本發(fā)明涉及一種預(yù)防或治療哮喘的方法，以及b7-dc突變體在制備用于預(yù)防和治療哮喘的藥物組合物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

哮喘是慢性小呼吸道疾病，其特點(diǎn)是呼吸道阻塞、哮鳴、呼吸道超反應(yīng)性以及同時(shí)具有炎癥。大多數(shù)該病是由暴露于過(guò)敏原如花粉、居家塵螨、動(dòng)物皮屑、真菌、霉菌、空氣刺激物或感染物而導(dǎo)致的。不同類型的免疫系統(tǒng)參與哮喘的發(fā)病機(jī)制，包括嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、t細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞。cd4+輔助性t細(xì)胞2亞群(th2)是哮喘發(fā)展中一類重要的成分。當(dāng)過(guò)敏原經(jīng)肺部氣道刺激免疫系統(tǒng)時(shí)，th2細(xì)胞產(chǎn)生高水平的il-5、il-3和il-4，它們隨后促進(jìn)肥大細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)敏原特異性ige以及氣道平滑肌調(diào)控因子。il-5可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞發(fā)育、活化并招募至肺部氣道。il-13參與氣道重塑以及氣道超反應(yīng)性(ahr)從而促成哮喘疾病。但是輔助性t細(xì)胞1亞群通常抑制th2介導(dǎo)的反應(yīng)，大量證據(jù)顯示th1/th2平衡對(duì)于哮喘的發(fā)展是至關(guān)重要的。th1可通過(guò)產(chǎn)生干擾素γ(ifn-γ)和il-12介導(dǎo)對(duì)th2反應(yīng)的抑制。

b7-dc(也稱為pd-l2,cd273)已被報(bào)道作為pd-1的配體，但其在t細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)中的功能尚不明確。雖然幾個(gè)研究表明b7-dc通過(guò)在t細(xì)胞上的pd-1結(jié)合而抑制t細(xì)胞反應(yīng)，但其他研究顯示b7-dc可共刺激t細(xì)胞反應(yīng)并增強(qiáng)免疫反應(yīng)。利用定點(diǎn)突變法獲得了b7-dc的一個(gè)突變體(k113s，第113位的亮氨酸被絲氨酸取代)，其喪失了與pd-1的結(jié)合能力，但保留了在刺激t細(xì)胞反應(yīng)方面的功能?；谶@些發(fā)現(xiàn)，推測(cè)b7-dc具有新的共刺激受體。

最近，b7-dc被發(fā)現(xiàn)能夠結(jié)合排斥導(dǎo)向分子家族成員b(rgmb，也稱dragon)。rgmb是一種連接有g(shù)pi的膜結(jié)合蛋白，其包含位于n端的50個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、位于c端的35個(gè)氨基酸的gpi連接信號(hào)、rgmn端結(jié)構(gòu)域、rgmc端結(jié)構(gòu)域、以及位于分子中間的vonwillebrand因子d型結(jié)構(gòu)域。rgmbmrna廣泛分布于脊髓、腦(中腦、后腦和前腦)、肝、腎、視神經(jīng)和生殖道。研究顯示，rgmb是bmp2/4(骨形成蛋白2和4，bmp2/4)的共受體，增強(qiáng)smad磷酸化反應(yīng)。rgmbmrna也存在于上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。正常的肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞也表達(dá)高水平的rgmbmrna。在最近的一項(xiàng)研究中，通過(guò)單克隆抗體(mab)阻斷rgmb/pd-l2相互作用會(huì)損害呼吸耐受力的發(fā)展。但是，rgmb在t細(xì)胞反應(yīng)方面對(duì)抗原的作用還不清楚。rgmb敲除(ko)小鼠在出生后約兩周內(nèi)死亡，主要是由于神經(jīng)發(fā)育的需求導(dǎo)致的。這導(dǎo)致無(wú)法使用該品系的小鼠作進(jìn)一步的b7-dc/rgmb功能研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)k113s(一種b7-dc變體)，其能夠選擇性地結(jié)合至rgmb，而不能結(jié)合pd-1。實(shí)驗(yàn)顯示，k113s引起rgmb共刺激cd4+t細(xì)胞增長(zhǎng)，其偏向于th1反應(yīng)，證據(jù)顯示在th1分化狀態(tài)下ifn-γ生成增加；并且初始t細(xì)胞在其細(xì)胞表面組成型地表達(dá)rgmb。在實(shí)驗(yàn)性哮喘模型中，k113s處理小鼠后，balf中ifn-γ生成增強(qiáng)，并且伴隨il-5和il-13生成受抑制。最終，我們的結(jié)果支持rgmb作為共刺激分子在cd4+th1反應(yīng)中的作用。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療對(duì)象的哮喘的方法。該方法包括向有需要的對(duì)象施用治療有效量的b7-dc突變體，該突變體的氨基酸序列如seqidno.1或2所示，或者該突變體的氨基酸序列與seqidno.1或2的序列具有至少80％的同一性并且具有k113s突變。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供上述b7-dc突變體在制備用于預(yù)防或治療對(duì)象的哮喘的藥物組合物中的用途。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述哮喘是th2介導(dǎo)的哮喘。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述施用是通過(guò)靜脈內(nèi)進(jìn)行的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述b7-dc突變體被包括在載體中，所述載體優(yōu)選是質(zhì)粒。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，b7-dc突變體與人iggfc片段融合，例如與人igg1fc片段融合。

