本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物制品領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種o型口蹄疫病毒疫苗與非o型(例如，a型)口蹄疫病毒疫苗的組合物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

口蹄疫(foot-and-mouthdisease，fmd)是由fmd病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，fmdv)引起的豬、牛和羊等偶蹄動(dòng)物感染的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。fmdv具有a、o、asial、c、sat1、sat2和sat3共7個(gè)不同的血清型，血清型間無(wú)交叉保護(hù)。

多年來(lái)，o型、a型兩個(gè)血清型口蹄疫疫情嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)。asia1型口蹄疫在2007年更換疫苗毒株以后，疫情迅速得以控制，2009年之后未見(jiàn)臨床報(bào)道，目前已經(jīng)趨于消亡。2010年，o型mya-98毒株傳入我國(guó)，引發(fā)嚴(yán)重疫情，使得流行于我國(guó)的o型口蹄疫更為復(fù)雜；a型sea-97g1毒株和g2毒株自2009年和2013年先后傳入我國(guó)，已致多省爆發(fā)疫情，損失巨大。

目前，我國(guó)主要流行的是o型和a型兩個(gè)血清型，流行毒株主要有mya-98毒株、panasia毒株和a型sea-97g2毒株，鑒于國(guó)內(nèi)和周邊口蹄疫流行的復(fù)雜現(xiàn)狀及口蹄疫各血清型之前無(wú)交叉免疫的現(xiàn)象，現(xiàn)急需研制針對(duì)o型和a型流行毒株的針對(duì)性疫苗，且要求該疫苗具備高效性，廣譜性，能同時(shí)預(yù)防多個(gè)毒株，對(duì)當(dāng)前流行毒株都有效保護(hù)等特點(diǎn)，為我國(guó)和周邊流行國(guó)家提供一種高效的疫苗。

反向遺傳操作技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒基因的修飾與改造，克服了從流行毒株馴化疫苗株耗時(shí)費(fèi)力，抗原性差，抗體應(yīng)答晚等自然屬性制約，實(shí)現(xiàn)更為主動(dòng)的疫苗毒株構(gòu)建和改良。因此，本研究利用已建立的具有較強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答毒株的反向遺傳操作系統(tǒng)為框架，制備含篩選的o型mya-98毒株抗原骨架的疫苗株，聯(lián)合利用反向遺傳技術(shù)已研制成功的a型口蹄疫重組疫苗株，制備口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗，獲得生產(chǎn)性能好、抗原匹配性好，抗原譜廣，能夠同時(shí)預(yù)防o型和a型口蹄疫，免疫效力強(qiáng)，免疫持續(xù)期長(zhǎng)等為特征的二價(jià)疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種口蹄疫病毒疫苗組合物、一種制備所述口蹄疫病毒疫苗組合物的方法、以及所述口蹄疫病毒疫苗組合物在制備用于預(yù)防和/或控制動(dòng)物口蹄疫疾病的藥物中的用途。

一方面，本發(fā)明涉及一種口蹄疫病毒疫苗組合物。

在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫病毒疫苗組合物包含第一口蹄疫病毒疫苗和第二口蹄疫病毒疫苗，所述第一口蹄疫病毒疫苗包含含有第一口蹄疫重組核酸或由第一口蹄疫重組核酸編碼的第一口蹄疫病毒，所述第一口蹄疫重組核酸的序列包含非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的核酸序列，但是非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的核酸序列中相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因被口蹄疫病毒株o/jscz/2013株的核酸序列中相對(duì)應(yīng)的基因片段替換，所述第二口蹄疫病毒疫苗為非o型的口蹄疫病毒株。

在本申請(qǐng)中，“非o型的口蹄疫病毒株”是指口蹄疫病毒的核酸的部分或全部不是來(lái)源于o型血清型的毒株，例如，可以是來(lái)自于a、asial、c、sat1、sat2或者sat3型的口蹄疫病毒株。

在某些實(shí)施方式中，所述o/jscz/2013株的核酸序列中相對(duì)應(yīng)的基因片段與所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因等長(zhǎng)或者不等長(zhǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述o/jscz/2013株的核酸序列中相對(duì)應(yīng)的基因片段如seqidno:1所示。在某些實(shí)施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株中被替換的l基因的序列為所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的l基因中與p1基因相連接的至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，例如105個(gè)、110個(gè)、115個(gè)、120個(gè)、125個(gè)、130個(gè)、135個(gè)、140個(gè)、145個(gè)、150個(gè)、155個(gè)、160個(gè)、165個(gè)、170個(gè)、171個(gè)、172個(gè)、173個(gè)、174個(gè)、175個(gè)、176個(gè)、177個(gè)、178個(gè)、179個(gè)或者180個(gè)連續(xù)的核苷酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株中被替換的l基因的序列為所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的l基因中與p1基因相連接的177個(gè)連續(xù)的核苷酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株中被替換的p2基因的序列為所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的p2基因中與p1基因相連接的至少1000個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，例如1050個(gè)、1100個(gè)、1150個(gè)、1200個(gè)、1201個(gè)、1202個(gè)、1203個(gè)、1204個(gè)、1205個(gè)、1206個(gè)、1207個(gè)、1208個(gè)、1209個(gè)或者1210個(gè)連續(xù)的核苷酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株中被替換的p2基因的序列為所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的p2基因中與p1基因相連接的1206個(gè)連續(xù)的核苷酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的l基因中與p1基因相連接的177個(gè)連續(xù)的核苷酸序列、全部p1基因、以及p2基因中與p1基因相連接的1206個(gè)連續(xù)的核苷酸序列被如seqidno:1所示的序列替換。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，在口蹄疫病毒的基因組中，l基因、p1基因和p2基因從5’端至3’端依次排列。在本申請(qǐng)中，“相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因”是指l基因的3’端與p1基因的5’端可操作地連接，p1基因的3’端與p2基因的5’端可操作地連接。

在本申請(qǐng)中，“l(fā)基因”是指口蹄疫病毒的基因組中l(wèi)基因的一部分或全部，例如，l基因中與p1基因相連接的至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，例如105個(gè)、110個(gè)、115個(gè)、120個(gè)、125個(gè)、130個(gè)、135個(gè)、140個(gè)、145個(gè)、150個(gè)、155個(gè)、160個(gè)、165個(gè)、170個(gè)、171個(gè)、172個(gè)、173個(gè)、174個(gè)、175個(gè)、176個(gè)、177個(gè)、178個(gè)、179個(gè)或者180個(gè)連續(xù)的核苷酸序列。

