本發(fā)明涉及納米藥物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種靶向納米藥物載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

納米藥物是一種新型藥物制劑，通過修飾靶向探針和藥物，納米顆粒可以有效改善生物分布，增加細(xì)胞攝取和藥效。通過優(yōu)化了納米顆粒的尺寸和表面特征，可以增加血液循環(huán)壽命。最近，樹枝狀大分子已經(jīng)被用于癌癥的診斷和治療，因?yàn)樗鼈兙哂袃?yōu)異的水溶性，極大的藥物遞送潛力。聚酰胺-胺型(pamam)樹枝狀大分子是一類高度的具有精確結(jié)構(gòu)的支化聚陽離子大分子和低分散性。pamam作為一種優(yōu)良的納米級單分子表面活性劑、具有良好的增溶和穩(wěn)定的作用。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域作為藥物、基因、疫苗的載體，用于藥物緩釋、體外診斷、體外基因轉(zhuǎn)移、基因治療、核磁成像等應(yīng)用。pamam的大小也可以在逐步合成過程中的很好的控制。此外，pamam還通過延長其循環(huán)時(shí)間來改善藥物載體滲透到脈管系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞中。

her2是人類表皮生長因子受體-2，它的過度表達(dá)會過度傳遞信號，刺激癌細(xì)胞增殖。研究表明，her2在20-30％的乳腺癌中過度表達(dá)，her2過表達(dá)的乳腺癌浸潤性強(qiáng)，無病生存期短，預(yù)后差。卵巢癌，胃癌和子宮頸癌等多種腫瘤中都有her2的過度表達(dá)，her2已經(jīng)成為治療癌癥的重要靶標(biāo)。

目前，針對her2胞外區(qū)的抗體藥物研究比較深入，部分藥物已經(jīng)市場化，如赫賽汀和西妥昔單抗等。赫賽汀是一種人源化單克隆抗體，選擇性地作用于her2的胞外部位，1998年被fda批準(zhǔn)上市用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療，治療效果明顯好于現(xiàn)有的抗乳腺癌藥物，現(xiàn)在已成her2陽性乳腺癌患者的首選治療藥物。

然而抗體藥物存在著制備繁瑣、穩(wěn)定性較差、費(fèi)用昂貴、穿透力弱等缺點(diǎn)。因此，為了提高乳腺癌診斷和治療的特異性和準(zhǔn)確性，彌補(bǔ)抗體的缺陷，迫切需要尋求新的藥物載體和試劑，以作為檢測和治療乳腺癌的有效方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題或者至少部分地解決上述問題，本發(fā)明提供了一種靶向納米藥物載體，該載體包括聚酰胺-胺型樹枝狀大分子、聚乙二醇和靶向多肽；聚酰胺-胺型樹枝狀大分子外圍的部分或全部nh2基各自連接一個(gè)聚乙二醇分子，部分聚乙二醇的另一端連接靶向多肽；聚酰胺-胺型樹枝狀大分子外圍的nh2基團(tuán)與聚乙二醇的摩爾比為1:48-1:96；聚酰胺-胺型樹枝狀大分子與靶向多肽的摩爾比為1:5-20；靶向多肽是能夠與表達(dá)或過量表達(dá)her2的癌癥細(xì)胞或癌癥組織靶向結(jié)合的多肽。

在本發(fā)明中，采用上述結(jié)構(gòu)以及特定比例的納米藥物載體可以有效地降低與上述載體的毒性，更好地作為傳遞能治療癌癥藥物如dox的載體，減少對正常細(xì)胞的傷害。另外，本發(fā)明的載體與her2蛋白結(jié)合能力強(qiáng)，能夠有效地通過該蛋白來對腫瘤病人進(jìn)行靶向治療。