本發(fā)明證實(shí)重組k113s蛋白能夠以類似于野生型b7-dc那樣的親和力與rgmb相互作用。更重要的是，k113s通過(guò)rgmb共刺激cd4+t細(xì)胞反應(yīng)，并且促進(jìn)th1極化。rgmb在初始小鼠t細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的表面表達(dá)。而且，k113s/rgmb共刺激在實(shí)驗(yàn)性小鼠模型中抑制th2介導(dǎo)的哮喘并且緩解小氣道炎癥以及肺部病變。

附圖說(shuō)明

圖1.b7-dc突變體與pd-1或rgmb的結(jié)合。(a)經(jīng)轉(zhuǎn)染以過(guò)表達(dá)小鼠pd-1的cho細(xì)胞系(pd-1+cho)以所示濃度的對(duì)照ig(flag-hig)、b7-dc-hig或其變體染色，隨后通過(guò)流式細(xì)胞儀分析。(b)經(jīng)轉(zhuǎn)染以過(guò)表達(dá)小鼠rgmb的293細(xì)胞系(rgmb+293t)以所示濃度的對(duì)照ig(flag-hig)、b7-dc-hig或其變體染色，隨后通過(guò)流式細(xì)胞儀分析。用于染色的二抗是鼠抗人iggfc-alexafluor647。所有數(shù)據(jù)為三次或更多次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表值。

圖2.b7-dc及其變體與rgmb的結(jié)合親和性。(a/b)小鼠rgmb以不同濃度(3.906-500nm)涂布于cm5生物傳感器芯片上，biacore分析b7-dc-hig(a)或k113s-hig(b)與小鼠rgmb相互作用的表面等離子體共振。(c/d)小鼠rgmb以不同濃度(0.1094-7μm)涂布于芯片上，biacore分析r56s-hig(c)或e71s-hig(d)與小鼠rgmb相互作用的表面等離子體共振。(e)rgmb在10μm時(shí)與i105a-hig、d111s-hig、r101s-hig和對(duì)照f(shuō)lag-hig相互作用的表面等離子體共振分析的反應(yīng)單位。(f)經(jīng)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)小鼠rgmb的293t細(xì)胞系以所示濃度的抗-mrgmb-生物素(二抗sa-apc)和1μgb7-dc-hig或k113s-hig(二抗為羊抗人fc-pe)染色，隨后通過(guò)流式細(xì)胞儀分析。所有數(shù)據(jù)為三次或更多次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表值。

圖3.rgmb和b7-dc在小鼠骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞上的表達(dá)。(a)通過(guò)特異性多克隆抗體(minneapolis,mn)經(jīng)流式細(xì)胞分析術(shù)分析在肺泡巨噬細(xì)胞(am)、腹膜巨噬細(xì)胞(pmф)、骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞(bmdc,未成熟dc,藍(lán)線和成熟dc，紅線)、巨噬細(xì)胞細(xì)胞系raw264.7和新鮮分離的脾嗜中性粒細(xì)胞(pmn)、t細(xì)胞、b細(xì)胞和nk細(xì)胞上的rgmb細(xì)胞表面表達(dá)。(b)通過(guò)流式細(xì)胞分析術(shù)分析在肺泡巨噬細(xì)胞(am)、腹膜巨噬細(xì)胞(pmф)、骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞(在成熟和未成熟dc中的bmdc，分別為藍(lán)線和紅線)以及巨噬細(xì)胞細(xì)胞系raw264.7上的rgmb細(xì)胞表面表達(dá)。所有數(shù)據(jù)為三次或更多次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表值。