在本申請(qǐng)中，“p2基因”是指口蹄疫病毒的基因組中p2基因的一部分或全部，例如，p2基因中與p1基因相連接的至少1000個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，例如1050個(gè)、1100個(gè)、1150個(gè)、1200個(gè)、1201個(gè)、1202個(gè)、1203個(gè)、1204個(gè)、1205個(gè)、1206個(gè)、1207個(gè)、1208個(gè)、1209個(gè)或者1210個(gè)連續(xù)的核苷酸序列。

在本申請(qǐng)中，“口蹄疫病毒株o/jscz/2013株的核酸序列中相對(duì)應(yīng)的基因片段”是指口蹄疫病毒株o/jscz/2013株的基因組中相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因，其中l(wèi)基因可以是o/jscz/2013株l基因的全部或者一部分，p2基因可以是o/jscz/2013株p2基因的全部或者一部分。

在本申請(qǐng)中，“非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株”是指口蹄疫病毒的核酸的部分或全部不是來(lái)源于o/jscz/2013株的毒株，例如，可以是來(lái)自于o/cha/99株、o/gdby/2010株、a/gd/2013株及oie推薦的高效疫苗株等口蹄疫病毒株。在某些實(shí)施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株為o/cha/99株。

在某些實(shí)施方式中，所述第一口蹄疫病毒疫苗為o型口蹄疫病毒疫苗株。在某些實(shí)施方式中，所述第一口蹄疫病毒疫苗能夠激發(fā)對(duì)o型口蹄疫病毒株的免疫活性。在某些實(shí)施方式中，所述o型口蹄疫病毒株為mya-98、panasia或cathay譜系毒株。在某些實(shí)施方式中，所述o型口蹄疫病毒株為o/by/cha/2010、o/0834或o/0718，并且所述第一口蹄疫病毒疫苗對(duì)o/by/cha/2010、o/0834或o/0718的pd50值均大于6。

在某些實(shí)施方式中，所述第二口蹄疫病毒疫苗包含a、asial、c、sat1、sat2和sat3型中任一血清型的口蹄疫病毒疫苗株。在某些實(shí)施方式中，所述第二口蹄疫病毒疫苗為a型口蹄疫病毒疫苗株。在某些實(shí)施方式中，所述第二口蹄疫病毒疫苗能夠激發(fā)對(duì)a型口蹄疫病毒株的免疫活性。在某些實(shí)施方式中，所述a型口蹄疫病毒株為sea-97g1或sea-97g2毒株。在某些實(shí)施方式中，所述a型口蹄疫病毒株為a/wh/09或a/gdmm/2013，并且所述第二口蹄疫病毒疫苗對(duì)a/wh/09和a/gdmm/2013的pd50值均大于6。在某些實(shí)施方式中，所述第二口蹄疫病毒疫苗為a型口蹄疫病毒重組疫苗株。在某些實(shí)施方式中，所述a型口蹄疫病毒重組疫苗株包含如seqidno:4所示的核酸序列。

在某些實(shí)施方式中，所述a型口蹄疫病毒重組疫苗株的基因組包含口蹄疫病毒株o/cha/99株的核酸序列，但是其中相互毗鄰的部分l基因與p1基因片段被口蹄疫病毒株a/wh/cha/09株的核酸序列中相對(duì)應(yīng)的基因片段替換。在某些實(shí)施方式中，所述a/wh/cha/09株的核酸序列中相對(duì)應(yīng)的基因片段與所述o/cha/99株的部分l基因與p1基因片段等長(zhǎng)或者不等長(zhǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述a/wh/cha/09株的核酸序列中相對(duì)應(yīng)的基因片段如seqidno:4所示。

在本申請(qǐng)中，“相互毗鄰的部分l基因與p1基因片段”是指部分l基因的3’端與p1基因的5’端可操作地連接。

在本申請(qǐng)中，“口蹄疫病毒株a/wh/cha/09株的核酸序列中相對(duì)應(yīng)的基因片段”是指口蹄疫病毒株a/wh/cha/09株的基因組中相互毗鄰的l基因和p1基因片段，其中l(wèi)基因可以是a/wh/cha/09株l基因的全部或者一部分，p1基因可以是a/wh/cha/09株p1基因的全部或者一部分。

在某些實(shí)施方式中，所述第一口蹄疫病毒疫苗和所述第二口蹄疫病毒疫苗之間無(wú)免疫抑制。在本申請(qǐng)中，“無(wú)免疫抑制”是指所述第一口蹄疫病毒疫苗和所述第二口蹄疫病毒疫苗在免疫動(dòng)物以后不會(huì)顯著削弱對(duì)方的免疫效果。

在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫病毒疫苗組合物能夠激發(fā)對(duì)o型口蹄疫病毒株的免疫活性。在某些實(shí)施方式中，所述o型口蹄疫病毒株為mya-98、panasia或cathay譜系的流行毒株。在某些實(shí)施方式中，所述o型口蹄疫病毒株為o/by/cha/2010、o/0834或o/0718，并且所述疫苗組合物對(duì)o/by/cha/2010、o/0834或o/0718的pd50值均大于6。

在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫病毒疫苗組合物能夠激發(fā)對(duì)a型口蹄疫病毒株的免疫活性。在某些實(shí)施方式中，所述a型口蹄疫病毒株為sea-97g1或sea-97g2毒株。在某些實(shí)施方式中，所述a型口蹄疫病毒株為a/wh/09或a/gdmm/2013，并且所述疫苗組合物對(duì)a/wh/09和a/gdmm/2013的pd50值均大于6。

另一方面，本發(fā)明涉及一種制備口蹄疫病毒疫苗組合物的方法，其包含如下步驟：(a)培養(yǎng)第一口蹄疫病毒疫苗株并采集；(b)培養(yǎng)第二口蹄疫病毒疫苗株并采集；(c)將步驟(a)中采集的第一口蹄疫病毒疫苗株和步驟(b)中采集的第二口蹄疫病毒疫苗株滅活后進(jìn)行混合。在某些實(shí)施方式中，在混合之后再對(duì)口蹄疫病毒疫苗株進(jìn)行乳化。在某些實(shí)施方式中，所述乳化是與isa206佐劑以體積比1:1進(jìn)行。

