本發(fā)明屬于醫(yī)藥化工領(lǐng)域，具體涉及一種化合物3-去氧蘇木查爾酮的抗腫瘤活性，其可用于制備預(yù)防和治療結(jié)直腸癌藥物、以及靶向結(jié)直腸癌中具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的topk蛋白的藥物開發(fā)等。

背景技術(shù)：

結(jié)直腸癌是消化道惡性腫瘤之一，也是胃腸道腫瘤中僅次于食管癌的第二大惡性腫瘤，結(jié)直腸癌在以手術(shù)為主聯(lián)合化療、放療的綜合治療策略下，療效有一定的進(jìn)步。但是由于化療失敗導(dǎo)致的結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的惡性進(jìn)展依然是臨床亟待解決的關(guān)鍵問題。

topk是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的絲氨酸，蘇氨酸蛋白激酶，是一個(gè)重要的信號(hào)分子。在生理情況下，topk僅表達(dá)于睪丸和胸腺中，與機(jī)體生殖細(xì)胞的成熟和免疫細(xì)胞激活有關(guān)。近年來研究顯示：topk在多種惡性腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，不僅調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的有絲分裂和細(xì)胞周期，并且參與了腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡過程。關(guān)于topk與腫瘤關(guān)系的研究正日益被人們關(guān)注，其特異性阻斷劑也已被應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究中。而本發(fā)明意在通過3-dsc能夠明顯靶向topk，繼而通過其結(jié)構(gòu)類似物得到更多的靶向topk的抑制劑，為臨床治療結(jié)腸癌的藥物提供更多的選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種化合物3-去氧蘇木查爾酮的抗腫瘤活性，其在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。

我國不僅擁有著豐富的中草藥資源，而且中醫(yī)藥在近年來已經(jīng)以其副作用小，療效獨(dú)特的優(yōu)勢開始踏入世界醫(yī)藥舞臺(tái)，在我國的腫瘤防治方面更是發(fā)揮著重要的作用。而3-去氧蘇木查爾酮，即是從我國傳統(tǒng)中藥材蘇木（caesalpiniasappanl.）中分離得到的天然化合物。前期研究表明：3-去氧蘇木查爾酮（簡稱3-dsc，結(jié)構(gòu)式如下所示，分子式：c16h14o4，分子量：270.3，cas號(hào)為112408-67-0）具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗補(bǔ)體作用等；

。

本發(fā)明中，著重研究了3-去氧蘇木查爾酮在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。3-去氧蘇木查爾酮為天然化合物，在驗(yàn)證其是否具有抑制腫瘤增殖的實(shí)驗(yàn)中要求其純度需≥95％以上。

具體的，可以是3-去氧蘇木查爾酮在制備預(yù)防和治療結(jié)直腸癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：結(jié)合在正常結(jié)直腸細(xì)胞系中的毒性篩選，確定3-去氧蘇木查爾酮的安全濃度為2.5μm－20μm，并發(fā)現(xiàn)在該濃度范圍下，該化合物可以明顯抑制結(jié)腸癌不同細(xì)胞系的增殖、以及能夠明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞克隆的形成數(shù)量及大小。此外，3-去氧蘇木查爾酮可以明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并阻斷g2/m期致使細(xì)胞周期停滯。

3-去氧蘇木查爾酮可用于靶向結(jié)直腸癌中具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的topk蛋白藥物的開發(fā)。

本發(fā)明中明確topk在結(jié)腸癌細(xì)胞系中有高表達(dá)，并篩選出可以高表達(dá)的四個(gè)細(xì)胞系（hct-15、hct-116、sw620及dld1）。還發(fā)現(xiàn)了3-dsc是靶向結(jié)直腸癌中的具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的topk蛋白的天然化合物。在3-dsc結(jié)構(gòu)上進(jìn)行改造并在適宜條件下合成的衍生物也具有抗腫瘤的作用。

本發(fā)明中的靶點(diǎn)為topk蛋白，topk是近年來才作為治療結(jié)腸癌患者發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的蛋白，對于該蛋白的功能研究已經(jīng)有學(xué)者報(bào)道過，但是對于將該蛋白作為靶點(diǎn)治療結(jié)腸癌患者的藥物還沒有報(bào)道過，即使有文獻(xiàn)報(bào)道的hi-topk-032可以有效抑制結(jié)腸癌中該蛋白的表達(dá)，并且作為許多學(xué)者進(jìn)行研究的陽性對照，該抑制劑也沒有應(yīng)用于臨床治療。因此，本發(fā)明欲通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明該天然化合物3-去氧蘇木查爾酮可以有效抑制結(jié)腸癌腫瘤的生長并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而最終實(shí)現(xiàn)該化合物可以用于結(jié)直腸癌患者的臨床治療。

