本發(fā)明涉及一種基于表面修飾的金納米棒作為基因載體并且應用于癌癥高效的基因-光熱協(xié)同治療，屬于生物醫(yī)藥材料以及納米醫(yī)學領域。

背景技術：

rna干擾(rnai)是利用特異性基因序列在轉(zhuǎn)錄后能導致基因沉默，在癌癥治療方面有很大的潛力。然而，雖然小干擾rna(sirna)技術已經(jīng)成為一種有效的治療方案，但是由于sirna磷酸酯骨架陰離子電荷和分子量較大，導致sirna的遞送受限，在系統(tǒng)給藥后得到較差的藥代動力學和較低的細胞內(nèi)化率。所以，至今在臨床上仍沒有成功地用于腫瘤治療的sirna制劑。雖然很多基于陽離子聚合物，陰離子脂質(zhì)或氨基酸的sirna遞送載體能有效的攜帶陰離子rnais達到對腫瘤治療的效果，但是這些強陽離子載體的嚴重毒副作用限制其體內(nèi)應用。為了克服這些障礙，如何不用強陽離子衍生物來研發(fā)高效的sirna遞送載體對研究人員來講仍是一個挑戰(zhàn)。

由于二甲基吡啶胺金屬有機復合物和磷酸基團的陰離子之間有特異性相互作用，使得其對含磷酸的分子(如治療基因)有高親和力，所以很多的二甲基吡啶胺金屬有機復合物被用于檢測生物上重要的磷酸衍生物。二甲基吡啶胺金屬有機復合物的納米體系與傳統(tǒng)的基因遞送載體相比，陽離子明顯減少，因此，其在充當無毒且高效的治療診斷基因載體方面，有很大的發(fā)展?jié)摿ΑＨ欢?，二甲基吡啶胺金屬有機復合物在sirna遞送領域的應用有待深入研究，尤其是基因釋放行為方面效率有待進一步優(yōu)化提高。

表面包裹一層有機或生物分子層的多功能金納米棒是具有吸引力的遞送sirna的納米載體。由于其可調(diào)節(jié)的尺寸，單分散性，低毒，獨特的尺寸，可調(diào)的表面功能以及光聲斷層掃描的能力,這些納米材料在藥物遞送方面有很大前景。由于金納米棒的強等離子共振峰，當近紅外光與等離子體共振波長匹配的時候，金納米棒可通過電子-聲子碰撞有效的將光能轉(zhuǎn)化成表面局部熱能，也即光熱轉(zhuǎn)化。熱從金納米棒表面?zhèn)鞯街車募毎h(huán)境，在幾納米的距離內(nèi)呈指數(shù)衰減，因此可減少對正常細胞的損壞效應。所以，在對靶向腫瘤細胞或組織進行光熱治療時，這些特性可減少對健康細胞的損傷，同時還能與治療基因聯(lián)合進行協(xié)同治療，增強了抗腫瘤效果。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于提供一種多聚核苷酸和金納米棒的納米復合物；

本發(fā)明的另一目的在于提供一種表面用硫辛酸修飾的多聚核苷酸載體化合物功能化的金納米棒的制備方法；

本發(fā)明的再一目的是在于多聚核苷酸和金納米棒的納米復合物應用于癌癥的基因-光熱協(xié)同治療的方法。

本發(fā)明的目的可以通過如下技術方案實現(xiàn)：

一種多聚核苷酸和金納米棒的納米復合物，其特征為納米復合物包括金納米棒、多聚核苷酸和連接它們的有機分子。

其中，所述的金納米棒包括普通金納米棒或者摻雜其他金屬的金納米棒中的一種，本發(fā)明選擇了普通金納米棒。

其中，所述的有機分子為硫辛酸修飾的多聚核苷酸載體化合物。

其中，所述的多聚核苷酸為odn，dna，mirna或者sirna中的至少一種，本發(fā)明中優(yōu)選sirna。

本發(fā)明中的多聚核苷酸和金納米棒的納米復合物制備方法，包括以下步驟：

1)硫辛酸修飾、可復合sirna的載體的制備。以5-羥基間苯二甲酸，二甲基吡啶胺、(±)-α-硫辛酸等無原料，通過多步有機合成手段，合成了可與金納米棒配體交換的化合物。

