht水溶液，分別用4000r/min～10000r/min離心機(jī)離心10～20min，制備的脂質(zhì)體在4000～6000r/min無沉淀和不分層，乳液穩(wěn)定；于4℃～25℃下貯藏0～30d，脂質(zhì)體中羥基酪醇和毛蕊花苷穩(wěn)定，相同條件下比ht水溶液中ht穩(wěn)定性提高20～40％；
2.水解穩(wěn)定性：在薄膜分散-機(jī)械振蕩法制備脂質(zhì)體懸浮液，在ph值為3.0～7.0的檸檬酸緩沖液(0.1～0.5mol/l檸檬酸溶液與0.2～0.5mol/l磷酸氫二鈉溶液)，分別測定各脂質(zhì)體的包封率，結(jié)果是，隨著水化液ph值的升高，包封率增加。
第七步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體的緩釋性
配制ht濃度為1～8mg/ml脂質(zhì)體懸液，移取懸液1～5ml放入透析袋內(nèi)，將其完全浸入含有100ml生理鹽水的燒杯中；將燒杯放入37℃恒溫的水浴鍋內(nèi)，在24h內(nèi)每間隔2h分析透析濾液中ht濃度。與相同濃度ht水溶液作對照，ht水溶液2h內(nèi)釋放了(43.66±1.82)％，脂質(zhì)體釋放了(28.62±1.87)％；24h后，ht溶液和脂質(zhì)體釋放分別為(73.41±1.72)％和(55.72±1.88)％，相同條件下脂質(zhì)體提高30～65％的緩釋性能。
第八步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體的抗氧化性
將脂質(zhì)體懸液和ht水溶液樣品分別配成0.25、0.5、1、1.5、2μg/ml的無水乙醇待測溶液。1ml待測樣品加入40mg/ldpph醇溶液3ml，充分混勻后，室溫下避光反應(yīng)30min，在517nm波長下測定吸光度(ai)。每個(gè)樣品平行3次，取平均值。經(jīng)計(jì)算得知ht脂質(zhì)體的ic50為0.5～2μg/ml，為ht水溶液和脂質(zhì)體對dpph自由基清除效果大體一致。說明利用脂質(zhì)體技術(shù)把ht制備成相應(yīng)脂質(zhì)體后，它對dpph自由基的清除效果并沒有受到影響。
樣品溶液對dpph自由基清除率(η)的計(jì)算公式如下：
式中：
a0——1ml待測樣品與3ml無水乙醇的混合液30min后的吸光值(空白值)；
a1——1ml無水乙醇與3mldpph醇溶液混合反應(yīng)30min后的吸光值(自由基總值)；
ai——1ml待測樣品與3mldpph醇溶液混合反應(yīng)30min后的吸光值。
第九步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體的抑菌性
采用菌體濃度為105cfu/ml的菌懸液配制脂質(zhì)體懸液和ht水溶液樣品濃度濃度依次為1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml的樣品溶液。將上述配好的溶液放置恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，試管中幾乎無渾濁現(xiàn)象對應(yīng)的樣品濃度作為此樣品的mic值。每種樣品做3個(gè)平行測試。在mic測定結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取未見細(xì)菌生長的各管培養(yǎng)液，移取0.1ml涂布于固體培養(yǎng)基上，放置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，24h后觀察結(jié)果，仍無細(xì)菌生長現(xiàn)象對應(yīng)的樣品濃度作為此樣品的mbc值。相對于ht水溶液，脂質(zhì)體的抑菌效果相當(dāng)，且對金黃色葡萄球菌的mic為4～16μg/ml，mbc值為16～64μg/ml。對大腸桿菌的mic為16～64μg/ml，mbc值為32～128μg/ml。
橄欖苦苷、羥基酪醇、毛蕊花苷等多酚類化合物具有較好醇溶性，目前市場生產(chǎn)的橄欖提取物不僅橄欖苦苷、羥基酪醇、毛蕊花苷等多酚類化合物含量低，而且水溶性不好，為了改善橄欖苦苷提取物水溶性，有利于脂質(zhì)體制備與活性，在本發(fā)明中，采用30～50％乙醇提取油橄欖葉，提取兩次，溫度70～85℃，采用陶瓷膜(孔徑50nm)和分子量3000da超濾膜過濾，再用納濾膜濃縮濾液，去掉大分子蛋白、多糖、膠質(zhì)體、單寧等，濃縮物為水溶性小分子橄欖苦苷、羥基酪醇、毛蕊花苷等多酚類化合物，真空干燥，粉破成粉制成油橄欖多酚提取物，水溶性為100ml水溶解1～6g，具有很好的水溶性。
為了達(dá)到油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體的效果，本發(fā)明采用薄膜分散-機(jī)械振蕩法。旋蒸減壓成膜壓力-0.05～-0.1mpa，溫度50～70℃、真空冷凍干燥成膜壓力2～10mpa，溫度-10～-50℃，超聲機(jī)械振蕩功率100～200w，時(shí)間20～40min，高速剪切功率500～1000w，時(shí)間5～10min，采用其中一種或者幾種方法達(dá)到薄膜分散的效果。