本發(fā)明通過激酶實(shí)驗(yàn)篩選得到的3-去氧蘇木查爾酮及其ic50值，并證明具有明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用。根據(jù)在正常結(jié)腸細(xì)胞中的毒性實(shí)驗(yàn)表明：該化合物3-dsc在20μm時(shí)沒有毒性作用，在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的抑制作用可以明確在該濃度條件下，可以有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。此外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)3-去氧蘇木查爾酮在g2/m期阻斷細(xì)胞周期的進(jìn)行；并可以顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

附圖說明

圖1為通過激酶方法得到靶向topk的化合物，即本發(fā)明中的化合物3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）；

圖2為3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）在正常結(jié)腸細(xì)胞中的毒性作用；

圖3為3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中的抑制作用；

圖4為3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）抑制結(jié)腸癌細(xì)胞克隆的形成。其中，隨著化合物濃度的增加，克隆數(shù)顯著降低，并且克隆明顯變小。圖為對加藥以及對照組克隆數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；

圖5為3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯，在安全范圍內(nèi)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞在g2/m期阻滯。結(jié)果采用流式測定法對不同濃度3-dsc誘導(dǎo)的g2/m期細(xì)胞的阻滯從而表現(xiàn)出g2/m期細(xì)胞增多；

圖6為3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）具有明顯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用；

圖7為3-dsc可以有效與topk結(jié)合并抑制其磷酸化的水平；

圖8為3-dsc可與atp競爭性結(jié)合topk激酶位點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。

本發(fā)明首先通過激酶篩選實(shí)驗(yàn)得到3-去氧蘇木查爾酮（3-dsc）能夠有效靶向topk。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（mtt，非錨定性生長實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞周期與凋亡）的研究；藥物靶向蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究；藥物與atp的競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究；激酶實(shí)驗(yàn)研究；以及藥物靶向topk的信號(hào)通路和凋亡的研究包括該天然化合物在不同時(shí)間點(diǎn)對信號(hào)通路的研究等，最后應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

材料與方法

1材料。

1.1結(jié)腸癌細(xì)胞系

本發(fā)明中使用的結(jié)腸癌細(xì)胞系均來自于atcc（包括人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞ccd841con、人結(jié)腸癌細(xì)胞hct-15、hct-116、sw620、sw480、dld1和ht-29）。

1.2試劑

prim-1640培養(yǎng)基（bi公司），mccoy’s5a培養(yǎng)基（bi公司），fbs胎牛血清（bi公司），雙抗（solarbio），胰酶（solarbio），噻唑藍(lán)（mtt,sigma公司），二甲基亞砜（dmso，上海市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；pbs。

1.3耗材及儀器

1.3.1海爾醫(yī)用低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司），分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），thermo超凈工作臺(tái)，水套式co2細(xì)胞培養(yǎng)箱（thermo），酶標(biāo)儀，流式細(xì)胞分析儀（bd公司）

1.3.2移液槍，移液管（規(guī)格分別為5ml/10、ml/25ml），6孔板，96孔板。

1.4實(shí)驗(yàn)方法。

1.4.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究：

將已篩選的能夠大量表達(dá)topk的結(jié)腸癌細(xì)胞種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為1000個(gè)，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過24小時(shí)，細(xì)胞貼壁后，給予3-去氧蘇木查爾酮進(jìn)行處理，然后分別于0h、24h、48h以及72h后加入20μl噻唑藍(lán)（mtt）隨即放入37℃，5%co2培養(yǎng)箱中孵育1個(gè)小時(shí)，取出后將96孔板內(nèi)的液體棄掉，加入100μl二甲基亞砜（dmso），利用酶標(biāo)儀在波長為570nm和620nm下檢測細(xì)胞增殖情況。

1.4.2非錨定性實(shí)驗(yàn)研究：

非錨定生長是腫瘤細(xì)胞生長的重要特性之一；發(fā)明人在不同濃度下察看化合物對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長的抑制作用（下層膠為0.6%agar加入相應(yīng)濃度的3-dsc，上層膠為0.3%agar加入相應(yīng)濃度的3-dsc），并在兩周或者三周進(jìn)行拍照，然后計(jì)算抑制效率。

1.4.3細(xì)胞周期與凋亡：

將篩選到的敏感結(jié)直腸癌細(xì)胞以2×10⁵個(gè)接種到直徑為60mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，然后放入到37℃，5%co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)組待細(xì)胞貼壁24h后，加入不含血清（胎牛血清）和雙抗（青鏈霉素混合液）的rpmi1640培養(yǎng)基，饑餓24小時(shí)，然后換成含有血清和雙抗的rpmi1640培養(yǎng)基，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48h。然后經(jīng)過收集，70%乙醇固定染色后，用流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞周期阻滯情況；細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)組，待細(xì)胞貼壁24h后，換不含血清和抗生素的培養(yǎng)基饑餓24小時(shí)，然后給予不同濃度（0μm、5μm、10μm、20μm）的化合物治療，72h后收集細(xì)胞，檢測并分析細(xì)胞凋亡結(jié)果。