在本發(fā)明的實(shí)施方式中，在聚酰胺-胺型樹枝狀大分子外圍的nh2基連接聚乙二醇分子的個(gè)數(shù)由聚酰胺-胺型樹枝狀大分子外圍的nh2基團(tuán)與聚乙二醇的摩爾比值決定，也由聚酰胺-胺型樹枝狀大分子與所述靶向多肽的摩爾比決定，以確保只有部分聚乙二醇的另一端與靶向多肽連接，而非所有的聚乙二醇的另一端均與靶向多肽連接。

在本發(fā)明中，載體是以聚酰胺-胺型樹枝狀大分子為中心，外圍連接有peg，在peg外側(cè)分布有靶向多肽。該靶向多肽有序分散在peg外側(cè)，優(yōu)選地，等間距分散在peg外側(cè)，即聚酰胺-胺型樹枝狀大分子外側(cè)。即在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，靶向多肽呈等間距與部分聚乙二醇的另一端連接，在由聚酰胺-胺型樹枝狀大分子為中心形成的納米球的外側(cè)呈等間距分布。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，peg也呈等間距分散在聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的外圍，其間距比靶向多肽的分散間距小。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，為了增強(qiáng)對her2的特異性，靶向多肽為h6、h10或由其形成的二價(jià)體或多價(jià)體。

其中，h6的多肽序列為：ylffvfer，如seqidno.1所示；

h10的多肽序列為：klrlfwnr，如seqidno.2所示。

靶向多肽可以為h6形成的二價(jià)體或多價(jià)體，也可以為h10f形成的二價(jià)體或多價(jià)體。其中，二價(jià)體或多價(jià)體可以通過連接分子共價(jià)連接形成，或是通過與多聚體混合非共價(jià)連接形成的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選用多聚體，如聚乙二醇或環(huán)糊精。在本發(fā)明中，多價(jià)指二價(jià)以上。

聚酰胺-胺型樹枝狀大分子pamam為一種優(yōu)良的納米級單分子表面活性劑、具有良好的增溶和穩(wěn)定作用。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，為了得到適用于上述特定多肽且對正常細(xì)胞傷害最低的載體，聚酰胺-胺型樹枝狀大分子pamam為第3-6代聚酰胺-胺型樹枝狀大分子，優(yōu)選為第4代聚酰胺-胺型樹枝狀大分子，即g4pamam樹枝狀大分子。

在本發(fā)明的實(shí)施方式中，本發(fā)明的靶向納米藥物載體可以制為納米顆粒，也可稱為納米球。當(dāng)使用本發(fā)明的載體與藥結(jié)合時(shí)，可稱為載有藥物的納米球。

在本發(fā)明的實(shí)施方式中，聚乙二醇peg的分子量可以根據(jù)需要來選擇，可以選用分子量為1000或是2000的聚乙二醇。同時(shí)，為了得到本發(fā)明的載體結(jié)構(gòu)，可以使用雙功能的聚乙二醇與pamam樹枝狀大分子反應(yīng)以及靶向多肽反應(yīng)，其中，雙功能中一活化劑可以為如nhs類的物質(zhì)，另一活化劑可以為如mal類的物質(zhì)。

也可以先使聚乙二醇的一側(cè)先被nhs活化，并與pamam反應(yīng)得到pamam-peg，再使用如mal類的物質(zhì)使pamam-peg中peg另一側(cè)活化，使其順利與靶向多肽反應(yīng)。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，雙功能聚乙二醇指聚乙二醇分子的兩端均被nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)功能化。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，為了減少載體的毒性，聚酰胺-胺型樹枝狀大分子表面的nh2基團(tuán)與聚乙二醇的摩爾比為1:48-1:96，優(yōu)選為1:50-1:80，進(jìn)一步優(yōu)選為1:60。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，為了減少載體的毒性，聚酰胺-胺型樹枝狀大分子與所述靶向多肽的摩爾比為1:10-20，優(yōu)選為1:6-10，進(jìn)一步優(yōu)選為1:7.5。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，聚乙二醇的另一端與靶向多肽為化學(xué)鍵連接，優(yōu)選為碳氮鍵連接，即可以表示為：