2)表面修飾ctab的金納米棒和硫辛酸修飾的多聚核苷酸載體通過配體交換反應，合成出了二甲基吡啶胺修飾的金納米棒(zd-gnrs)。將2ml硫辛酸修飾的二甲基吡啶胺(溶于乙醇)緩慢加到10ml的gnrs膠體(金納米棒膠體，2nm)中，在室溫下攪拌12h，得到的二甲基吡啶胺-gnr溶液在6000rpm的轉(zhuǎn)速下離心三次，每次15min，以除去未反應的硫辛酸修飾的dpa。之后，將zd-gnrs分散到2ml的蒸餾水中。

3)通過金屬有機絡合技術來制備sirna/zd-gnrs。首先，將硝酸鋅(5ml,3mg/ml,10.1mm)與二甲基吡啶胺-gnrs混合(5ml,2mg/ml)，混合物在室溫下攪拌30min。然后，離心3次(轉(zhuǎn)速為5000rpm)，以除去未反應的原料，之后將得到的zd-gnr分散到超純水中。將2ulzd-gnr溶液與1ulsirna(熒火蟲熒光素酶sirna(siluc)或plk1sirna(siplk))混合均勻，置于室溫30min，收集sirna/zd-gnrs，用于體外和體內(nèi)實驗。

本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明sirna和金納米棒的納米復合物中,sirna展示了較好的基因沉默活性，金納米棒展示了較好的光熱活性。

2.本發(fā)明中表面修飾的金納米棒和sirna的強配位絡合作用使得納米復合物具有高度穩(wěn)定性。

3.本發(fā)明中對腫瘤進行基因/光熱協(xié)同治療比單獨的基因療法和光熱治療效果要優(yōu)越很多。

4.本發(fā)明中由于gnrs的光聲性能，sirna/zd-gnrs能夠成為對腫瘤同時進行光聲成像和治療的治療診斷試劑。

附圖說明

圖1硫辛酸修飾的多聚核苷酸載體化合物的制備流程。

圖2sirna/zd-gnrs的表征。上排分別為gnrs，zd-gnrs和sirna/gnrs的tem。下排為sirna和zd-gnrs結合的電泳阻滯分析：(泳道1-5：sirna/zd-gnrs摩爾比為600，300，200，100，50的絡合)。

圖3siluc/lipomax或siluc/zd-gnrs孵育之后的143b-fluc腫瘤細胞螢火蟲熒光素酶(fluc)基因表達的抑制的生物發(fā)光分析。

圖4sirna/zd-gnrs對pc-3細胞株的體外基因/光熱協(xié)同治療。分別在有無0.5w/cm²功率的808nm激光照射下，1天(a)和2天(b)體外孵育的生理鹽水，zd-gnrs和siplk/zd-gnrs對前列腺癌細胞的毒性

圖5sirna/zd-gnrs對pc-3荷瘤小鼠的基因/光熱協(xié)同治療。用鹽水，zd-gnrs和sirna/zd-gnrs處理荷瘤小鼠，并激光照射10min后，其紅外圖像(a)和腫瘤區(qū)域的溫度變化(b)。(c)不同治療下的腫瘤體積變化。(d)處理23天之后的pc-3荷瘤小鼠的代表性圖片。

具體實施方式

以下通過具體的制備例和實施例可使本發(fā)明得到更清楚地說明：

一、制備例

1)硫辛酸修飾的多聚核苷酸載體化合物的合成

室溫下，將催化量的濃硫酸(1.0ml)滴加入化合物1(18.2g，0.1mol)的乙醇(100ml)溶液中，然后回流攪拌反應過夜。冷卻到室溫，減壓蒸餾蒸干，得21.2克化合物2，收率：89％。