在某些實(shí)施方式中，所述步驟(a)包含如下步驟：

1)、用特異性引物op12a-f和op12a-r與o/jscz/2013毒株的cdna核酸混合，以擴(kuò)增得到o/jscz/2013毒株的l基因、p1基因及p2基因片段，將獲得的基因片段替換插入真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pro/cha/99中，得到pro-fmdv的重組質(zhì)粒，所述特異性引物分別是：

op12a-f:5'-ttttccttaagggacaggaacacgccgtgtttgcctgcgt-3'(seqidno:2)

op12a-r:5'-actcacatcgatgtcaaagtgaaaccttc-3'(seqidno:3)；

2)、用步驟1)得到的真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pro-fmdv轉(zhuǎn)染口蹄疫病毒敏感細(xì)胞，獲得第一口蹄疫病毒疫苗株。

在某些實(shí)施方式中，所述o/jscz/2013毒株的l基因、p1基因及p2基因包含如seqidno:1所示的核酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫病毒敏感細(xì)胞為bhk-21細(xì)胞或ibrs-2細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，獲得的所述第一口蹄疫病毒疫苗株的146s抗原含量為4.0μg/ml以上(146s抗原含量的測(cè)定方法如中國(guó)發(fā)明專利zl201310017378.8所述，其全文通過(guò)引用并入本申請(qǐng))。在某些實(shí)施方式中，所述滅活用二乙烯亞胺進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，在所述滅活之后對(duì)所述第一口蹄疫病毒疫苗株進(jìn)行乳化。在某些實(shí)施方式中，所述乳化是與isa206佐劑以體積比1:1進(jìn)行。

在某些實(shí)施方式中，所述步驟(b)包含如下步驟：

1)、用特異性引物ap1-f和ap1-r與a/wh/cha/09毒株的cdna核酸混合，以擴(kuò)增得到a/wh/cha/09毒株的部分l基因與p1基因片段，將獲得的基因片段替換插入真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pro/cha/99中，得到pra-fmdv的重組質(zhì)粒，所述特異性引物分別是：

ap1-f：5'-ttttccttaagggacaggaacatgctgtgtttgcctgcgt-3'(seqidno:5)；

ap1-r：5'-tattttcaccggtgcaataattttctgcttgtgtctgtc-3'(seqidno:6)；

2)、用步驟1)得到的真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒ra-fmdv轉(zhuǎn)染口蹄疫病毒敏感細(xì)胞，獲得第二口蹄疫病毒疫苗株。

在某些實(shí)施方式中，所述第二口蹄疫病毒疫苗株包含如seqidno:4所示的核酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫病毒敏感細(xì)胞為bhk-21細(xì)胞或ibrs-2細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，獲得的所述第二口蹄疫病毒疫苗株的146s抗原含量為4.0μg/ml以上(146s抗原含量的測(cè)定方法如中國(guó)發(fā)明專利zl201310017209.4所述，其全文通過(guò)引用并入本申請(qǐng))。在某些實(shí)施方式中，所述滅活用二乙烯亞胺進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，在所述滅活之后對(duì)所述第二口蹄疫病毒疫苗株進(jìn)行乳化。在某些實(shí)施方式中，所述乳化是與isa206佐劑以體積比1:1進(jìn)行。

在某些實(shí)施方式中，所述第一口蹄疫病毒疫苗株和所述第二口蹄疫病毒疫苗株適于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述第一口蹄疫病毒疫苗株和所述第二口蹄疫病毒疫苗株可以以適當(dāng)?shù)谋壤旌?。可以將所述第一口蹄疫病毒疫苗株和所述第二口蹄疫病毒疫苗株分別制成具有一定病毒滴度的抗原液，滅活后再根據(jù)測(cè)得的抗原含量計(jì)算混合的比例。在某些實(shí)施方式中，所述第一口蹄疫病毒疫苗株和所述第二口蹄疫病毒疫苗株按抗原含量4:1到1:4的比例混合，例如，按抗原含量4:1、3:1、2:1、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5或1:4的比例混合。在某些實(shí)施方式中，所述混合是將所述第一口蹄疫病毒疫苗株和所述第二口蹄疫病毒疫苗株按抗原含量1:1的比例進(jìn)行混合。在某些實(shí)施方式中，所述滅活用二乙烯亞胺進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，在所述滅活之后對(duì)所述疫苗組合物進(jìn)行乳化。在某些實(shí)施方式中，所述乳化是與isa206佐劑以體積比1:1進(jìn)行。

另一方面，本發(fā)明涉及所述口蹄疫病毒疫苗組合物在制備用于預(yù)防和/或控制動(dòng)物口蹄疫疾病的藥物中的用途。在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫疾病為a、o、c、asial、sat1、sat2、或者sat3型口蹄疫疾病。在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫疾病為o型口蹄疫疾病。在某些實(shí)施方式中，所述口蹄疫疾病為a型口蹄疫疾病。在某些實(shí)施方式中，所述動(dòng)物為偶蹄類動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，所述動(dòng)物為豬、?；蜓颉?/p>

本發(fā)明具有如下積極效果：

本發(fā)明利用成熟的反向遺傳技術(shù)，構(gòu)建了病變時(shí)間短、病毒滴度高、抗原匹配性高、病毒產(chǎn)量高的o型重組疫苗株，聯(lián)合已經(jīng)研制成功的a型口蹄疫重組疫苗株，制備口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗，獲得生產(chǎn)性能好、抗原匹配性好，抗原譜廣，能夠同時(shí)預(yù)防o型和a型口蹄疫，増強(qiáng)免疫效力，延長(zhǎng)免疫持續(xù)期等為特征的二價(jià)疫苗。解決了篩選疫苗種毒的生產(chǎn)和馴化的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了首例利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建的疫苗種毒研制高效二價(jià)滅活疫苗。

1)、在病毒水平上提高了口蹄疫疫苗株的生產(chǎn)性能，o型重組疫苗株和a型重組疫苗株的病變時(shí)間降低，病毒滴度提高，降低了抗原生產(chǎn)成本。

2)、提高了疫苗毒株抗原匹配性和免疫應(yīng)答性，本發(fā)明構(gòu)的o型重組疫苗毒株和a型重組疫苗株的結(jié)構(gòu)蛋白與流行毒株一致，抗原匹配性完全匹配，提高了疫苗株與流行毒株的針對(duì)性。