其中，pamam為本發(fā)明的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子，n指peg中-ch-ch-o-單元的個(gè)數(shù)，該解釋也適用下述反應(yīng)歷程中結(jié)構(gòu)式。當(dāng)靶向多肽為h6時(shí)，得到的靶向納米載體可以簡寫為pamam-peg-h6。

在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可以使用本領(lǐng)域中常用的方法來制備上述靶向納米藥物載體，為了使合成更加方便，本發(fā)明還提供了上述多肽靶向納米藥物載體的制備方法，該制備方法的反應(yīng)歷程為：

其中，nh2-peptide為本發(fā)明的靶向多肽，聚酰胺-胺型樹枝狀大分子pamam與靶向多肽的摩爾比為1:10-20，優(yōu)選為1:6-10，進(jìn)一步優(yōu)選為1:7.5。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該制備方法包括以下步驟：

1)合成pamam-peg；

2)使用馬來酰亞胺(mal)活化pamam-peg，即并與靶向多肽按配比室溫反應(yīng)，即得pamam-peg-肽。

其中，為了簡化工藝，步驟1)具體為：

在meoh和dmso的混合溶劑中，pamam與nhs活化的peg按配比在室溫下反應(yīng)，純化，即得上述pamam-peg。

混合溶劑中，meoh和dmso的體積比優(yōu)選為1:1。

在pamam-peg的制備中，在混合溶劑中，pamam樹枝狀聚合物表面的nh2基團(tuán)與nhs活化的peg按配比在室溫下連續(xù)攪拌反應(yīng)10-15分鐘，優(yōu)選15分鐘，用sephadexg-50柱純化反應(yīng)混合物以除去未反應(yīng)的peg。

在步驟2)中，先用馬來酰亞胺mal活化步驟1)中得到的pamam-peg，并與靶向多肽按配比在室溫下連續(xù)攪拌下進(jìn)一步反應(yīng)20-30小時(shí)，優(yōu)選24-30小時(shí)，然后將反應(yīng)后的混合物透析并凍干，即可得到pamam-peg-靶向多肽樹枝狀聚合物，通常為白色固體。

即在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，可以使用下述方法來制備得到pamam-peg-靶向多肽樹枝狀聚合物，該載體與藥物結(jié)合時(shí)靶向性能最佳。

制備方法如下：

1)在混合溶劑中，pamam樹枝狀聚合物表面的nh2基團(tuán)與nhs活化的peg按配比在室溫下連續(xù)攪拌反應(yīng)10-15分鐘，純化，即得pamam-peg；

2)先用馬來酰亞胺mal活化步驟1)中得到的pamam-peg，并與靶向多肽如h6或h10按配比在室溫下連續(xù)攪拌下進(jìn)一步反應(yīng)24-30小時(shí)，然后將反應(yīng)后的混合物透析并凍干，即可得到pamam-peg-靶向多肽樹枝狀聚合物，通常為白色固體。

在本發(fā)明的實(shí)施方式中，也可以先將peg的一端先用nhs活化，另一端與mal活化，得到nhs-peg-mal，再與pamam樹枝狀聚合物反應(yīng)得到pamam-peg-mal，將pamam-peg-mal與靶向多肽如h6或h10按配比反應(yīng)，得到pamam-peg-靶向多肽。

在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可以使用發(fā)散方法通過重復(fù)邁克爾反應(yīng)加入氨基與丙烯酸甲酯合成，通過透析后核磁氫譜(¹h-nmr)進(jìn)行不同代數(shù)的pamam樹枝狀大分子的結(jié)構(gòu)鑒定。

本發(fā)明還提供了上述靶向納米藥物載體以及上述制備方法在制備治療癌癥藥物或腫瘤放射靶向標(biāo)記物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，癌癥為her2蛋白過表達(dá)的癌癥，進(jìn)一步優(yōu)選為乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、膀胱癌或子宮頸癌中的任意一種。