氮氣保護，冰鹽浴下，將化合物2(21.2g，0.089mol)的無水四氫呋喃(80ml)溶液緩慢滴加入lialh4(10.1g，0.267mol)的無水四氫呋喃(50ml)懸濁液中，溫度維持在0℃左右。滴加完后，維持在0℃攪拌反應30分鐘，然后回到室溫，攪拌反應5小時。冰鹽浴下冷卻，緩慢滴加冰水(100ml),溫度維持在0℃以下，然后再緩慢滴加1n的鹽酸至ph值到3，過濾，固體用四氫呋喃(20ml*3)洗滌，減壓蒸餾濾液，除去四氫呋喃，水層用二氯甲烷(100ml*3)萃取，收集有機層，經(jīng)飽和食鹽水(100ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸餾得11.7克化合物3，收率：85％。

室溫下，將n-boc-4-溴-1-丁胺(23.0g，0.091mol)和碳酸鉀(21.0g，0.152mol)加入化合物3(11.7g，0.076mol)的乙腈(110ml)溶液中，回流攪拌過夜，減壓蒸餾干，加水(50ml)，然后用1n的鹽酸調(diào)節(jié)ph值到6，二氯甲烷(100ml*3)萃取，有機相用飽和食鹽水(100ml*2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸餾得26.4克化合物4，收率：89％。

室溫下，將四溴化碳(64.5g，0.194mol)和三苯基磷(42.5g，0.162mol)加入化合物4(26.4g，0.081mol)的二氯甲烷(300ml)溶液中，室溫攪拌反應過夜。然后，用1n氫氧化鈉(300ml)淬滅反應。分液，水相用二氯甲烷(200ml*2)萃取，有機相用飽和食鹽水(300ml*2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮蒸干，粗品經(jīng)硅膠柱層析(乙酸乙酯：石油醚＝3：1)分離得26.3克化合物5，收率：72％。

室溫下，將二甲基吡啶胺(25.6g，0.128mol)和碳酸鉀(24.0g，0.174mol)加入化合物5(26.3g，0.058mol)的dmf(100ml)溶液中，60℃下，攪拌反應5小時，減壓蒸餾得粗品，先后用冰水(200ml)和乙醚(200ml)洗滌后，真空干燥得33.1克化合物6，收率：83％。

冰浴下，將三氟乙酸(50ml)滴加入化合物6(33.1g，0.048mol)的二氯甲烷(50ml)溶液中，滴加完后，室溫攪拌反應過夜，減壓蒸餾，乙醚(100*3)洗滌，干燥得脫boc固體。

冰浴下，將edci(12.0g，0.063mol)、hobt(9.7g，0.072mol)和三乙胺(9.7g，0.096mol)加入(±)-α-硫辛酸(9.9g，0.048mol)的二氯甲烷(100ml)溶液中，加完后，室溫攪拌反應30分鐘，然后將上面的脫boc固體加入溶液中，攪拌反應過夜，加入飽和碳酸氫鈉(100ml)，分液，水相用二氯甲烷(100ml*3)萃取，有機相合并，先后用飽和碳酸氫鈉(100ml*3)、1n鹽酸(100ml*3)和飽和食鹽水(100ml*2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸干，用乙酸乙酯重結晶得29.8克化合物7(可與金納米棒配體交換的化合物)，收率：80％。

2)本發(fā)明中，螢火蟲熒光素酶s

sirna(siluc)的序列為5′-gcacucugauugacaaa-uacgauuu-3′(正義鏈)和5′-aaaucguauuugucaaucagagugc-3′(反義鏈)，陰性對照的sirna(sinc)序列為5’-aauucuccgaacgugucacgu-3′(正義鏈)和5′-acgugacacguucggagaauu-3′(反義鏈)，和靶向plk1mrna的sirna(siplk)序列為5′-ugaagaagaucacccuccuuadtdt-3′(正義鏈)和5′-uaaggagggugaucufucufucfadtdt-3′(反義鏈)。

3)如圖1所示，合成硫辛酸修飾的多聚核苷酸載體化合物。如圖2a所示，表面修飾十六烷基三甲基溴化銨的金納米棒和硫辛酸修飾的多聚核苷酸載體化合物通過配體交換反應，合成出了二甲基吡啶胺修飾的金納米棒(zd-gnrs)。將2ml硫辛酸修飾的二甲基吡啶胺(溶于乙醇)緩慢加到10ml的gnrs膠體(2nm)中，在室溫下攪拌12h，得到的zd-gnrs溶液在6000rpm的轉(zhuǎn)速下離心三次，每次15min，以除去未反應的硫辛酸修飾的二甲基吡啶胺。之后，將二甲基吡啶胺-gnr分散到2ml的蒸餾水中。