3)、本發(fā)明的o型口蹄疫重組疫苗株和a型口蹄疫重組疫苗株均能夠在懸浮bhk-21細(xì)胞上快速、大量增殖，o型重組疫苗株病變收獲時(shí)間集中在8～14小時(shí)，抗原含量可達(dá)4.0μg/ml以上；a型重組疫苗株接種后6～10小時(shí)抗原含量可達(dá)4.0μg/ml以上。抗原含量的提升有效地節(jié)約了生產(chǎn)成本。

4)、本發(fā)明的o型口蹄疫重組疫苗株和a型口蹄疫重組疫苗株均具有抗原譜廣的特點(diǎn)，o型重組疫苗株的結(jié)構(gòu)蛋白是從經(jīng)過(guò)大量篩選的mya98毒株中擴(kuò)增得到的，選擇的毒株抗原位點(diǎn)與本譜系的流行毒株匹配性好，與其他譜系，panasia和cathay的流行毒株抗原交叉重疊。通過(guò)交叉免疫攻毒試驗(yàn)表明，o型重組疫苗株能夠有效保護(hù)mya-98、panasia和cathay流行毒株；a型口蹄疫重組疫苗株也具有交叉免疫保護(hù)特性，能夠有效保護(hù)sea-97g1毒株和g2毒株，實(shí)現(xiàn)了疫苗的抗原廣譜性。

5)、制備的口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗，免疫動(dòng)物，能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，o型抗原和a型抗原間具有協(xié)同增強(qiáng)免疫應(yīng)答的作用，免疫持續(xù)期提升至6個(gè)月左右，大幅度增強(qiáng)了口蹄疫疫苗的免疫效力。

6)、本發(fā)明技術(shù)改變了疫苗毒篩選馴化技術(shù)受病毒自然屬性制約大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成功率低的缺陷，實(shí)現(xiàn)了更為主動(dòng)有效的疫苗毒株構(gòu)建，更實(shí)現(xiàn)了口蹄疫滅活疫苗毒種制備工藝的革新，具有重大應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中fmdvo/jscz/2013株l基因、p1基因及p2基因片段的電泳圖，其中1為擴(kuò)增片段，m為dnamarker。

圖2為實(shí)施例1中o型口蹄疫病毒重組質(zhì)粒pro-fmdv的構(gòu)建策略示意圖。

圖3為實(shí)施例2中重組病毒ro-fmdv感染bhk-21細(xì)胞后引起的細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)，其中a表示正常bhk-21細(xì)胞；b表示出現(xiàn)cpe的bhk-21細(xì)胞。

圖4為seqidno:1的核酸序列。

圖5為seqidno:2和seqidno:3的核酸序列。

圖6為seqidno:4的核酸序列。

圖7為seqidno:5和seqidno:6的核酸序列。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)的毒株積累和對(duì)其全基因組序列的分析研究，擴(kuò)增o型口蹄疫病毒o/jscz/2013株l基因、p1及p2基因，通過(guò)選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與已經(jīng)建立的o型口蹄疫病毒o/cha/99株的拯救系統(tǒng)中相應(yīng)核苷酸序列進(jìn)行替換，得到一種o型口蹄疫病毒重組質(zhì)粒pro-fmdv，在bhk-21細(xì)胞或ibrs-2細(xì)胞上拯救后，得到o型口蹄疫重組病毒ro-fmdv，其與流行毒的抗原匹配性完全匹配，且與panasia和cathay譜系的流行毒株抗原交叉重疊，抗原譜廣。該重組疫苗株生產(chǎn)性能好，用懸浮bhk-21細(xì)胞生產(chǎn)，其抗原含量可達(dá)4.0μg/ml以上，制備的疫苗可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)的抗體應(yīng)答，具有高滴度、高抗原產(chǎn)能、抗原譜廣、致病性降低、抗體應(yīng)答水平較高、免疫保護(hù)率高的特點(diǎn)。將得到的o型重組疫苗株聯(lián)合利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建并研制成功的a型口蹄疫重組疫苗株，制備口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗，該疫苗免疫豬和牛，能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)的免疫應(yīng)答，抗體應(yīng)答水平高，抗原間有協(xié)同增強(qiáng)免疫應(yīng)答的作用，免疫保護(hù)率高，免疫持續(xù)期長(zhǎng)。對(duì)目前流行于國(guó)內(nèi)的o型mya98毒株、panasia毒株、cathay毒株和a型sea-97g1毒株和g2毒株均能夠提供良好的免疫保護(hù)效力。

下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。

下列實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)條件，如《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(f.m.奧斯伯，r.e.金斯頓，j.g.賽德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍譯，北京：科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。

實(shí)施例1.o型口蹄疫重組病毒感染性克隆的構(gòu)建

本發(fā)明人所用o/jscz/2013毒株由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局指定國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室保藏，公眾可通過(guò)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局批示的委托函獲得。根據(jù)o/jscz/2013株基因組序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)擴(kuò)增引物，op12a-f(5'-ttttccttaagggacaggaacacgccgtgtttgcctgcgt-3')和op12a-r(5'-actcacatcgatgtcaaagtgaaaccttc-3')，用rnaeasyminikit(qiagen)提取o/jscz/2013毒株的總rna，用引物olignoti(5’-ttttctagagcggccgct38-3’)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cdna，用具有極強(qiáng)延伸能力的primescriptreversetranscriptase(takara公司)反轉(zhuǎn)錄酶，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配制20μl反應(yīng)體系，于42℃反應(yīng)1h備用，以反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cdna為模板，用引物op12a-f和op12a-r與o/jscz/2013毒株的cdna核酸混合，擴(kuò)增獲得o/jscz/2013毒株的基因片段。擴(kuò)增用適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增、性能優(yōu)良的la(takara公司)dna聚合酶，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配制50μl反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃3min30s，35個(gè)循環(huán)后，72℃10min，純化回收pcr擴(kuò)增產(chǎn)物并送測(cè)序，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖1所示，大小為3591bp，與預(yù)期大小相符，測(cè)序結(jié)果顯示是seqidno:1所示的核苷酸序列。