圖4.k113s變體在ova誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中的作用。(a)ova-誘導(dǎo)哮喘的敏化和激發(fā)以及治療。在第0天和第5天腹腔內(nèi)(i.p.)注射接種balb/c小鼠10μgv級(jí)ova和1mg在pbs中的明礬凝膠。隨后，在第11-13天，吸入在pbs中的1％ova30分鐘以激發(fā)小鼠。在進(jìn)行第一次ova免疫之前的一天，經(jīng)尾靜脈在5-10秒內(nèi)靜脈(i.v.)注射在2mlpbs中的20ug/小鼠的質(zhì)粒(flag-hig和k113s-hig)。(b)用flag-hig和k113s-hig處理而誘導(dǎo)哮喘的小鼠中balf中總細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)。(c)flag-hig或k113s-hig處理的小鼠的balf中細(xì)胞經(jīng)diff-quick染液染色。(d)以flag-hig或k113s-hig處理的小鼠的肺部組織學(xué)。小鼠在第14天處死，處理肺部組織，用染色以顯示小氣道周?chē)募?xì)胞浸潤(rùn)。(e)氣道對(duì)乙酰甲膽堿激發(fā)的超反應(yīng)性。小鼠用flag-hig和k113s-hig處理，并測(cè)定氣道阻力和肺部penh。數(shù)據(jù)以均值±sem顯示并代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每組5只小鼠。ns，無(wú)明顯差異；＊:p<0.05；＊＊:p<0.01；＊＊＊:p<0.001。

圖5.k113s在cd4+t細(xì)胞共刺激以及th1/th2細(xì)胞因子生成方面的作用。(a/b)使用cfse標(biāo)記純化自首次接受試驗(yàn)的balb/c小鼠的cd4⁺t細(xì)胞，并且在th1分化條件下(il-210ng/ml、il-1210ng/ml、il-4抗體10μg/ml)，使用2.5μg/ml的cd3抗體和1μg/ml的可溶性cd28抗體，分別在存在(a)或不存在(b)預(yù)先包覆在平板上的pmф的情況下刺激該cd4⁺t細(xì)胞3天。通過(guò)流式細(xì)胞儀評(píng)估cfse稀釋液和ifn-γ胞內(nèi)染色。(c)使用流式細(xì)胞儀通過(guò)特異性mab分析ova誘導(dǎo)的哮喘期間經(jīng)flag-hig或k113s-hig處理后balf中cd4細(xì)胞的胞內(nèi)il-2、ifn-γ和il-4。哮喘誘導(dǎo)后第14天，用pma/離子霉素/布雷菲德菌素a刺激來(lái)自balf的細(xì)胞4-6h并收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析。(d/e)使用流式細(xì)胞儀通過(guò)特異性mab分析ova誘導(dǎo)的哮喘期間經(jīng)flag-hig或k113s-hig處理后balf中cd4細(xì)胞的胞內(nèi)il-5(d)和il-13(e)。所有數(shù)據(jù)為三次或更多次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表值。每組5只小鼠。ns，無(wú)明顯差異；＊:p<0.05。

圖6.流體力學(xué)注射后balf和血清中k113s-hig蛋白水平。(a)免疫后第14天balf中flag-hig和k113s-hig水平。(b)流體力學(xué)注射后在所示天數(shù)時(shí)血清中flag-hig和k113s-hig水平。數(shù)據(jù)以均值±sem顯示，樣品來(lái)自每組5只小鼠。數(shù)據(jù)為三次或更多次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表值。

圖7.k113s處理后balf中il-4的水平以及血清中ova特異性ige的水平。用flag-hig/k113s或hig處理的哮喘模型，(a)通過(guò)特異性elisa測(cè)定balf中il-4的水平，(b)分析血清中ova特異性ige。數(shù)據(jù)以均值±sem顯示并且代表3次獨(dú)立試驗(yàn)。ns，無(wú)明顯差異。每組5只小鼠。

具體實(shí)施方式

定義

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“治療”是指療法上的以及預(yù)防性的措施，其阻止或減緩對(duì)象發(fā)生不期望的生理學(xué)改變或病癥，例如哮喘發(fā)作。有利或期望的臨床效果包括，但不限于，癥狀的緩解、疾病程度的降低、疾病狀態(tài)的穩(wěn)定化(即不惡化)、疾病進(jìn)展的延遲或減緩、疾病狀態(tài)的減輕或緩和以及疾病的部分或全部治愈，不論上述效果是否可檢測(cè)到?！爸委煛币部芍概c不治療相比生存期延長(zhǎng)。需要治療的對(duì)象包括已患有該疾病或病癥的對(duì)象，以及有可能患有該疾病或病癥的對(duì)象，或要預(yù)防該疾病或病癥的對(duì)象。

“對(duì)象”或“患者”、“個(gè)體”是指任何期望進(jìn)行診斷、預(yù)后或治療的對(duì)象，特別是哺乳動(dòng)物對(duì)象。哺乳動(dòng)物包括人、家畜、農(nóng)畜、動(dòng)物園動(dòng)物、競(jìng)技動(dòng)物或?qū)櫸铮绻?、貓、幾?nèi)亞豬、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。本文所稱的對(duì)象優(yōu)選是人。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“有治療需要的患者”或“有治療需要的對(duì)象”包括因施用本發(fā)明用于例如檢測(cè)、診斷和/或治療用途的多肽或其組合物而受益的對(duì)象，如哺乳動(dòng)物對(duì)象。