為了改善油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，采用磷脂為表面活性乳化劑，優(yōu)選大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂和氫化大豆磷脂中的一種或復(fù)合。為了更好的分散，也添加膽固醇質(zhì)量3～10g，表面活性劑吐溫-80體積2～10ml，peg2001～5g，形成均一穩(wěn)定的乳相。為了油橄欖多酚提取物及乳化助劑充分溶解形成均相，采用無水乙醇、丙酮、異丙酮和氯仿中的一種作為有機(jī)溶劑。
本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)為：
創(chuàng)新性制備富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物，羥基酪醇為50～70％，橄欖苦苷為10～20％，毛蕊花苷為5～15％，活性多酚中羥基酪醇、橄欖苦苷和毛蕊花苷比例合理，水溶性高達(dá)100ml水溶解6g多酚提取物，濃度高，抗氧化活性更高。
2.采用薄膜分散-機(jī)械振蕩法制備了油橄欖多酚提取物脂質(zhì)體，包封率高、粒徑分布均勻、穩(wěn)定性好；
3.制備的富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體具有緩釋性，可減少用藥次數(shù)；
4.制備的富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體具有一定的抗氧化性和抑菌性。
四、附圖說明：
附圖1溫度對富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體包封率的影響；
附圖2卵膽比對富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體包封率的影響；
附圖3吐溫-80體積對富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體包封率的影響；
附圖4ht質(zhì)量對富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體包封率的影響。
五、具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例為本發(fā)明的一些舉例，不應(yīng)被看做是對本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1
油橄欖多酚提取物制備
取1kg油橄欖葉，加入30％乙醇8l提取，溫度85℃，提取時(shí)間2小時(shí)，提取兩次，合并提取液，分別采用陶瓷膜(孔徑50nm)和分子量3000da超濾膜過濾，再用納濾膜濃縮濾液至1.5l，濃縮物真空干燥，粉破成粉制成油橄欖多酚提取物，hplc分析，其中橄欖苦苷36.8％，毛蕊花苷5.6％，羥基酪醇3.4％，水溶性為100ml水溶解5.2g。
實(shí)施例2
富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物制備
將90％羥基酪醇與36.8％橄欖苦苷提取物及90％毛蕊花苷復(fù)配，按質(zhì)量比例為4～8∶2～5∶1～3，優(yōu)選4～5∶2～3∶1～2，加入4倍無水乙醇，60℃加熱回流20min，樣品充分溶解后過濾，減壓濃縮，制備富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物，hplc分析，其中羥基酪醇為56％，橄欖苦苷為18％，毛蕊花苷為7％；
為了達(dá)到油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體的效果，本發(fā)明采用薄膜分散-機(jī)械振蕩法。旋蒸減壓成膜壓力-0.05～-0.1mpa，溫度50～70℃、真空冷凍干燥成膜壓力2～10mpa，溫度-10～-50℃，超聲機(jī)械振蕩功率100～200w，時(shí)間20～40min，高速剪切功率500～1000w，時(shí)間5～10min，采用其中一種或者幾種方法達(dá)到薄膜分散的效果。
為了改善油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，采用磷脂為表面活性乳化劑，優(yōu)選大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂和氫化大豆磷脂中的一種或復(fù)合。為了更好的分散，也添加膽固醇質(zhì)量3～10g，表面活性劑吐溫-80體積2～10ml，peg2001～5g，形成均一穩(wěn)定的乳相。為了油橄欖多酚提取物及乳化助劑充分溶解形成均相，采用無水乙醇、丙酮、異丙酮和氯仿中的一種作為有機(jī)溶劑。
實(shí)施例3
富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體的制備