將得到的含有o/jscz/2013毒株l基因、p1和p2基因片段以及o型口蹄疫病毒o/cha/99株拯救系統(tǒng)的質(zhì)粒pro/cha/99(公開(kāi)于授權(quán)專利“asia1型口蹄疫重組病毒及其制備方法和應(yīng)用”zl201310175323.x和“a型口蹄疫重組疫苗株及其制備方法和應(yīng)用”zl201310175324.4中，其全文通過(guò)引用并入本申請(qǐng)中)分別用aflii和clai雙酶切后，純化回收相應(yīng)的目的片段，連接、轉(zhuǎn)化至jm109感受態(tài)細(xì)胞中，測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，獲得含o/jscz/2013毒株l基因、p1及p2基因的重組質(zhì)粒pro-fmdv，構(gòu)建方法如圖2所示。

實(shí)施例2.o型口蹄疫重組病毒的拯救

用plasmidplusmaxikit(qiagen公司)制備由實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒pro-fmdv，當(dāng)bhk-21細(xì)胞生長(zhǎng)至80％時(shí)用于轉(zhuǎn)染，在脂質(zhì)體lipofectamine^tm2000(invitrogen)的介導(dǎo)下將4μg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染bhk-21細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立脂質(zhì)體對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照，放置于含5％co2的37℃培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)染6h后棄去上清，加入mem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞病變情況，待細(xì)胞出現(xiàn)90％左右病變時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融3次后再次接種bhk-21細(xì)胞，直到病毒能穩(wěn)定地產(chǎn)生細(xì)胞病變，出現(xiàn)細(xì)胞變圓，聚集成葡萄狀分布，最終細(xì)胞崩解成碎片。將得到的o型口蹄疫重組病毒命名為ro-fmdv，在圖3中，a：為正常對(duì)照bhk-21細(xì)胞圖片；b：拯救的重組病毒ro-fmdv感染bhk-21細(xì)胞出現(xiàn)的cpe的圖片。

實(shí)施例3.rt-pcr鑒定o型口蹄疫重組病毒

將穩(wěn)定傳代的重組病毒ro-fmdv感染bhk-21細(xì)胞的上清用rnaeasyminikit(qiagen)提取總rna，反轉(zhuǎn)錄后，擴(kuò)增，純化回收后送測(cè)序，結(jié)果顯示獲得的重組o型口蹄疫病毒的l基因、p1及p2基因與o/jscz/2013株的基因序列是一致的。

實(shí)施例4.a型口蹄疫重組病毒感染性克隆的構(gòu)建

本發(fā)明人所用a/wh/cha/09毒株由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局指定國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室保藏，公眾可通過(guò)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局批示的委托函獲得。用rnaeasyminikit(qiagen)提取a/wh/cha/09毒株的總rna，用引物olignoti(5’-ttttctagagcggccgct38-3’)反轉(zhuǎn)錄合成病毒第一鏈cdna，以合成的第一鏈cdna為模板，用引物ap1-f(5'-ttttccttaagggacaggaacatgctgtgtttgcctgcgt-3')和ap1-r(5'-tattttcaccggtgcaataattttctgcttgtgtctgtc-3')擴(kuò)增獲得a/wh/cha/09毒株的基因片段。擴(kuò)增用適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增、性能優(yōu)良的la(takara公司)dna聚合酶，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)構(gòu)建50μl反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃2min30s，35個(gè)循環(huán)，72℃8min，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳核實(shí)后進(jìn)行純化回收并送交測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示是seqidno:4所示的核苷酸序列。

將得到的含有a/wh/cha/09毒株部分l基因和p1片段和o型口蹄疫病毒o/cha/99株拯救系統(tǒng)的質(zhì)粒pro/cha/99分別用aflii和sgrai雙酶切后，純化回收相應(yīng)的目的片段，連接、轉(zhuǎn)化至jm109感受態(tài)細(xì)胞中，測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，獲得含a/wh/cha/09毒株部分前導(dǎo)蛋白l和結(jié)構(gòu)蛋白p1的重組質(zhì)粒pra-fmdv(所用質(zhì)粒與方法公開(kāi)于授權(quán)專利“a型口蹄疫重組疫苗株及其制備方法和應(yīng)用”zl201310175324.4，其全文通過(guò)引用并入本申請(qǐng)中)。

實(shí)施例5.a型口蹄疫重組病毒的拯救

用plasmidplusmaxikit(qiagen公司)制備由實(shí)施例4得到的重組質(zhì)粒pra-fmdv，當(dāng)bhk-21細(xì)胞生長(zhǎng)至80％時(shí)用于轉(zhuǎn)染，在脂質(zhì)體lipofectamine^tm2000(invitrogen)的介導(dǎo)下將4μg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染bhk-21細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立脂質(zhì)體對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照，放置于含5％co2的37℃培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)染6h后棄去上清，加入mem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞病變情況，待細(xì)胞出現(xiàn)90％左右病變時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融3次后再次接種bhk-21細(xì)胞，直到病毒能穩(wěn)定地產(chǎn)生細(xì)胞病變，出現(xiàn)細(xì)胞變圓，聚集成葡萄狀分布，最終細(xì)胞崩解成碎片。將得到的a型口蹄疫重組病毒命名為ra-fmdv。

實(shí)施例6.rt-pcr鑒定a型口蹄疫重組病毒

將穩(wěn)定傳代的重組病毒ra-fmdv感染bhk-21細(xì)胞的上清用rnaeasyminikit(qiagen)提取總rna，反轉(zhuǎn)錄后，擴(kuò)增，純化回收后送測(cè)序，結(jié)果顯示獲得的重組a型口蹄疫病毒的部分l與p1基因與a/wh/cha/09株的基因序列是一致的。

實(shí)施例7.口蹄疫o型、a型重組疫苗株對(duì)bhk-21細(xì)胞的致病力試驗(yàn)

7.1口蹄疫o型重組疫苗株對(duì)bhk-21細(xì)胞的致病力試驗(yàn)