方法和治療

本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種預(yù)防或治療對(duì)象的哮喘的方法，包括向有此需要的對(duì)象施用治療有效量的b7-dc突變體或包含b7-dc突變體的藥物組合物，所述突變體的氨基酸序列如seqidno.1或2所示，或者所述突變體的氨基酸序列與seqidno.1或2所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有k113s突變。本發(fā)明還提供上述b7-dc突變體在治療或緩解與哮喘有關(guān)的癥狀的方法中應(yīng)用。

在一些實(shí)施方式中，該b7-dc突變體或其藥物組合物以腸胃外方式給藥，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)皮或皮內(nèi)給藥。

在一些實(shí)施方式中，將本發(fā)明的b7-dc突變體與其他對(duì)治療哮喘有效的藥物聯(lián)合使用會(huì)是期望的。例如，可使用b7-dc突變體與其他例如市場(chǎng)上可購(gòu)買(mǎi)的β2受體激動(dòng)劑等哮喘治療劑一起來(lái)治療哮喘。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療哮喘的方法阻止了哮喘的進(jìn)展或由哮喘導(dǎo)致的疾病的發(fā)作。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種阻止哮喘的進(jìn)展和/或由哮喘導(dǎo)致的疾病的發(fā)作的方法，該方法包括向有此需要的對(duì)象施用有效量的b7-dc突變體。在一些實(shí)施方式中，這些治療哮喘的方法阻止了與哮喘有關(guān)的癥狀的發(fā)作、進(jìn)展和/或復(fù)發(fā)。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了預(yù)防與哮喘有關(guān)的癥狀的方法，該方法包括向有此需要的對(duì)象施用有效量的b7-dc突變體。

組合物

本發(fā)明的一個(gè)方面提供包含治療有效量的b7-dc突變體以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。該藥物組合物可用于預(yù)防或治療對(duì)象的哮喘。該b7-dc突變體可存在于合適的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑中。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“載體”包括任何或所有的溶劑、分散介質(zhì)、載體、包衣、稀釋劑、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑、吸附延緩劑、緩沖液、載體溶液、懸浮液、膠體等。這些用于藥物活性成分的介質(zhì)和試劑的使用在本領(lǐng)域是已知的。除非已知任何常規(guī)介質(zhì)或試劑不能與該活性成分配伍，否則本發(fā)明預(yù)期可在組合物中使用任何上述載體。

“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)施用至人體時(shí)不會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)或類似的不期望的反應(yīng)的分子和成分。本領(lǐng)域已知如何制備包含作為活性組分的蛋白的水性組合物。通常，這些組合物被制備成注射劑，例如液態(tài)溶液或懸浮液；也可以制備成適于在注射之前配制成溶液或懸浮液的固體形式。

實(shí)施例

材料和方法

小鼠：從中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)balb/c雌鼠并飼養(yǎng)于該中心的spf設(shè)備中。所有小鼠實(shí)驗(yàn)都根據(jù)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心指南進(jìn)行并經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

細(xì)胞系：表達(dá)鼠pd-1的cho細(xì)胞系培養(yǎng)于含1％fbs的hamf12培養(yǎng)基(gibco)中。293t細(xì)胞系(atcc)培養(yǎng)于含10％fbs的dmem(cellgro)中，并用lipofectamine3000和在pegfp-n3表達(dá)載體中的小鼠rgmbcdna轉(zhuǎn)染。rgmb的細(xì)胞表面表達(dá)經(jīng)rgmb抗體(minneapolis,mn)和egfp熒光染料染色確認(rèn)。

重組融合蛋白、抗體和細(xì)胞因子：編碼小鼠b7-dc-人igg1fc(b7-dc-hig)及其變體的質(zhì)粒在wang,s.,etal.molecularmodelingandfunctionalmappingofb7-h1andb7-dcuncouplecostimulatoryfunctionfrompd-1interaction.jexpmed197,1083-1091(2003)中已有描述。重組蛋白經(jīng)293t細(xì)胞轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生，并經(jīng)蛋白a親和柱(ge)純化。hlg抗體購(gòu)自jacksonimmunoresearch(westgrove,pa)，帶his標(biāo)簽的重組小鼠rgmb和抗鼠rgmb生物素購(gòu)自鏈霉親和素-pe購(gòu)自biolegend(sandiego,ca)?？筩d3e-pe、抗cd4-pe、抗cd8-pe、抗cd11c-pe、抗gr1-pe、抗b220-pe、抗cd49b-pe、抗f4/80-pe、抗mb7-dc-apc、抗il-2-fitc、抗ifn-γ-pe、抗il-4-apc單抗(mab)以及小鼠il-4,il-5,il-13elisa試劑盒購(gòu)自ebioscience(sandiego,ca)。fisherhealthcare^tmprotocol^tmhema3^tmfixativeandsolutions,injectalum及carboxyfluoresceinsuccinimidylester(cfse)染色液購(gòu)自thermoscientific(waltham,ma)。雞卵清蛋白v級(jí)(ova)和乙酰甲膽堿購(gòu)自sigma-aldrich(st.louis,mo)。抗ige-生物素、cytofix-cytopermgolgiplug試劑盒以及抗cd4-bv421購(gòu)自bd(franklinlakes,nj)。