4)如圖2a所示,通過金屬有機絡合技術來制備sirna/zd-gnrs。首先，將硝酸鋅(5ml,3mg/ml,10.1mm)與二甲基吡啶胺-gnrs混合(5ml,2mg/ml)，混合物在室溫下攪拌30min。然后，離心3次(轉(zhuǎn)速為5000rpm)，以除去未反應的原料，之后將得到的zd-gnr分散到超純水中。將2ulzd-gnr溶液與1ulsirna(熒火蟲熒光素酶sirna(siluc)或plk1sirna(siplk))混合均勻，置于室溫30min，收集sirna/zd-gnrs，用于體外和體內(nèi)實驗。

5)通過瓊脂糖凝膠電泳來對sirna/zd-gnrs進行評估。將瓊脂糖(2％)加入到含有0.5ug/ml溴化乙錠和2mm鋅離子的tris-乙酸-edta緩沖溶液中，制得凝膠。20ul含1ugsirna的復合物溶液在含有溴化乙錠和tris-乙酸-edta(tae)電泳緩沖液的2％(w/v)瓊脂糖凝膠中電泳(100v,30min)。隨后用las-3000凝膠成像系統(tǒng)(日本，富士生命科學)成像。為了評估sirna的釋放，將sirna/zd-gnrs用0.1m的磷酸鈉處理30min，之后對釋放的sirna進行成像。

6)sirna/zd-gnrs在細胞內(nèi)的基因沉默效應。穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶報告基因的143b細胞在含10％的胎牛血清mem培養(yǎng)基培養(yǎng)。將143b細胞接種到96孔板中，用siluc/zd-gnrs(8μl；sirna＝10pmol)和92μl細胞培養(yǎng)基(mem,10％fbs)進行孵育24h。陽性對照(siluc/lipomax)和陰性對照(sinc/zd-gnrs或者sinc/lipomax)的平行實驗也同步進行。孵育24h后，用生物發(fā)光成像系統(tǒng)(xenogenivis-100)對細胞中的fluc進行成像。

7)前列腺癌細胞體外的基因/光熱協(xié)同治療。人類前列腺癌細胞(pc-3)以每孔5x10³個細胞的密度接種于96孔平底板，孵育1天。隨后，用pbs將細胞洗兩次，用不同濃度的siplk/zd-gnrs，zd-gnrs在37下孵育細胞24h或48h。再用pbs洗細胞，之后加入100ul新鮮的培養(yǎng)基。將細胞分別在有無0.5w/cm²功率的激光下照射5min，用標準的cck-8試驗來檢測腫瘤細胞的存活率。

8)體內(nèi)基因/光熱的協(xié)同治療。通過將1.0x10⁷pc-3細胞接種到無胸腺的c3h/hen裸鼠(20-25g,harlan,indianapolis,in)右后部位。當腫瘤的體積達到100-150mm³后，將鹽水(250μl)，鹽水(250μl)+激光照射，zd-gnrs(250μl)，zd-gnrs(250μl)+激光照射，siran/zd-gnrs(250μl；sirna1.5nmol)和sirna/zd-gnrs(250μl；sirna1.5nmol)+激光照射，通過靜脈注射給藥，每三天一次，一共給藥三次(每組4只老鼠)。給藥24h后，將pc-3腫瘤暴露在808nm激光(0.5w/cm²)下照射10min。記錄老鼠的體重，并通過axb²/2公式來計算腫瘤的體積(a和b分別是最大和最小的直徑)。