按照常規(guī)方法對(duì)bhk-21細(xì)胞進(jìn)行消化，加入含10％胎牛血清的mem細(xì)胞培養(yǎng)基，分散于12孔板中，于37℃含有5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞單層長(zhǎng)到90％時(shí)備用。用mem以10倍倍比稀釋病毒液，將各稀釋度(10^-4.0～10^-9.0)的病毒液分別加入細(xì)胞板中，每個(gè)稀釋度4孔，放入37℃含有5％co2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察3天，用reed-muench氏法測(cè)定對(duì)bhk-21細(xì)胞的半數(shù)感染量(tcid50)。按照該法測(cè)定ro-fmdv的滴度，計(jì)算o型口蹄疫重組疫苗株ro-fmdv的tcid50為10^-8.33/ml。

reed-muench計(jì)算方法是本領(lǐng)域的已有技術(shù)，現(xiàn)有文獻(xiàn)“reed,l.j.andmuench,h.(1938)."asimplemethodofestimatingfiftypercentendpoints".theamericanjournalofhygiene27:493–497”中對(duì)此已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)地描述，該文獻(xiàn)在此通過(guò)引用方式并入本申請(qǐng)用作參考。

7.2口蹄疫a型重組疫苗株對(duì)bhk-21細(xì)胞的致病力試驗(yàn)

按7.1中所述的方法，測(cè)定實(shí)施例5中制備的a型口蹄疫重組疫苗株ra-fmdv對(duì)bhk-21細(xì)胞的半數(shù)感染量(tcid50)。計(jì)算a型口蹄疫重組疫苗株ra-fmdv的tcid50為10^-8.33/ml。

實(shí)施例8.bhk-21懸浮細(xì)胞培養(yǎng)口蹄疫o型、a型重組疫苗株

8.1bhk-21懸浮細(xì)胞對(duì)o型口蹄疫重組疫苗株的敏感性試驗(yàn)

將已經(jīng)使用貼壁bhk-21細(xì)胞培養(yǎng)并收獲的o型口蹄疫重組疫苗株ro-fmdv接種5l生物反應(yīng)器懸浮細(xì)胞，設(shè)定適應(yīng)的溶氧、溫度、ph值與轉(zhuǎn)速等，通過(guò)定時(shí)取樣，觀察細(xì)胞形態(tài)并檢測(cè)樣品的病毒含量(表1)。結(jié)果表明該疫苗株可以很好的適應(yīng)bhk-21懸浮細(xì)胞，且病變時(shí)間短，抗原含量能夠達(dá)到4.0μg/ml以上，達(dá)到制苗要求。通過(guò)連續(xù)5代的懸浮細(xì)胞傳代，經(jīng)rt-pcr擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)核苷酸突變現(xiàn)象，說(shuō)明該毒株具有良好的穩(wěn)定性，可以用懸浮細(xì)胞進(jìn)行重組口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗中o型口蹄疫抗原的生產(chǎn)制備。

表1ro-fmdv疫苗株懸浮適應(yīng)結(jié)果

懸浮細(xì)胞bhk-21對(duì)o型口蹄疫重組疫苗株具有良好的感染、增殖敏感性，能較好地實(shí)現(xiàn)口蹄疫病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制與增殖，出現(xiàn)細(xì)胞死亡、裂解等特征性病變，病毒含量高峰規(guī)律性集中在8～14小時(shí)，同時(shí)抗原146s得到提高，連續(xù)傳代證明疫苗株能夠穩(wěn)定增殖，完全可以使用懸浮bhk-21細(xì)胞生產(chǎn)o型口蹄疫抗原制備重組二價(jià)滅活疫苗。

8.2bhk-21懸浮細(xì)胞對(duì)a型重組疫苗株的敏感性試驗(yàn)

將已經(jīng)使用貼壁bhk-21細(xì)胞培養(yǎng)并收獲的a型口蹄疫重組疫苗株ra-fmdv接種5l生物反應(yīng)器懸浮細(xì)胞，設(shè)定適應(yīng)的溶氧、溫度、ph值與轉(zhuǎn)速等，通過(guò)定時(shí)取樣，觀察細(xì)胞形態(tài)并檢測(cè)樣品的病毒含量(表2)。結(jié)果表明該疫苗株可以很好的適應(yīng)bhk-21懸浮細(xì)胞，且病變時(shí)間短，抗原含量能夠達(dá)到4.0μg/ml以上，達(dá)到制苗要求。通過(guò)連續(xù)5代的懸浮細(xì)胞傳代，經(jīng)rt-pcr擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)核苷酸突變現(xiàn)象，結(jié)果說(shuō)明該毒株具有良好的穩(wěn)定性，可以用懸浮細(xì)胞進(jìn)行重組口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗中a型口蹄疫抗原的生產(chǎn)制備。

表2ra-fmdv疫苗株懸浮適應(yīng)結(jié)果

懸浮bhk-21細(xì)胞接種a型口蹄疫重組疫苗株ra-fmdv后，平均7個(gè)小時(shí)左右溶氧接近于零，之后逐步病變、裂解，并產(chǎn)生大量具有感染性的病毒粒子，說(shuō)明病毒增殖速度快，致細(xì)胞病變時(shí)間短于其他毒株。接毒后6～10小時(shí)后細(xì)胞基本死亡、崩解，活率為零，病毒粒子146s含量可達(dá)4.0μg/ml以上，最終收毒時(shí)甚至高達(dá)6.33μg/ml，說(shuō)明a型口蹄疫重組疫苗株ra-fmdv在懸浮培養(yǎng)的bhk-21細(xì)胞中可大量增殖，且bhk-21細(xì)胞株對(duì)該重組疫苗株具有良好敏感性，通過(guò)連續(xù)5代懸浮培養(yǎng)，病毒毒價(jià)與146s很高，連續(xù)傳代測(cè)序證明疫苗株能夠穩(wěn)定增殖，完全可以使用懸浮bhk-21細(xì)胞生產(chǎn)a型口蹄疫抗原制備重組二價(jià)滅活疫苗。

實(shí)施例9.o型口蹄疫重組疫苗的制備和免疫效果評(píng)價(jià)

9.1疫苗制備

將由懸浮bhk-21細(xì)胞制備的重組病毒ro-fmdv滅活，用3mmol/l二乙烯亞胺(binaryethylenimine,bei)(sigma公司)30℃滅活30h，加入阻斷劑硫代硫酸鈉溶液，4℃過(guò)夜，保存?zhèn)溆?。滅活抗原?jīng)安檢后與isa206佐劑(法國(guó)seppic)以1：1比例混合制備疫苗。具體按照《中華人民共和國(guó)藥典》中獸用生物制品的口蹄疫滅活疫苗規(guī)程制備。安檢牛舌部皮下注射滅活病毒2ml/頭，連續(xù)逐日觀察6日，觀察期牛健康良好，蹄部和嘴鼻均無(wú)異常。實(shí)驗(yàn)用牛購(gòu)自非疫區(qū)，并經(jīng)國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測(cè)o型抗體均＜1：4。fmd非結(jié)構(gòu)蛋白3abc-elisa抗體檢測(cè)為陰性。