表面等離子體共振(spr)分析：按之前描述在biacoret100儀器上分析鼠rgmb與b7-dc及其突變體的親和性(wang,s.,etal.molecularmodelingandfunctionalmappingofb7-h1andb7-dcuncouplecostimulatoryfunctionfrompd-1interaction.jexpmed197,1083-1091(2003))。簡(jiǎn)言之，帶his標(biāo)簽的rgmb以2000ru固定至cm5傳感器芯片(gehealthcare)上，并且以類似方式制備對(duì)照流動(dòng)細(xì)胞。在hepes緩沖液中按所述濃度稀釋純化的flag-hig、mb7-dc-hig和突變?nèi)诤系鞍?mb7-dc-hig及k113s-hig:3.9nm至500nm,r56s-hig及e71s-hig：109.4nm至7μm,i105a-hig、d111s-hig、r101s-hig和flag-hig:10μm)。蛋白以20μl/min的流速注射3min，將緩沖液在表面流動(dòng)5min以進(jìn)行脫離。使用biacoret100軟件分析數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)性哮喘小鼠模型：ova誘導(dǎo)小鼠哮喘模型之前已有描述。簡(jiǎn)言之，在第0天和第5天腹腔注射6-8周齡balb/c小鼠混合有4mg氫氧化鋁凝膠(injectalum,thermo)的10μgova蛋白(sigma-aldrich)。在第11至13天，使用噴霧器(yuwell402ai,江蘇，中國(guó))鼻內(nèi)給予小鼠1％在pbs中的ova。小鼠在第14天麻醉。收集下腔靜脈血液，制備血清用于ova特異性ige檢測(cè)。肺用氣管插管以0.5ml溫pbs灌洗三次，總共使用1mlpbs。支氣管肺泡灌洗液(balf)經(jīng)離心，收集上清用于細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)下文)。使用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器(beckmancoulter,sandiego,ca)對(duì)細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。肺固定于10％福爾馬林，組織切片經(jīng)h/e染色用于組織學(xué)評(píng)價(jià)。對(duì)于體內(nèi)流體動(dòng)力學(xué)質(zhì)粒注射，如文獻(xiàn)所述，經(jīng)尾靜脈在5至10秒內(nèi)注射20μg在2mlpbs中的對(duì)照f(shuō)lag-hig質(zhì)?；騥113s-hig質(zhì)粒。在所示時(shí)間點(diǎn)經(jīng)特異性?shī)A心elisa檢測(cè)流體動(dòng)力學(xué)注射后血清和balf中人igg蛋白水平(圖6)。

氣道超反應(yīng)性(ahr)實(shí)驗(yàn)：乙酰甲膽堿引起的ahr在最后一次1％ova激發(fā)后24h通過(guò)侵入性和非侵入性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。侵入性實(shí)驗(yàn)由finepointeresistanceandcompliancesystem(buxcoelectronics,ny)確定。簡(jiǎn)言之，麻醉小鼠并進(jìn)行氣管切開(kāi)術(shù)。給予乙酰甲膽堿(12.5,25mg/ml)后，噴霧pbs使其流入小鼠器官30秒。直接測(cè)定小鼠呼吸氣流和肺壓。氣道阻力(rl)被定義為驅(qū)動(dòng)呼吸的壓力除以氣流，用buxcofinepointe軟件計(jì)算。非侵入性實(shí)驗(yàn)使用用于wholebodyplethysmographysystem的finepointe來(lái)確定(buxcoelectronics,ny,其依賴于4個(gè)設(shè)計(jì)的腔室以連接至靈敏的壓力傳感器，從而測(cè)定壓力變化以及腔室內(nèi)的氣流，并將信息傳輸至buxcofinepointe軟件)。該軟件計(jì)算幾個(gè)氣流相關(guān)參數(shù)，包括呼吸速率、肺活量、峰值流速和時(shí)間間隔。軟件以“enhancedpause”(penh)形式輸出數(shù)據(jù)。penh＝(pep/pip)x((te-tr)/tr)。te，呼吸時(shí)間(s)；tr，休息時(shí)間(s)；pep，峰值呼氣壓力(ml/s)；pip，峰值吸氣壓力(ml/s)。小鼠逐個(gè)放入每個(gè)腔室中并讓其適應(yīng)幾分鐘以記錄腔室的基線。基線測(cè)量后，在主腔室中經(jīng)入口噴入增加濃度(0,3.125,6.25,12.5,25,50mg/ml)的乙酰甲膽堿pbs溶液1min。隨后，記錄氣道反應(yīng)5min。計(jì)算增加的濃度的每個(gè)組的penh。