二、實施案例

1、如圖2所示，本發(fā)明中得到了均一的表面功能修飾的gnr。通過動態(tài)光散射可以看出，gnr與二甲基吡啶胺鋅絡合之后，其平均直徑有少量增加，從48.6±6.8到了51.13±5.2nm，在結合了sirna以后增加到84.1±8.6nm。并且，隨著一步步的修飾，表面電位減小，從66.2±3.4(gnr)到24.5±5.2mv(zd-gnr)，進一步到2.3±1.0mv(sirna/zd-gnr)。通過以熒火蟲熒光素酶基因的sirna(siluc)為模板sirna對sirna/zd-gnr進行了瓊脂糖凝膠阻滯試驗(圖2)。當sirna/zd-gnr的摩爾比達到了100，zd-gnr與sirna完全結合形成納米復合物。另外對于siluc/zd-gnr復合物在添加磷酸鹽之后，sirna與zn/dpa的絡合被破壞。沒有鋅離子，二甲基吡啶胺-gnrs在任何濃度下都不能和sirna進行絡合。結果表明，sirna的磷酸分子與gnrs表面的二甲基吡啶胺鋅之間是有選擇性的強結合。

2、本發(fā)明中用siluc/zd-gnrs孵育的腫瘤細胞中基因沉默效果顯著(見圖3)。隨著sirna濃度的增加，143b腫瘤細胞fluc表達分別為84.55±5.32％,57.60±2.52％和15.77±0.55％(此時siluc/zd-gnrs的添加量分別為0.625，2.5，10pmol)。zd-gnrs通過二甲基吡啶胺鋅離子與sirna的磷酸陰離子之間的特異性相互作用來形成緊湊的復合物的方式來遞送sirna，使其被細胞攝取，并幫助逃離胞漿內(nèi)/溶酶體，最后釋放sirna分子到細胞質(zhì)，憑借其獨特的特異性序列基因?qū)崿F(xiàn)沉默效應。

3、本發(fā)明中進行了siplk/zd-gnrs的基因/光熱協(xié)同治療。用siplk/zd-gnrs,zd-gnrs和pbs分別孵育了pc-324h和48h。在洗了兩次且將更換了新鮮的培養(yǎng)基之后，分別在有無808激光照射下，通過細胞計數(shù)試劑盒(cck-8)對活細胞進行計數(shù)。如圖4a和4b所示，激光照射下的siplk/zd-gnrs對pc-3細胞的毒性明顯比激光照射下的zd-gnr和沒有激光照射的siplk/zd-gnrs要高。說明了siplk/zd-gnrs對pc-3具有較好的基因/光熱協(xié)同治療效果。

4、本發(fā)明中當腫瘤體積達到100mm³左右時，分別將zd-gnrs和sirna/zd-gnrs以靜脈注射的方式進行給藥。給藥24h后，用0.5w/cm²的808nm激光照射腫瘤10min，同時用于體內(nèi)成像的紅外熱像儀監(jiān)測其溫度的變化。如圖5a,b所示，鹽水組沒有明顯的溫度變化。相反，用zd-gnrs和sirna/zd-gnrs處理的老鼠其腫瘤部位溫度上升了大約21℃。圖5c顯示了，對雄性裸鼠分別靜脈注射鹽水，zd-gnrs和siplk/zd-gnrs之后，在有無激光照射的情況下，其pc-3腫瘤體積變化。對照組(有無激光照射的鹽水組和無激光照射的zd-gnrs組)沒有顯示出對腫瘤生長明顯的抑制。無激光照射的sirna/zd-gnrs組和有激光照射的zd-gnrs組雖然顯示出了對腫瘤生長的抑制，但腫瘤體積并沒有減小。對比其他組，有激光照射的sirna/zd-gnrs組對腫瘤體積減小的作用最有效(見于圖5c,d)?？傊捎谙到y(tǒng)的基因沉默誘導凋亡和局部的光熱治療的協(xié)同，sirna/zd-gnrs有了很強的抗腫瘤性能。

在本發(fā)明中，我們通過合成硫辛酸修飾的二甲基吡啶胺，并且與金納米棒結合形成sirna/zd-gnrs復合物，在激光照射下，其對腫瘤進行基因/光熱協(xié)同治療。zd-gnrs作為sirna遞送載體，不僅與sirna絡合之后形成具有強基因沉默活性的穩(wěn)定納米顆粒，而且在激光照射下還具有gnrs的光熱性能。此外，siplk/zd-gnrs對腫瘤的基因/光熱協(xié)同治療也證明了比單獨的基因療法和光熱治療效果要更好。而且，由于gnrs的光聲性能，sirna/zd-gnrs可成為對腫瘤同時進行光聲成像和治療的治療診斷試劑。