9.2疫苗免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)

將得到的安檢合格的o型口蹄疫重組病毒疫苗分別免疫10頭牛，10頭豬，同時(shí)各設(shè)2頭非免疫對(duì)照，測(cè)定其免疫效力。攻毒方法及結(jié)果判定方法均按照《manualofdiagnostictestsandvaccinesforterrestrialanimals》(2009年版，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie))中所述。

免疫豬28天后，用1000倍豬半數(shù)感染劑量(sid50劑量)的流行毒進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，連續(xù)觀察10天，結(jié)果表明，免疫的動(dòng)物沒(méi)有臨床癥狀，100％保護(hù)，如表3所示。

表3o型口蹄疫重組疫苗免疫豬攻毒后臨床癥狀和保護(hù)情況

免疫牛28天后，用10000倍牛半數(shù)感染劑量(bid50劑量)的流行毒進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，連續(xù)觀察10天，結(jié)果表明：免疫的動(dòng)物沒(méi)有臨床癥狀，100％保護(hù)，如表4所示。

表4o型口蹄疫重組疫苗免疫牛攻毒后臨床癥狀和保護(hù)情況

說(shuō)明用該o型口蹄疫重組病毒作為疫苗株免疫豬和牛，能有效保護(hù)當(dāng)前o型口蹄疫流行毒的攻擊。

9.3疫苗免疫效力與交叉攻毒試驗(yàn)

按2015年版《中國(guó)獸藥典》方法進(jìn)行，口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測(cè)o抗體均＜1：4。fmd非結(jié)構(gòu)蛋白3abc-elisa抗體檢測(cè)為陰性。本試驗(yàn)所用動(dòng)物均嚴(yán)格在absl-3實(shí)驗(yàn)室圈養(yǎng)。按照2015年版《中國(guó)獸藥典》記載的半數(shù)保護(hù)量(pd50)測(cè)定方法來(lái)測(cè)定疫苗的半數(shù)保護(hù)量，具體方法如下。免疫組每組15頭，免疫劑量分1頭份、1/3頭份、1/9頭份，分別免疫，28d后，分別用mya-98、panasia、cathay的流行代表毒進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為1000倍sid50，每組設(shè)3頭對(duì)照，攻毒方式為肌肉注射。連續(xù)觀察15日，根據(jù)舌面、齒齦、蹄出現(xiàn)水泡等口蹄疫癥狀判定病毒液致動(dòng)物發(fā)病情況，動(dòng)物發(fā)病即判為不保護(hù)。計(jì)算各組免疫動(dòng)物的保護(hù)比例。最后再按照reed-muench法分別計(jì)算各組的pd50。

免疫效力及交叉攻毒試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，o型口蹄疫重組毒株對(duì)mya-98、panasia和cathay的pd50分別為13.59、7.05、9.0，對(duì)o型不同拓?fù)湫涂谔阋卟《镜拿庖弑Ｗo(hù)效力大于oie推薦的pd50(即，6)，是理想的抗o型口蹄疫重組疫苗，可用于我國(guó)及其周邊國(guó)家o型口蹄疫病毒的預(yù)防和控制，參見(jiàn)表5。

表5o型口蹄疫重組疫苗株免疫效力及交叉攻毒保護(hù)結(jié)果

實(shí)施例10.a型口蹄疫重組疫苗的制備和免疫效果評(píng)價(jià)

10.1疫苗制備

將由懸浮bhk-21細(xì)胞制備的重組病毒ra-fmdv滅活，用3mmol/l二乙烯亞胺(binaryethylenimine,bei)(sigma公司)30℃滅活30h，加入阻斷劑硫代硫酸鈉溶液，4℃過(guò)夜，保存?zhèn)溆?。滅活抗原?jīng)安檢后與isa206佐劑(法國(guó)seppic)以1：1比例混合制備疫苗。具體按照《中華人民共和國(guó)藥典》中獸用生物制品的口蹄疫滅活疫苗規(guī)程制備。安檢牛舌部皮下注射滅活病毒2ml/頭，連續(xù)逐日觀察6日，觀察期牛健康良好，蹄部和嘴鼻均無(wú)異常。實(shí)驗(yàn)用牛購(gòu)自非疫區(qū)，并經(jīng)國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測(cè)a型抗體均＜1：4。fmd非結(jié)構(gòu)蛋白3abc-elisa抗體檢測(cè)為陰性。

10.2疫苗免疫效力實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)用牛購(gòu)自非疫區(qū)，并經(jīng)國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測(cè)a型抗體均＜1：4。fmd非結(jié)構(gòu)蛋白3abc-elisa抗體檢測(cè)為陰性。本試驗(yàn)所用動(dòng)物均嚴(yán)格在absl-3實(shí)驗(yàn)室圈養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用牛分為4組，對(duì)照組是免疫過(guò)流行毒a/wh/cha/09制備的疫苗，實(shí)驗(yàn)組是免疫過(guò)重組ra-fmdv制備的疫苗，攻毒用毒為10000倍bid50的流行毒a/wh/cha/09。攻毒方式為舌面皮內(nèi)分多點(diǎn)注射毒液。連續(xù)觀察15日，根據(jù)牛舌面、齒齦、蹄出現(xiàn)水泡、潰瘍等口蹄疫癥狀判定病毒液致牛發(fā)病情況。免疫效力測(cè)定結(jié)果表明，a型口蹄疫重組毒株的pd50在10.81～13.59，而流行毒株制備的疫苗pd50為5.57(表6)。

表6重組毒株與流行毒株pd50實(shí)驗(yàn)比較表

實(shí)施例11.重組口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗的制備和免疫效果評(píng)價(jià)