1.4.43-dsc與topk激酶的結(jié)合及抑制實(shí)驗(yàn)：

取激酶反應(yīng)液60μl及topk激酶8μl混合后，分裝于0.5ml的ep管中，每管17μl混合液，然后于每管中加不同濃度的的化合物3-去氧蘇木查爾酮（0μm、5μm、10μm、20μm）1μl，同時(shí)設(shè)對照組（即只含有激酶反應(yīng)液的對照組），于室溫條件下反應(yīng)10min；再將含有atp和激酶底物的混合液（25μl的atp與10μl的激酶底物）加入到先前的反應(yīng)液中混合，每管7μl，于30℃的金屬浴中反應(yīng)30min；然后取出后每管加入5μl的緩沖液（溴酚藍(lán)），于95℃的金屬浴中反應(yīng)5min；取出后，在固定電壓為90v的條件下進(jìn)行蛋白泳動(dòng)，再于電壓為70v的條件下將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)通過對絲-蘇氨酸磷酸化抗體檢測底物磷酸化水平進(jìn)而檢測底物蛋白與激酶的含量水平。

1.4.5收集結(jié)直腸癌敏感細(xì)胞，并通過裂解，bca檢測獲得已知濃度的細(xì)胞裂解液。利用瓊脂糖4b結(jié)合實(shí)驗(yàn)在蛋白質(zhì)印跡技術(shù)下檢測該化合物與激酶的結(jié)合效果，孵育相應(yīng)的抗體檢測；同時(shí)，利用化合物與4b瓊脂糖微球偶聯(lián)共聚體，再于不同濃度的atp（0μm、10μm、100μm、1000μm）進(jìn)行結(jié)合，然后在固定電壓為90v的條件下進(jìn)行蛋白泳動(dòng)，再于電壓為70v的條件下將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，利用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測化合物與atp競爭性結(jié)合效果。

1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本發(fā)明首先通過激酶方法篩選得到的化合物3-去氧蘇木查爾酮3-dsc及其ic50值（見圖1），從而判斷該化合物可以有效靶向topk（ic50值小，說明效果較好）。

topk在許多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，本發(fā)明選取了結(jié)腸癌細(xì)胞系，因此首先對正常結(jié)腸細(xì)胞系ccd8841con進(jìn)行毒性篩選，結(jié)果見圖2。圖2表明該化合物在20μm時(shí)沒有毒性。

本發(fā)明同時(shí)考察了在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中3-dsc對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用（給藥處理24、48和72小時(shí)，測定細(xì)胞生長情況，三次獨(dú)立試驗(yàn)）結(jié)果見圖3。

在非錨定性實(shí)驗(yàn)研究中，考察了3-dsc對癌細(xì)胞形成的克隆及大小的抑制作用，結(jié)果（見圖4）發(fā)現(xiàn)，在濃度為20μm時(shí)，3-dsc可有明顯抑制克隆的形成或減小克隆形成的面積。

本發(fā)明考察了3-dsc對細(xì)胞周期的影響，結(jié)果（見圖5）顯示3-dsc誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在g2/m期。

本發(fā)明考察了3-dsc對細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果（見圖6）顯示3-dsc可以明顯誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。

本發(fā)明考察了3-dsc與topk結(jié)合及對激酶的抑制作用。結(jié)果（見圖7）再次顯示該化合物靶向topk，使其底物發(fā)生磷酸化。

本發(fā)明也考察了3-dsc與atp競爭性結(jié)合topk激酶位點(diǎn)的關(guān)系。結(jié)果（見圖8）顯示3-dsc在結(jié)合topk位點(diǎn)時(shí)與atp成競爭關(guān)系，再次說明3-dsc可以抑制該激酶的磷酸化活性。

綜上，通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了3-dsc在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的抑制效果，尤其在topk高表達(dá)的hct-15、hct-116、sw620和dld1四個(gè)細(xì)胞系中。本發(fā)明首先通過激酶篩選實(shí)驗(yàn)得到靶向topk的3-dsc化合物及其ic50值，然后在結(jié)腸的正常細(xì)胞中進(jìn)行毒性的篩選，從而確定給藥的安全濃度；再在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中給予化合物3-dsc處理，并在處理后的0h、24h、48h以及72h檢測細(xì)胞的增殖情況，在確定該化合物3-dsc對結(jié)直腸癌細(xì)胞系有抑制作用情況下，并且發(fā)現(xiàn)在相同濃度下驗(yàn)證細(xì)胞的非錨定性生長狀況也受到抑制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期在g2/m期受到阻滯、并可以明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。從而顯示了該化合物對結(jié)腸癌細(xì)胞有顯著抑制作用。為臨床研究預(yù)防和治療結(jié)直腸癌藥物提供幫助。