體外th1極化試驗(yàn)：對(duì)于th1生成，使用2μmcfse(thermofisherscientific,ma)標(biāo)記cd4⁺t細(xì)胞，并且在存在10μg/ml抗il-4和10ng/mlil-12的情況下，用涂覆在板上的2.5μg/ml抗cd3抗體和5μg/ml的所示融合蛋白刺激3天。在最后6h，向培養(yǎng)基中加入10ng/ml12-豆蔻酸13-乙酸佛波酯(pma)、1μg/ml離子霉素和10μg/ml布雷菲德菌素a，細(xì)胞用抗cd4mab染色。使用cytofix/cytopermkit(bdbioscience,nj)固定和透化后，細(xì)胞用抗ifn-γ單抗染色并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。使用相似方法檢測(cè)balf中的ifn-γ、il-2和il-4陽(yáng)性細(xì)胞。balf中的細(xì)胞因子也使用elisa試劑盒(ebioscience,ca)按照說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

數(shù)據(jù)分析：本發(fā)明中每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少三次，動(dòng)物數(shù)量見(jiàn)附圖說(shuō)明。數(shù)據(jù)以均值±sem顯示，并使用雙尾studentt-檢驗(yàn)或方差分析(anova)檢驗(yàn)來(lái)確定顯著差異。＊:p<0.05，＊＊:p<0.01，＊＊＊:p<0.001。

結(jié)果

選擇性結(jié)合rgmb而不結(jié)合pd-1的b7-dck113s突變體的識(shí)別

我們之前在b7-dc與pd-1的結(jié)合域中進(jìn)行了突變而得到多個(gè)b7-dc突變體。k113s突變體，其113位的氨基酸賴氨酸被絲氨酸取代，它完全喪失了與pd-1的結(jié)合能力。我們發(fā)現(xiàn)，k113s在體外仍維持淋巴細(xì)胞的共刺激作用。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明b7-dc可經(jīng)由非pd-1的受體發(fā)揮其共刺激作用。為確定k113s是否與rgmb相互作用，我們制備了編碼一系列突變體的重組融合蛋白(r56s-hig,e71s-hig,r101s-hig,i105a-hig,d111s-hig,k113s-hig)并測(cè)試了它們與rgmb的結(jié)合能力。使用流式細(xì)胞術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)i105a、d111s、k113s突變體在所有所測(cè)試濃度下都不結(jié)合pd-1+cho細(xì)胞，而r56s、e71s和r101s突變體以及野生型b7-dc與pd-1明顯結(jié)合(圖1a)。令人感興趣的是，k113s-hig以類似于野生型b7-dc-hig的親和性結(jié)合rgmb+293t細(xì)胞(圖1b)，而r101s、i105a和d111s完全喪失了與rgmb的結(jié)合能力。r56s和e71s與rgmb在高蛋白濃度下顯得具有弱結(jié)合性。上述數(shù)據(jù)確認(rèn)了b7-dc與rgmb和pd-1都有相互作用，而作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)，k113s選擇性地結(jié)合rgmb，而不結(jié)合pd-1。

k113s以類似于野生型b7-dc的親和性結(jié)合rgmb

我們使用spr分析基于biacore儀器測(cè)定了k113s的結(jié)合親和性，并利用biacoret100軟件計(jì)算出親和力。k113s以類似于b7-dc的親和性以nm水平結(jié)合至rgmb(b7-dckd＝1.82e-07m,k113skd＝1.28e-07)(表1,圖2a,2b)；而r56s、e71s、i105a和d111s以μm水平結(jié)合rgmb(圖2c,2d和2e)，r101s以類似flag-hig對(duì)照的水平結(jié)合rgmb(圖2e)。

表1.b7-dc突變體的親和力測(cè)定

親和力(kd)基于biacoret100軟件由“ka”(結(jié)合)和“kd”(解離)計(jì)算得出。

為進(jìn)一步驗(yàn)證k113s和rgmb相互作用，我們測(cè)試了rmgb抗體與k113s和b7-dc競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合rgmb的能力。培養(yǎng)基中包含不同濃度的rgmb抗體(最高為625ng/ml)，用于通過(guò)流式細(xì)胞儀分析與1μg/ml的b7-dc或k113s融合蛋白結(jié)合rgmb+293t細(xì)胞的能力。與biocore分析的結(jié)果一致，在大多數(shù)所測(cè)試的濃度下，rgmb抗體與k113s-hig競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合rgmb+293t細(xì)胞的效率稍微低于與b7-dc-hig競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的效率(圖2f)。因此，第113位的氨基酸，雖然在pd-1結(jié)合中是至關(guān)重要的，但在與rgmb的相互作用中扮演不太重要的角色。我們的研究發(fā)現(xiàn)了無(wú)pd-1干擾的高度選擇性rgmb配體。

rgmb在鼠淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞上的組成型表達(dá)

