本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及鞭毛蛋白衍生多肽治療和/或抑制哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)例如睪丸損傷疾病的新用途。

背景技術(shù)：

電離輻射可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生直接和間接的影響。作為細(xì)胞增殖分化極度活躍的器官，睪丸對(duì)電離輻射高度敏感。研究表明，電離輻射干擾生精細(xì)胞的代謝，增殖和分化，最終導(dǎo)致精子發(fā)育異常，精子數(shù)減少，活躍度降低以及不孕不育等性功能障礙。0.3gy的γ射線就可以使小鼠出現(xiàn)明顯的精原細(xì)胞減少。成年男性單次照射0.15gy會(huì)導(dǎo)致少精癥，0.35～0.50gy會(huì)造成可逆性無(wú)精癥，精液質(zhì)量在受照后5個(gè)月左右達(dá)到最低，并且需要1年以上才能恢復(fù)。但是即使恢復(fù)的生殖細(xì)胞也很可能伴有遺傳損傷，且具有遺傳性。當(dāng)照射劑量大于2.0gy時(shí)，可能會(huì)引起永久性的不孕。

目前隨著癌癥患者的年輕化，以及腫瘤治療學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的年輕患者，甚至兒童腫瘤患者，要求保護(hù)和保留生育功能的訴求越來(lái)越迫切。因?yàn)槟[瘤的侵襲的和放化療所帶來(lái)的損傷，約2/3男性兒童癌癥幸存者仍面臨著生殖功能障礙和不孕不育的困擾。超過(guò)35％的癌癥患者和超過(guò)50％的睪丸癌治療后少精癥(精子濃度少于2000萬(wàn)/毫升)，多達(dá)10％的男性患有無(wú)精癥。腫瘤分泌的激素和細(xì)胞因子，熱療，放射線甚至內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂帶來(lái)的生殖細(xì)胞缺陷，dna修復(fù)障礙等都可能會(huì)導(dǎo)致不孕不育。睪丸癌，直腸癌和淋巴瘤的放射治療和化療會(huì)破壞睪丸間質(zhì)細(xì)胞而降低睪酮水平，導(dǎo)致性腺功能減退，破壞性欲和性功能。對(duì)于成年男性癌癥患者，精子凍存是保存生殖能力最有效的方法。但對(duì)于青春期前的兒童腫瘤患者，只能通過(guò)體內(nèi)保護(hù)生殖細(xì)胞來(lái)保存生育能力。因此尋找一種可以用作放射治療的生殖保護(hù)劑顯得十分重要。

近來(lái)，cblb502作為一種新型的tlr5激動(dòng)劑，成為研究的熱點(diǎn)。不僅表現(xiàn)出極好的抗輻射損傷，抗凋亡的效果，還具有潛在的抗感染和抑腫瘤效應(yīng)。cblb502是一種改構(gòu)的細(xì)菌鞭毛蛋白，僅保留了沙門氏菌鞭毛蛋白的n端和c端結(jié)構(gòu)，同樣可以結(jié)合并激活tlr5，且其免疫原性僅有為鞭毛蛋白的1/50。

體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，cblb502對(duì)致死輻射劑量照射下恒河猴和小鼠具有顯著的促存活效應(yīng)，能有效預(yù)防致死劑量γ射線引起的急性放射病，減輕輻射所致的小鼠的造血系統(tǒng)，腸道上皮的損傷，促進(jìn)小鼠的造血恢復(fù)。機(jī)制研究表明，cblb502依賴以tlr5與myd88分子的結(jié)合，激活下游的nf-κb信號(hào)通路。具體機(jī)包括：上調(diào)凋亡抑制因子(inhibitorofapoptosisproteins，iaps)，b淋巴細(xì)胞瘤-2基因(b-celllymphoma-2，bcl-2)，抑制細(xì)胞凋亡；誘導(dǎo)小腸固有層超氧化物歧化酶2(sod2)的表達(dá)，清除輻射引起的氧自由基；誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子如粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)、白細(xì)胞介素6(il-6)和腫瘤壞死因子(tnfα)的表達(dá)，緩解輻射引起的白細(xì)胞和血小板的減少。研究表明cblb502保護(hù)小鼠免受由局部輻射引起的皮炎和口腔粘膜炎，放射性肺炎和肺纖維化。cblb502能快速激活肝臟組織中nf-κb、stat3等抗凋亡信號(hào)通路，拯救致死劑量下fas介導(dǎo)的肝毒性小鼠。