在本發(fā)明中，冶療癌癥藥物可以被制為能殺傷癌細(xì)胞的化學(xué)藥物、生物藥物、納米藥物、放射性藥物、光熱治療或光動力治療藥物或包裹這些藥物中的任意一種。也可以被制為烷化劑、抗代謝藥物、抗腫瘤天然藥物、抗腫瘤抗生素、激素或金屬絡(luò)合物中的任意一種。

在上述應(yīng)用中，上述藥物中還可以包括多種能殺傷癌細(xì)胞的制劑和/或顯像制劑。

在上述應(yīng)用中，可以將得到的靶向納米藥物載體包載藥物，如dox等。

本發(fā)明的靶向納米藥物載體具有靶向her2蛋白的作用，可以作為靶頭增加藥物載體如納米材料、脂質(zhì)體等在her2陽性細(xì)胞中的含量，再添加藥學(xué)上可接受的輔料或佐劑制成新型的更有效的靶向抗癌藥物。且本發(fā)明的靶向納米藥物載體可以采用化學(xué)合成的方法制備得到，純度高，分子量小，特異性強(qiáng)，無免疫原性，安全可靠。該發(fā)明的載體對腫瘤標(biāo)志物her2蛋白的靶向作用明顯，選擇性強(qiáng)，同時(shí)具有高的藥物包載效率，而且?guī)缀鯖]有毒性，極大的提高了藥物載體的安全性，為乳腺癌和其他her2陽性腫瘤的診斷和治療提供了新的選擇與思路。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中靶向納米藥物載體的tem和dls圖；

圖2為使用本發(fā)明實(shí)施例1的載體包載化療藥物dox(即pamam-peg-peph6-dox)的反應(yīng)流程圖；

圖3為使用本發(fā)明實(shí)施例中pamam-peg-peph6-dox的藥物體外釋放圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中pamam-peg-peph6-dox對her2蛋白的體外等離子共振成像親和力圖；

圖5a為本發(fā)明實(shí)施例pamam-peg-peph6-dox、游離dox、pamam-peg-peph6在不同濃度的正常細(xì)胞中的細(xì)胞毒性圖；

圖5b為本發(fā)明實(shí)施例pamam-peg-peph6-dox、游離dox、pamam-peg-peph6在不同濃度的her2陽性的腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)手段。若未特別指明，實(shí)施例中所用的試劑為市售。

實(shí)施例1

靶向納米藥物載體pamam-peg-h6肽的制備

(1)第四代聚酰胺-胺型(g4pamam)樹枝狀大分子使用發(fā)散方法通過重復(fù)邁克爾反應(yīng)加入氨基與丙烯酸甲酯合成，其次通過透析(mwco3500)后1h-nmr光譜法進(jìn)行了pamamg4的結(jié)構(gòu)鑒定。

(2)在meoh和dmso(1:1)的溶劑混合物中，pamam樹枝狀聚合物的外圍nh2基團(tuán)與nhs活化的peg以1:64的摩爾比室溫反應(yīng)15分鐘合成pamam-peg。用sephadexg-50柱純化以除去未反應(yīng)的peg。

(3)為了合成目標(biāo)pamam-peg-h6肽，通過馬來酰亞胺(mal)活化pamam-peg，并與肽h6以1:16的摩爾比在室溫下連續(xù)攪拌下進(jìn)一步反應(yīng)30小時(shí)，將反應(yīng)混合物透析并凍干，得到pamam-peg-h6樹枝狀聚合物，為白色固體。

圖1中進(jìn)行tem和dls測量其尺寸和形態(tài)，修飾聚乙二醇和多肽后平均大小從約4nm增加到7nm，pamam，并且ζ電位測量顯示帶正電(3.60mv)，納米載體的正電荷與帶負(fù)電荷的腫瘤細(xì)胞膜的進(jìn)行有效的靜電相互作用增加攝取。