使用rgmb抗體，我們分析了rgmb蛋白在不同免疫細(xì)胞上的蛋白表達(dá)。rgmb顯得在骨髓細(xì)胞上高水平地組成型表達(dá)，包括新鮮分離的肺泡巨噬細(xì)胞(ams)、腹膜巨噬細(xì)胞(pmфs)、骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞(bmdcs)和嗜中性粒細(xì)胞(pmns)及巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系raw264.7，在pmф上表達(dá)量最高(圖3a)。令人感興趣的是，rgmb也可在脾細(xì)胞的休眠期cd3⁺,cd4⁺,cd8⁺t細(xì)胞和b細(xì)胞的表面低水平表達(dá)，而nk細(xì)胞上是陰性的(圖3a)。但是，b7-dc的表達(dá)僅限于骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(bmdcs)，其在am和raw264.7上的表達(dá)水平很低(圖3b)，這與之前的結(jié)果類似。

結(jié)合rgmb抑制肺部感染和氣道過(guò)敏

利用k113s與rgmb的特異性結(jié)合，我們?cè)趏va誘導(dǎo)的哮喘模型中評(píng)價(jià)了rgmb的功能，該模型中，小鼠使用ova初免并在之后用ova強(qiáng)化(圖4a)。在該模型中，小鼠具有th2樣炎癥反應(yīng)，并伴隨嚴(yán)重的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫之前的一天，小鼠在高壓下靜脈注射(流體動(dòng)力學(xué)注射)k113s-hig質(zhì)粒以進(jìn)行質(zhì)粒表達(dá)，主要在肝臟中表達(dá)。如預(yù)期的一樣，balf中的總浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)量在ova強(qiáng)化后急劇增加。相反，k113s-hlg處理的小鼠的總細(xì)胞數(shù)量明顯降低(圖4b)。嗜酸性粒細(xì)胞(ova誘導(dǎo)的哮喘期間主要的細(xì)胞類型)數(shù)量也被k113s-hlg顯著抑制(圖4b和4c)。肺部的組織學(xué)分析顯示k113s-hig處理的小鼠與用對(duì)照質(zhì)粒處理的小鼠相比在小氣道周?chē)哂忻黠@較低的炎癥性浸潤(rùn)(圖4d)。

氣道過(guò)敏(ahr)通過(guò)肺部阻力(rl)和penh來(lái)評(píng)價(jià)，如材料和方法中所述，penh在該模型中作為氣道過(guò)敏性的指標(biāo)。用對(duì)照或k113s質(zhì)粒處理的小鼠之間的基線rl沒(méi)有明顯差異。但是，12.5mg/ml乙酰甲膽堿激發(fā)后，k113s-hig處理的小鼠的rl相對(duì)flag-hig處理的小鼠來(lái)說(shuō)降低(圖4e)。而且，k113s-hig處理的小鼠的penh顯著低于flag-hig處理的小鼠(圖4e)。這些結(jié)果表明，經(jīng)k113s-hig激發(fā)rgmb可抑制ova誘導(dǎo)的哮喘驗(yàn)證并且改善該實(shí)驗(yàn)性哮喘模型的肺功能。

k113s經(jīng)rgmb共刺激th1反應(yīng)

我們推測(cè)，k113s抑制哮喘炎癥的作用是由th1t細(xì)胞反應(yīng)的共刺激隨后抑制th2樣炎癥導(dǎo)致的。為驗(yàn)證該推測(cè)，我們首先測(cè)試了k113s在初始cd4⁺t細(xì)胞體外分化為th1期間刺激th1反應(yīng)的能力。在該系統(tǒng)中，純化的初始t細(xì)胞培養(yǎng)于th1極化條件(抗cd3+il-12/抗il-4)下3天；th1cd4+t細(xì)胞通過(guò)胞內(nèi)染色被識(shí)別為產(chǎn)ifn-γ細(xì)胞。在該培養(yǎng)系統(tǒng)中，還加入pmф以精確模仿體內(nèi)肺部環(huán)境。在存在k113s-hig的情況下，與對(duì)照ig相比，ifn-γ⁺t細(xì)胞明顯增加(圖5a-5b)。為確認(rèn)該發(fā)現(xiàn)，利用特異性elisa測(cè)定ova誘導(dǎo)哮喘的小鼠的balf中的細(xì)胞因子。k113s處理明顯降低了balfifn-γ水平，而il-2和il-4的變化可忽略(圖5c)。在ova誘導(dǎo)哮喘模型中，il-5和il-13在啟動(dòng)和維持氣道炎癥反應(yīng)中是必需的。因此，我們還在該模型中測(cè)定了balf中的這些細(xì)胞因子。k113s-hig質(zhì)粒處理的小鼠具有明顯降低的il-5和il-13，而il-4的生成不明顯(圖5d-e,圖7)。過(guò)敏原特異性ige在哮喘發(fā)病機(jī)制中也具有重要作用。但是，在我們的模型中，ova特異性ige在k113s處理小鼠和對(duì)照質(zhì)粒處理小鼠之間沒(méi)有差異(圖7)。我們的結(jié)果表明k113s結(jié)合rgmb選擇性地刺激產(chǎn)ifn-γth1t細(xì)胞，并且伴隨降低的il-5和il-13以抑制該模型的哮喘癥狀。