在小鼠腫瘤放射治療模型中，cblb502保護(hù)正常組織細(xì)胞，沒(méi)有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的輻射耐受性和輻射致癌風(fēng)險(xiǎn)。在黑色素瘤，結(jié)腸癌，乳腺癌，肺癌，前列腺癌等多種裸鼠成瘤癌癥模型中，鞭毛蛋白能明顯促進(jìn)腫瘤組織的壞死，抑制腫瘤生長(zhǎng)增殖。鞭毛蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)主要通過(guò)tlr5介導(dǎo)的信號(hào)通路，一方面與調(diào)節(jié)炎性因子和免疫相關(guān)，另一方面與直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。cblb502能夠誘導(dǎo)nk細(xì)胞，cd8+細(xì)胞和穿孔素(perforing)依耐性的抗腫瘤免疫反應(yīng)，而不需要腫瘤細(xì)胞表達(dá)tlr5。

因此，cblb502是目前輻射防護(hù)效果很好的藥物，該藥在保護(hù)正常組織免于輻射損傷的同時(shí)并未減弱腫瘤組織對(duì)輻射的敏感性，且對(duì)多種實(shí)體腫瘤有抑制作用。然而，目前cblb502對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的輻射損傷保護(hù)的研究還未有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供鞭毛蛋白衍生多肽在制備治療和/或抑制哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)損傷疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述生殖系統(tǒng)為睪丸；

所述鞭毛蛋白衍生多肽包括、但不限于cblb502，還包括氨基酸序列與cblb502相似度不低于90％，具有類似活性的鞭毛蛋白衍生多肽。優(yōu)選地，所述鞭毛蛋白衍生多肽為cblb502。

進(jìn)一步地，所述睪丸損傷疾病為放療和/或化療所產(chǎn)生的睪丸損傷疾病或癥狀；

優(yōu)選地，所述放療為電離輻射，所述化療為抗腫瘤藥物；具體地，本發(fā)明選用的化療藥物為白消安。

進(jìn)一步地，所述抑制睪丸損傷疾病或癥狀通過(guò)以下1)-6)中至少一種體現(xiàn)：

1)提高睪丸損傷動(dòng)物的精子數(shù)量和活動(dòng)度；

2)降低睪丸損傷動(dòng)物的精子畸形率；

3)減輕睪丸損傷動(dòng)物的睪丸萎縮；

4)提高睪丸損傷動(dòng)物的受孕率和/或生育率；

5)減輕睪丸細(xì)胞的dna損傷；

6)降低睪丸損傷動(dòng)物的染色體畸形。

本發(fā)明提供的鞭毛蛋白衍生多肽cblb502在制備具有如下1)-5)中至少一種哺乳動(dòng)物功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用：

1)提高睪丸損傷動(dòng)物的精子數(shù)量和活動(dòng)度；

2)降低睪丸損傷動(dòng)物的精子畸形率；

3)減輕睪丸損傷動(dòng)物的睪丸萎縮；

4)提高睪丸損傷動(dòng)物的受孕率和/或生育率；

5)減輕睪丸細(xì)胞的dna損傷；

6)降低睪丸損傷動(dòng)物的染色體畸形。

上述應(yīng)用中，所述哺乳動(dòng)物為人或鼠。

上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為藥物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有如下1)-7)中至少一種哺乳動(dòng)物功能的產(chǎn)品，其包括活性成分鞭毛蛋白衍生多肽例如cblb502；優(yōu)選地，所述鞭毛蛋白衍生多肽為cblb502。

1)提高睪丸損傷動(dòng)物的精子數(shù)量和活動(dòng)度；

2)降低睪丸損傷動(dòng)物的精子畸形率；

3)減輕睪丸損傷動(dòng)物的睪丸萎縮；

4)提高睪丸損傷動(dòng)物的受孕率和/或生育率；

5)減輕睪丸細(xì)胞的dna損傷；

6)降低睪丸損傷動(dòng)物的染色體畸形；

7)治療和/或抑制睪丸損傷疾病或癥狀。

上述產(chǎn)品中，所述哺乳動(dòng)物為人或鼠。

上述產(chǎn)品為藥物。

鞭毛蛋白衍生多肽cblb502可以在市場(chǎng)上商購(gòu)或按照現(xiàn)有技術(shù)已知的方法制備。

本發(fā)明利用雄性小鼠在亞致死劑量5.0gyγ射線全身照射下或施加化療藥物白消安下，探索了cblb502對(duì)其生殖系統(tǒng)的損傷保護(hù)作用，對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了研究。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下特點(diǎn)：