以富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物為包封目標(biāo)，設(shè)計(jì)溫度40～70℃，優(yōu)選55℃，卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為3∶1稱卵磷脂與膽固醇質(zhì)量4g，表面活性劑吐溫-80體積5ml，peg2003.5g，放入圓底燒瓶中，加入丙酮，超聲振蕩10min，溶解后減壓薄膜蒸發(fā)除去溶劑，旋蒸減壓成膜壓力-0.05～-0.1mpa，溫度50～70℃、真空冷凍干燥成膜壓力2～10mpa，溫度-10～-50℃，超聲機(jī)械振蕩功率100～200w，時(shí)間20～40min，高速剪切功率500～1000w，時(shí)間5～10min。再加入3mg/ml羥基酪醇(ht)水溶液6ml，油橄欖多酚提取物水溶液2ml，旋轉(zhuǎn)洗膜水化時(shí)間15min，再超聲溶解20min可得到脂質(zhì)體。
實(shí)施例4
富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體的包封率
取0.05g脂質(zhì)體于燒杯中，加入10ml去離子水，再放入處理過的透析袋中，在室溫下透析9h后測定其中ht含量，并計(jì)算ht的包封率。脂質(zhì)體包封率的計(jì)算公式：
式中：
c——ht水溶液的濃度，mg/ml；
v——ht水溶液的體積，ml；
c0——透析濾液中ht的濃度，mg/ml；
v0——透析濾液的總體積，ml。
當(dāng)ht水溶液濃度為2mg/ml，ht水溶液體積為2ml，卵膽比為4∶1(卵磷脂80mg，膽固醇20mg，下同)，吐溫-80為6ml，制備溫度為65℃，可得到ht脂質(zhì)體的包封率為37.51％。
實(shí)施例4
富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體的緩釋性
配制ht濃度為1mg/ml脂質(zhì)體懸液，移取懸液2ml放入透析袋內(nèi)，將其完全浸入含有100ml生理鹽水的燒杯中；將燒杯放入37℃恒溫的水浴鍋內(nèi)，在24h內(nèi)每間隔2h分析透析濾液中ht濃度。與相同濃度ht水溶液作對照，ht水溶液2h內(nèi)釋放了(43.66±1.82)％，脂質(zhì)體釋放了(28.62±1.87)％；24h后，ht溶液和脂質(zhì)體釋放分別為(73.41±1.72)％和(55.72±1.88)％，相同條件下脂質(zhì)體提高30～55％的緩釋性能。
實(shí)施例5
富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體的抗氧化性
將脂質(zhì)體懸液和ht水溶液樣品分別配成0.25、0.5、1、1.5、2μg/ml的無水乙醇待測溶液。1ml待測樣品加入40mg/ldpph醇溶液3ml，充分混勻后，室溫下避光反應(yīng)30min，在517nm波長下測定吸光度(ai)。每個(gè)樣品平行3次，取平均值。經(jīng)計(jì)算得知ht脂質(zhì)體的ic50為0.5～2μg/ml，為ht水溶液和脂質(zhì)體對dpph自由基清除效果大體一致。說明利用脂質(zhì)體技術(shù)把ht制備成相應(yīng)脂質(zhì)體后，它對dpph自由基的清除效果并沒有受到影響。
樣品溶液對dpph自由基清除率(η)的計(jì)算公式如下：
式中：
a0——1ml待測樣品與3ml無水乙醇的混合液30min后的吸光值(空白值)；
a1——1ml無水乙醇與3mldpph醇溶液混合反應(yīng)30min后的吸光值(自由基總值)；
ai——1ml待測樣品與3mldpph醇溶液混合反應(yīng)30min后的吸光值。
實(shí)施例6
富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質(zhì)體的抑菌性
采用菌體濃度為105cfu/ml的菌懸液配制ht脂質(zhì)體懸液和ht水溶液樣品濃度濃度依次為1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml的樣品溶液。將上述配好的溶液放置恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，試管中幾乎無渾濁現(xiàn)象對應(yīng)的樣品濃度作為此樣品的mic值。每種樣品做3個(gè)平行測試。在mic測定結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取未見細(xì)菌生長的各管培養(yǎng)液，移取0.1ml涂布于固體培養(yǎng)基上，放置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，24h后觀察結(jié)果，仍無細(xì)菌生長現(xiàn)象對應(yīng)的樣品濃度作為此樣品的mbc值。相對于ht水溶液，脂質(zhì)體的抑菌效果相當(dāng)，且對金黃色葡萄球菌的mic和mbc值分別為8和32μg/ml。對大腸桿菌的mic和mbc值分別為32和64μg/ml。