b7-dc在t細(xì)胞響應(yīng)中的作用一直都有爭(zhēng)議，因?yàn)樵诓煌w內(nèi)、體外試驗(yàn)中，共刺激作用和共抑制作用都有報(bào)道。除了與共抑制受體pd-1相互作用之外，b7-dc還結(jié)合排斥引導(dǎo)分子b(rgmb)。我們的發(fā)現(xiàn)為b7-dc研究上相互矛盾的數(shù)據(jù)提供了一種解釋。在初始階段，樹(shù)突狀細(xì)胞上的b7-dc可經(jīng)rgmb共刺激初始cd4+t細(xì)胞，有利于th1t細(xì)胞增殖和分化。當(dāng)共刺激和激活之后，t細(xì)胞被誘導(dǎo)而表達(dá)pd-1，當(dāng)其與b7-dc結(jié)合后，pd-1將抑制性信號(hào)傳送給t細(xì)胞。在樹(shù)突狀細(xì)胞組成型表達(dá)b7-dc的情形下，b7-dc的共刺激作用因其與pd-1結(jié)合而被快速弱化，這可提供一種安全性機(jī)制而防止t細(xì)胞的進(jìn)一步擴(kuò)展和過(guò)度活化。因此，b7-dc根據(jù)rgmb和pd-1受體的時(shí)間安排和水平而在t細(xì)胞反應(yīng)上顯示出不同的、甚至有時(shí)相反的作用。雖然還要測(cè)試人rgmb是否具有類似表達(dá)模式，并且更重要的是要測(cè)試人rgmb是否也因b7-dc的結(jié)合而被共刺激，但是我們的研究提供了研究這種可能性的基本依據(jù)。

雖然rgmb介導(dǎo)的共刺激作用的機(jī)制還不完全清楚，但是我們?cè)趏va誘導(dǎo)的哮喘模型中的發(fā)現(xiàn)表明，k113s可減弱哮喘反應(yīng)并且通過(guò)降低呼吸道炎癥和阻力而改善肺功能。balf中的總炎癥細(xì)胞數(shù)量和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量在k113s處理后都降低。而且，肺中小氣道周?chē)牟±韺W(xué)炎癥也通過(guò)這種處理而被減輕。雖然激發(fā)rgmb可能直接抑制th2反應(yīng)，包括il-5和il-13生成、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和哮喘進(jìn)展期間的氣道重塑；但是在balf中檢測(cè)到ifn-γ增加。這些發(fā)現(xiàn)支持th1反應(yīng)的共刺激作用。th1反應(yīng)在抑制th2介導(dǎo)的哮喘中的作用已有很多報(bào)道。因此，很可能的情況是，經(jīng)rgmb的共刺激作用改變了th1/th2的平衡，導(dǎo)致th2反應(yīng)的抑制。值得提到的是，rgmb的作用某種程度上來(lái)說(shuō)是獨(dú)特的，因而不能被認(rèn)為是典型的th1樣反應(yīng)。在我們的研究中，雖然ifn-γ生成明顯增加，但il-2(另一種重要的th1細(xì)胞因子)的水平變化很小。另一方面，如前所示，rgmb對(duì)th2樣反應(yīng)的抑制作用某種程度上來(lái)說(shuō)是部分的，主要抑制il-5和il-13，而不抑制il-4。此外，rgmb在ova特異性ige的抑制方面的作用也很微弱(圖5)。因此，rgmb在th1極化中的作用可能是獨(dú)特的且僅具有部分作用。

目前，還沒(méi)有rgmb的特異性激動(dòng)劑(無(wú)論是抗體或小分子)，而且rgmbko小鼠是致死性的，這限制了rgmb功能的進(jìn)一步探究。k113s對(duì)rgmb的選擇性結(jié)合而不結(jié)合pd-1，這代表了進(jìn)行這種研究的新的機(jī)會(huì)。這種激動(dòng)劑的開(kāi)發(fā)對(duì)于人類疾病(如哮喘)的潛在治療是有用的。

本發(fā)明雖然已針對(duì)具體實(shí)施方式做詳細(xì)的描述，但應(yīng)當(dāng)理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在所公開(kāi)的實(shí)施例的基礎(chǔ)上對(duì)本發(fā)明做出修改和改進(jìn)而不違背本發(fā)明的精神，而這些改進(jìn)和修改仍屬于本發(fā)明的范圍。

sequencelisting

<110>中山大學(xué)

<120>b7-dc突變體在治療哮喘中的應(yīng)用

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