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的鞭毛蛋白衍生多肽cblb502可以明顯提高睪丸損傷動(dòng)物的精子數(shù)量和活動(dòng)度，降低精子畸形率，減輕睪丸損傷動(dòng)物的睪丸萎縮，提高睪丸損傷動(dòng)物的受孕率和/或生育率，減輕睪丸細(xì)胞的dna損傷，降低睪丸損傷動(dòng)物的染色體畸形。

附圖說(shuō)明

圖1為小鼠精子活動(dòng)度和精子總數(shù)示圖；其中a為小鼠精子運(yùn)動(dòng)活力示圖，b為小鼠附睪精子總數(shù)變化示圖；

圖2為小鼠精子畸形率示圖；其中a為小鼠精子畸形分類，b為5gy輻照后1-120天小鼠畸形率變化圖；

圖3示出5gy照射后小鼠的外觀和睪丸臟器指數(shù)；其中，a為5gy輻照后60天小鼠的外觀，b為輻照后30天小鼠睪丸的外觀，c為輻照后30天小鼠睪丸臟器指數(shù)；

圖4為小鼠睪丸病理結(jié)果和生精小管內(nèi)各細(xì)胞數(shù)量；其中，a為輻照后第1天、3天、7天、15天、30天、60天及120天小鼠睪丸組織的h&e病理，b為生精小管內(nèi)精原細(xì)胞數(shù)量，c為生精小管內(nèi)精母細(xì)胞數(shù)量，d為生精小管內(nèi)精子細(xì)胞數(shù)量，e為生精小管內(nèi)支持細(xì)胞的數(shù)量；

圖5為小鼠睪丸細(xì)胞的dna含量；其中，a為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)睪丸細(xì)胞dna含量，b為單倍體細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和四倍體細(xì)胞在睪丸細(xì)胞中的比例；

圖6為小鼠睪丸細(xì)胞dna損傷；其中，a為小鼠睪丸細(xì)胞彗星凝膠電泳，b為彗尾dna的含量％，c為olive彗尾位移(olivemoment)；

圖7為小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸形示意圖；其中，a為小鼠骨髓細(xì)胞染色體吉姆薩染色：依次為正常染色體、環(huán)狀(ring)、斷裂(broken)和棒狀(rodlike)，b為輻照后60天小鼠和輻照小鼠后代的染色體畸形百分比；

圖8為施用化療藥物白消安后90天小鼠的精子數(shù)和運(yùn)動(dòng)能力示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

本發(fā)明所使用的放射源為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所⁶⁰coγ射線源，劑量率92.34～103.43cgy/min；對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的照射方法為將小鼠放在塑料盒中，使其接受一次性全身照射5gy⁶⁰coγ照射。

實(shí)施例1小鼠精子數(shù)量和運(yùn)動(dòng)能力分析

本發(fā)明所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為spf級(jí)c57bl/6j小鼠，動(dòng)物許可證號(hào)：scxx(京)2012-0001，體質(zhì)量18～22g，6～8周齡，購(gòu)于北京維通利華有限公司。小鼠飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，每籠5只，無(wú)特殊病原體(spf)級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物處于同一飼養(yǎng)環(huán)境，室溫21-25℃，濕度：50％～60％，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由攝取食物和水源，晝夜更替節(jié)律，各12小時(shí)。

良好的精子活動(dòng)力是受精的基礎(chǔ)，也是衡量雄性生育力的重要指標(biāo)之一。精子活動(dòng)率根據(jù)世界衛(wèi)生組織who標(biāo)準(zhǔn)分成4級(jí)；快速前向運(yùn)動(dòng)(a級(jí))，慢速前向運(yùn)動(dòng)(b級(jí))，非前向運(yùn)動(dòng)(c級(jí))和極慢或不動(dòng)(d級(jí))。具體的實(shí)驗(yàn)方法如下：

將c57小鼠隨機(jī)分成以下四組：正常對(duì)照(假手術(shù)，sham)：小鼠不做任何處理；cblb502組(cblb502)：小鼠腹腔注射0.2mg/kgcblb502；5gy⁶⁰coγ照射組(5gy)：小鼠接受一次性全身照射5gy⁶⁰coγ射線照射；cblb502預(yù)處理組(5gy+cblb502)：小鼠5gy⁶⁰coγ照射前30min腹腔注射0.2mg/kgcblb502；