實(shí)施例2

在本實(shí)施例中，具體包括以下步驟：

(1)使用實(shí)施例1中的靶向納米藥物載體包載化療藥物dox，線路圖見圖2所示。使用光譜法測定載量納米載體包載化療藥物dox的含量。結(jié)果顯示，每個(gè)納米載體可能潛在的平均包封14歌dox分子。

(2)來自pamam-peg-h6/dox的體外dox釋放研究

在酸性條件下，使用透析法進(jìn)行。將在中性ph條件.10mg載有dox的納米球分別重懸于2mlph7.4和ph5.5pbs緩沖液中，然后加入透析液中袋(mwco3500)。透析袋懸掛在含有200毫升的pbs緩沖液中，37℃攪拌均勻。在不同時(shí)間段取樣，并通過熒光分光光度法測定。圖3結(jié)果顯示在酸性條件下，納米載體上包載的dox釋放速率明顯比ph7.4更快，ph值可能是由于帶正電的dox分子在pamam樹支在酸性環(huán)境中，通過質(zhì)子化排斥加速dox從疏水樹枝狀大分子的釋放提高藥效。

實(shí)施例3

在本實(shí)施例中，具體包括以下步驟：

將1mg/ml的pamam-peg-h6顆粒修飾到芯片上，在4℃濕潤條件下孵育過夜，然后用10×pbs清洗10min，再用1×pbs清洗10min，最后用去離子水清洗2次，每次10min，浸入含5％牛奶的1×pbs中，4℃條件下孵育過夜，然后用10×pbs清洗10min，1×pbs清洗10min，最后用去離子水清洗2次，每次10min，用氮?dú)獯蹈桑b芯片上機(jī)(plexeraht表面等離子共振成像系統(tǒng))。

流動相依次通過1×pbs、2×pbs、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml的人her2純化蛋白，記錄分析spri信號。

由圖4可以看出，pamam-peg-h6的spri信號隨著人her2蛋白濃度的增加逐漸增強(qiáng)，親和解離常數(shù)kd達(dá)到了7.48×10-¹⁰摩爾/升，說明本發(fā)明的靶向載體對her2是有強(qiáng)結(jié)合的，可以作為靶向her2腫瘤的藥物載體用于相關(guān)的研究應(yīng)用。

實(shí)施例4

在本實(shí)施例中，評價(jià)藥物載體的體外抗腫瘤效果，具體方法如下：

(1)分別將skbr-3和293t細(xì)胞種分別傳到96孔板中培養(yǎng)，每個(gè)孔5000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜；

(2)當(dāng)細(xì)胞融貼壁后，分別加入含0.01、0.1、0.5、1、10和100mm的dox,pamam–peg–h6和pamam–peg–h6/dox37℃孵育48h；

(3)吸掉藥物溶液，加入0.5mg/ml的mtt溶液37℃度孵育4個(gè)小時(shí)；

(4)吸掉液體，加入200μl二甲基亞砜(dmso)，經(jīng)過10分鐘震蕩混勻后，使用酶標(biāo)儀測定570nm處的光密度od570值，并分析數(shù)據(jù)。

如圖5a所示，在正常細(xì)胞中，與游離dox(freedox)相比，pamam-peg-h6幾乎沒有細(xì)胞毒性，進(jìn)而說明其作為載體的安全性。圖5b中，pamam–peg–h6/dox對her2陽性的腫瘤細(xì)胞的毒性比游離dox表現(xiàn)出更高的細(xì)胞毒性，說明是由于h6靶向作用導(dǎo)致更高效的細(xì)胞毒作用。

本發(fā)明的靶向納米藥物載體是一種對her2蛋白高靈敏度高特異性結(jié)合的載體，與能殺傷癌細(xì)胞的制劑相綴合或混合，用于多種腫瘤的靶向治療。

最后，本發(fā)明的方法僅為較佳的實(shí)施方案，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>國家納米科學(xué)中心

<120>一種靶向納米藥物載體及其制備方法和應(yīng)用

<130>khp171111887.5

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