11.1疫苗制備

將由懸浮bhk-21細(xì)胞培養(yǎng)的重組疫苗株ro-fmdv及ra-fmdv分別滅活，用3mmol/l二乙烯亞胺(binaryethylenimine,bei)(sigma公司)30℃滅活30h，加入阻斷劑硫代硫酸鈉溶液，4℃過(guò)夜，保存?zhèn)溆?。滅活抗原檢測(cè)146s，經(jīng)安檢后每種抗原按146s2.0ug/頭份(共1ml)，抗原溶液與isa206佐劑(法國(guó)seppic)以1：1比例混合進(jìn)行乳化，制備二價(jià)滅活疫苗。具體按照《中華人民共和國(guó)藥典》中獸用生物制品的口蹄疫滅活疫苗規(guī)程制備。安檢牛舌部皮下注射滅活病毒2ml/頭，連續(xù)逐日觀察6日，觀察期牛健康良好，蹄部和嘴鼻均無(wú)異常。實(shí)驗(yàn)用牛購(gòu)自非疫區(qū)，并經(jīng)國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測(cè)o型、a型抗體均＜1：4。fmd非結(jié)構(gòu)蛋白3abc-elisa抗體檢測(cè)為陰性。

11.2疫苗免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)

篩選陰性動(dòng)物，口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測(cè)o型、a型抗體均＜1：4。fmd非結(jié)構(gòu)蛋白3abc-elisa抗體檢測(cè)為陰性。將得到的安檢合格的重組口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗免疫豬，同時(shí)各設(shè)2頭非免疫對(duì)照，測(cè)定其免疫效力。免疫組每組10頭，免疫劑量分1頭份、1/3頭份、1/9頭份，o型攻毒株為2010年流行至今的mya98毒株(o/mya98/by/2010)，a型攻毒株選用2013至今優(yōu)勢(shì)流行毒株a/gdmm。攻毒方法及結(jié)果判定方法均按照《manualofdiagnostictestsandvaccinesforterrestrialanimals》(2009年版，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie))中所述。

免疫豬28天后，用1000倍sid50毒劑量分別進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，連續(xù)觀察15天，對(duì)照豬均至少有一蹄出現(xiàn)水泡或潰瘍，免疫豬出現(xiàn)任何口蹄疫癥狀即判為不保護(hù)。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)免疫豬的保護(hù)數(shù)，按reed-muench法計(jì)算被檢疫苗的pd50(表7)。

表7重組口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗免疫效力攻毒保護(hù)結(jié)果

通過(guò)3次的疫苗免疫效力實(shí)驗(yàn)，其保護(hù)效力結(jié)果均大于oie推薦的pd50(即，6)，說(shuō)明用該重組口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗免疫動(dòng)物，能有效保護(hù)當(dāng)前o型mya98毒株及a型sea-97g2毒株這些流行毒株的攻擊。

11.3交叉攻毒保護(hù)試驗(yàn)

按上述相同的檢測(cè)方法，篩選陰性動(dòng)物。將重組口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗免疫豬，免疫組每組15頭，免疫劑量分1頭份、1/3頭份、1/9頭份，分別免疫，28d后，o型的交叉攻毒株選用panasia(o/0834)和cathay(0718)，a型毒株采用2009年流行的(a/wh/09)作為交叉攻毒毒株進(jìn)行攻毒。攻毒劑量1000倍sid50，每組設(shè)3頭對(duì)照，連續(xù)觀察15日，根據(jù)舌面、齒齦、蹄出現(xiàn)水泡等口蹄疫癥狀判定病毒液致動(dòng)物發(fā)病情況，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，免疫效力及交叉攻毒試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，交叉攻毒試驗(yàn)測(cè)得的疫苗半數(shù)動(dòng)物保護(hù)數(shù)均在6個(gè)pd50以上，說(shuō)明交叉攻毒動(dòng)物保護(hù)效果很好。疫苗免疫動(dòng)物后能抵抗這些毒株的攻擊，可以作為國(guó)內(nèi)預(yù)防o型和a型口蹄疫的二價(jià)疫苗。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8重組口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗免疫交叉攻毒保護(hù)結(jié)果

11.4免疫持續(xù)期試驗(yàn)

篩選陰性動(dòng)物，口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測(cè)o型、a型抗體均＜1：4。fmd非結(jié)構(gòu)蛋白3abc-elisa抗體檢測(cè)為陰性。將得到的安檢合格的重組口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗按2ml/頭劑量免疫豬，分別在免疫后7日、14日、21日、28日、60日、90日、120日、150日、180日、210日采血分離血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，同時(shí)在28日、180日、210日進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。檢測(cè)各型抗體(表9，表10)并統(tǒng)計(jì)攻毒保護(hù)情況(表11)，結(jié)果說(shuō)明該疫苗具有非常好的抗原保護(hù)力與免疫原性，能有效激發(fā)血清中和抗體，免疫持續(xù)期提升至6個(gè)月左右(常規(guī)疫苗4個(gè)月左右)，最終確定了重組口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗的免疫持續(xù)期為6個(gè)月。

表9疫苗免疫后o型elisa抗體水平檢測(cè)結(jié)果

“/”表示未測(cè)抗體(動(dòng)物已進(jìn)行攻毒試驗(yàn))

表10免疫接種后a型elisa抗體水平檢測(cè)結(jié)果

“/”表示未測(cè)抗體(動(dòng)物已進(jìn)行攻毒試驗(yàn))

免疫后7日、14日、21日、28日、60日、90日、120日、150日、180日、210日采血分離血清進(jìn)行o型、a型抗體檢測(cè)，于免疫后7日抗體水平開(kāi)始轉(zhuǎn)陽(yáng)，14日抗體合格率可達(dá)到26％以上，21日抗體合格率達(dá)到78％以上，28日抗體合格率可達(dá)到98％以上，60日，90日，120日抗體水平處于維持穩(wěn)定期，150日抗體水平開(kāi)始下降，180日抗體合格率仍能達(dá)到75％以上，210日抗體合格率可達(dá)到65％以上。

表11疫苗免疫后28日、180日、210日攻毒保護(hù)率

免疫后28日、180日、210日后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，疫苗免疫后28日、180日免疫后各型攻毒保護(hù)百分率均不低于80％，210日免疫后各型攻毒保護(hù)百分率均達(dá)到70％。

根據(jù)7個(gè)月攻毒保護(hù)率和測(cè)定的抗體效價(jià)結(jié)果分析，重組口蹄疫o型、a型二價(jià)滅活疫苗的免疫保護(hù)力良好，且免疫持續(xù)期提升至6個(gè)月，大幅度提升了口蹄疫o型和a型疫苗的免疫效力。

以上所述的實(shí)施例僅表述了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可做出其它改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

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