頸部脫臼法處死小鼠，分離出兩側(cè)小鼠睪丸、附睪，除去睪丸、附睪周圍系膜及脂肪。將附睪頭剪成幾段，于37℃水浴鍋中孵育10min，使精子自行散開(kāi)。移液槍吸取10μl液體，滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，在sca精子動(dòng)態(tài)分析精子活動(dòng)參數(shù)，隨機(jī)選取8～10個(gè)視野，約2000個(gè)精子數(shù)，拍照觀察。

在輻照后第1天，15天，30天，60天，120天連續(xù)觀測(cè)小鼠的精子數(shù)量和活動(dòng)度。圖1-1b結(jié)果顯示5gy輻照后第1天，小鼠精子活動(dòng)度(a+b級(jí)精子比例)由正常對(duì)照組小鼠的79.21±2.46％下降為51.74±2.47％。隨著時(shí)間的推移，5gy輻照組精子的活動(dòng)度持續(xù)下降。輻照后第60天，活動(dòng)度降為20.20±3.75％，到第120天活動(dòng)度恢復(fù)到40.82±23.15％。而cblb502預(yù)處理組的精子活動(dòng)度明顯高于輻照組(p<0.05)；且精子活動(dòng)度從輻照后第30天即開(kāi)始恢復(fù)，到第120天，活動(dòng)度為69.35±5.34％，顯著高于輻照組(p<0.05)，接近正常組小鼠。cblb502單獨(dú)給藥組精子與正常對(duì)照組沒(méi)有明顯差別。

輻照后小鼠精子總數(shù)明顯下降，第15天到60天，精子總數(shù)僅有正常小鼠的1/4。而cblb502預(yù)處理組精子數(shù)在第15天至120天，明顯高于輻照組(p<0.01)。

以上結(jié)果表明，cblb502預(yù)防給藥顯著減輕輻照所致的精子活動(dòng)度和數(shù)量的下降。

實(shí)施例2小鼠精子畸形率檢測(cè)

精子的畸形率是評(píng)價(jià)精子質(zhì)量最直接的指標(biāo)。如圖2所示精子畸形類型有少鉤(hookless)，折疊(folded)，不定形(amorphous)，短尾(shorttail)和香蕉形(bananalike)。具體檢測(cè)方法如下：

取實(shí)施例1中5gy輻照后的小鼠精液涂片，用80％酒精固定幾秒鐘，風(fēng)干，用1％的伊紅染液染色30min；固定后，用純水洗幾秒后，風(fēng)干。顯微鏡觀察，每只老鼠至少觀察200個(gè)精子。先用低倍鏡找到背景清晰、精子重疊較少的部位，用高倍鏡檢查精子形態(tài)。識(shí)別的畸形類型分為無(wú)鉤、香蕉形、折疊、無(wú)定形、短尾等。

5gy輻照后，精子畸形率顯著升高，從第1天到第30天逐遞升高(圖2b)。而cblb502預(yù)處理組的畸形率顯著低于輻照組，到第120天接近正常組水平。cblb502單獨(dú)給藥組與正常對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差別。

實(shí)施例3小鼠睪丸的組織學(xué)觀察

小鼠經(jīng)5gy⁶⁰coγ射線后第1天、3天、7天、15天、30天、60天和120天后，處死小鼠。取小鼠睪丸，分析臟器指數(shù)，并進(jìn)行組織切片分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，發(fā)現(xiàn)輻照后第60天，小鼠背部和頭部脫毛嚴(yán)重，皮膚潰爛；而cblb502預(yù)處理組小鼠僅少量脫毛(圖3a)；輻照后第30天，輻照小鼠的睪丸體積變小萎縮，而cblb502預(yù)處理組萎縮程度明顯減輕(圖3b)。睪丸臟器指數(shù)為0.18％，小于正常組小鼠0.49％(圖3c)；而cblb502預(yù)處理組小鼠睪丸指數(shù)為0.25％，高于輻照組(p<0.05)。因此，cblb502能夠減輕小鼠睪丸萎縮。

實(shí)施例4cblb502減輕小鼠睪丸病理改變

正常對(duì)照組小鼠睪丸生精小管界膜完整，生精小管內(nèi)支持細(xì)胞和生精細(xì)胞排列有序，各級(jí)生精細(xì)胞和精子由基底室向近腔室依次排列，層次清晰。生精小管內(nèi)部充滿了精子細(xì)胞和精子。

輻照后第1天睪丸生精小管腔內(nèi)精子細(xì)胞數(shù)減少；第7天，生精上皮疏松，大量生精細(xì)胞壞死脫落，間質(zhì)細(xì)胞減少；第30天，生精小管結(jié)構(gòu)紊亂，僅殘留精原細(xì)胞，腔內(nèi)可見(jiàn)空泡化改變，基本無(wú)精子，少量間質(zhì)細(xì)胞游離在生精小管之間；第60天，睪丸組織損傷最為嚴(yán)重，生精小管完全紊亂，結(jié)構(gòu)變細(xì)長(zhǎng)，體積減小，腔內(nèi)空泡化嚴(yán)重；第120天，睪丸損傷顯見(jiàn)恢復(fù)，生精小管排列恢復(fù)層次，連接緊密，但腔內(nèi)仍出現(xiàn)空泡化，少有精母細(xì)胞和精子細(xì)胞(圖4a-5gy)。

cblb502預(yù)處理組小鼠，第1-3天與正常對(duì)照組睪丸病理無(wú)異；第7天起才出現(xiàn)可見(jiàn)的睪丸損傷，生精小管內(nèi)部分生精細(xì)胞壞死脫落；第30天部分生精小管出現(xiàn)空泡化，生精上皮厚薄不均，排列疏松，但損傷程度明顯小于輻照組；第60天，小鼠睪丸生精小管明顯恢復(fù)，管腔內(nèi)細(xì)胞數(shù)增多，部分生精小管內(nèi)充滿精子；第120天，生精小管外形規(guī)則，排列較緊密，間質(zhì)細(xì)胞增多(圖4a-5gy+502)。

根據(jù)睪丸病理結(jié)果，進(jìn)行了生精小管內(nèi)多種細(xì)胞類型的數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，輻照后精原細(xì)胞每生精小管平均數(shù)從照后第1天到第60天逐漸減少(圖4b)，從60天到120天逐漸增加，第60天每個(gè)生精小管平均僅有16.00±2.41個(gè)細(xì)胞數(shù),低于正常組58.20±3.97個(gè)(p<0.001)，而cblb502預(yù)處理組為41.40±1.96個(gè)，顯著高于輻照組(p<0.001)；類似的，輻照組精母細(xì)胞，精子以及支持細(xì)胞均明顯減少，而cblb502預(yù)處理組均高于輻照組。

實(shí)施例5cblb502提高單倍細(xì)胞比例

小鼠輻射后第60天，頸椎脫頸法處死小鼠，小鼠右側(cè)睪丸組織，收集單細(xì)胞懸液獲取及并急性流式細(xì)胞術(shù)分析。

睪丸細(xì)胞內(nèi)單倍體細(xì)胞(1c)是精子細(xì)胞和精子；二倍體細(xì)胞(2c)是g1期精原細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞及其它非生精細(xì)胞等；四倍體細(xì)胞(4c)是g2期精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞(圖5a)。

輻照后小鼠的睪丸內(nèi)單倍體細(xì)胞比例由正常小鼠的73.69±1.58％，降低為34.99±2.23％(p<0.001)，相應(yīng)的二倍體細(xì)胞和四倍體細(xì)胞比例增加；而cblb502預(yù)處理的小鼠，單細(xì)胞比例(53.49±2.46％)明顯高于輻照對(duì)照組(p<0.001)；二倍體和四倍體細(xì)胞比例減少(圖5b)。

實(shí)施例6提高小鼠受孕率或生育率

輻照后第70天，將雄鼠與正常雌鼠按照1:2比例合籠配對(duì)。每天早晨檢查雌鼠陰道栓，一旦確定雌鼠懷孕，隔離飼養(yǎng)。合籠2周后，統(tǒng)計(jì)分離出來(lái)雌鼠的受孕率，窩仔數(shù)。沒(méi)有受孕的雌鼠繼續(xù)與雄鼠合籠，第6周時(shí)取出雄鼠(此時(shí)cblb502與處理組合籠雌鼠均已受孕)，繼續(xù)觀察雌鼠，并記錄小鼠出生日期。小鼠后代持續(xù)飼養(yǎng)8周，觀察小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育狀況。

具體結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果表明，合籠2周后，受孕雌鼠隔離飼養(yǎng)，輻射對(duì)照組雌鼠受孕率和窩仔數(shù)明顯低于正常對(duì)照組(p<0.05)，而cblb502預(yù)處理組小鼠的的受孕率和窩仔數(shù)均有提高(p<0.05)。合籠后6周，cblb502預(yù)處理組雌鼠全部受孕，后代的平均出生日期為照射后97.6±4.6天，而輻射照射組后代的平均出生日期大于123.5±7.5天(有雌鼠未產(chǎn)生后代)。

表1小鼠的生育能力

*與正常對(duì)照組(sham)比較，p<0.05；#與5gy組比較，p<0.05。

實(shí)施例7cblb502減輕小鼠睪丸細(xì)胞dna損傷

取各組小鼠的睪丸細(xì)胞進(jìn)行彗星單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)，是檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)dna損傷的技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)使用cellbiolab公司的oxiselecttmcometassay試劑盒。每個(gè)樣本拍照10-20個(gè)視野，用軟件casplab(casp1.2.3,krzystof,konca)分析結(jié)果：計(jì)算公式如下：

彗尾dna的含量％＝彗尾dna的光密度/細(xì)胞dna的光密度×100％

olive彗尾位移＝彗尾的dna％×彗尾的位移長(zhǎng)度

生殖細(xì)胞dna結(jié)構(gòu)完整對(duì)于保持小鼠的生殖能力是十分重要的，熒光顯微鏡下觀察小鼠睪丸細(xì)胞的dna被染料染成綠色。正常對(duì)照組和cblb502組單處理的小鼠睪丸成圓形的熒光，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象；輻照對(duì)照組小鼠睪丸細(xì)胞出現(xiàn)明顯的彗星樣拖尾，表明dna鏈斷裂；而cblb502預(yù)處理組小鼠睪丸細(xì)胞拖尾與單獨(dú)輻照組相比，彗星拖尾明顯縮短。利用casplab軟件進(jìn)行分析(圖6a)，計(jì)算出彗尾dna的含量(dnaintail％)和olive彗尾位移(olivemoment)。結(jié)果顯示(圖6b)輻照后睪丸細(xì)胞彗尾dna的含量和olive彗尾位移比升高(p<0.001)；cblb502預(yù)處理組與輻照對(duì)照組相比，細(xì)胞彗尾dna的含量(p<0.01)和olive彗尾位移(p<0.001)降低。以上結(jié)果表明，cblb502能減輕輻射所致小鼠睪丸細(xì)胞的dna損傷。

實(shí)施例8cblb502降低小鼠和子代染色體畸形

細(xì)胞染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)是重要的遺傳指標(biāo)之一。小鼠有20對(duì)染色體，本發(fā)明觀察統(tǒng)計(jì)了3種不同類型染色體畸形(圖7a)，環(huán)狀(ring)，斷裂(broken)，棒狀(rodlike)。具體方法如下：

取各組小鼠腹腔注射秋水仙素溶液，脫頸法處死小鼠，取出股骨，沖出骨髓,收集沖洗液，100目篩子過(guò)濾，離心棄上清，經(jīng)低滲、固定后，制備滴冰片，進(jìn)行吉姆薩染染色，并觀察和照相。

結(jié)果顯示，輻照后第60天小鼠畸形率顯著高于正常對(duì)照組(p<0.001)，而cblb502預(yù)處理組畸形率低于輻照組(p<0.05)；5gy輻照后小鼠后代染色體畸形率仍高于正常對(duì)照組(p<0.05)；cblb502預(yù)處理組后代畸形率明顯降低，接近正常對(duì)照小鼠。

實(shí)施例9cblb502對(duì)化療藥物白消安導(dǎo)致的小鼠睪丸損傷的防護(hù)

本實(shí)施例采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為spf級(jí)balb/c小鼠；選用的化療藥物為白消安(busulfan)，其用10％dmso溶解配制。將小鼠隨機(jī)分成以下三組：

對(duì)照組(dmso):單獨(dú)腹腔注射dmso，200μl；

白消安組：小鼠一次性腹腔注射白消安(busulfan)30mg/kg；

白消安+502：在小鼠注射白消安前30min腹腔注射0.2mg/kgcblb502。

給藥后90天觀察小鼠精子數(shù)量、精子運(yùn)動(dòng)能力和睪丸組織損傷，結(jié)果見(jiàn)圖8。結(jié)果顯示給藥之后白消安組小鼠的精子總數(shù)和運(yùn)動(dòng)能力明顯下降，而白消安+502實(shí)驗(yàn)組的精子數(shù)和精子運(yùn)動(dòng)能力均顯著高于白消安組。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。