本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及細(xì)錐香茶菜乙素的一種新用途，更具體涉及細(xì)錐香茶菜乙素在制備抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

食管鱗癌(esophagealsquamouscellcarcinoma，escc)是惡性程度非常高的癌癥，在亞洲有著很高的發(fā)病率，五年生存率只有15％-25％。雖然近年來癌癥診療技術(shù)有了長足進(jìn)步，但escc預(yù)后仍然很差?；熓峭砥趀scc患者的主要治療方法，但大多數(shù)患者對治療不敏感。因此，迫切需要開發(fā)高效低毒的新藥。

唇形科(labiatae)香茶菜屬(isodon)植物是我國民間廣泛使用的中草藥，該屬植物以全草或根入藥，具有清熱利濕、活血散瘀、解毒消腫等功效，富含結(jié)構(gòu)多樣的活性二萜類化合物。溪黃草(isodonserra(maxim.)hara)屬唇形科(labiatae)香茶菜屬(isodon)，又名熊膽草、血風(fēng)草，俗稱土黃連，主產(chǎn)于長江以南的廣東、江浙等省區(qū)，常成叢生于山坡、溪旁，海拔120-1250米。根或全草入藥，具有清熱利濕、退黃祛濕、涼血散瘀的功效，用于治療急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎、痢疾、腸炎、跌打瘀痛等病癥。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了細(xì)錐香茶菜乙素在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的功能可為如下a1)至a16)中的至少一種：

a1)抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖；a2)抑制食管鱗癌細(xì)胞的克隆形成；a3)影響食管鱗癌細(xì)胞周期進(jìn)程；a4)誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞周期阻滯；a5)抑制食管鱗癌細(xì)胞的dna修復(fù)；a6)誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡；a7)上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)量；a8)上調(diào)cleaved-caspase-9的表達(dá)量；a9)上調(diào)cleaved-caspase-3的表達(dá)量；a10)上調(diào)cleaved-parp的表達(dá)量；a11)抑制細(xì)胞存活通路；a12)抑制akt信號(hào)通路；a13)抑制nf-κb信號(hào)通路；a14)抑制食管鱗癌細(xì)胞引起的腫瘤的生長；a15)預(yù)防食管鱗癌；a16)治療食管鱗癌。

細(xì)錐香茶菜乙素的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。細(xì)錐香茶菜乙素的應(yīng)用可為如下a1)至a16)中的至少一種：

a1)抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖；a2)抑制食管鱗癌細(xì)胞的克隆形成；a3)影響食管鱗癌細(xì)胞周期進(jìn)程；a4)誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞周期阻滯；a5)抑制食管鱗癌細(xì)胞的dna修復(fù)；a6)誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡；a7)上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)量；a8)上調(diào)cleaved-caspase-9的表達(dá)量；a9)上調(diào)cleaved-caspase-3的表達(dá)量；a10)上調(diào)cleaved-parp的表達(dá)量；a11)抑制細(xì)胞存活通路；a12)抑制akt信號(hào)通路；a13)抑制nf-κb信號(hào)通路；a14)抑制食管鱗癌細(xì)胞引起的腫瘤的生長；a15)預(yù)防食管鱗癌；a16)治療食管鱗癌。。

上述應(yīng)用中，所述食管鱗癌細(xì)胞具體可為kyse30細(xì)胞。

上述應(yīng)用中，所述食管鱗癌細(xì)胞具體可為kyse450細(xì)胞。

上述應(yīng)用中，所述a3)或a4)中，所述細(xì)胞周期為g2/m期。

上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品可為藥物。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)品。

本發(fā)明所提供的產(chǎn)品，含有細(xì)錐香茶菜乙素；所述產(chǎn)品的功能可為如下a1)至a16)中的至少一種：

a1)抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖；a2)抑制食管鱗癌細(xì)胞的克隆形成；a3)影響食管鱗癌細(xì)胞周期進(jìn)程；a4)誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞周期阻滯；a5)抑制食管鱗癌細(xì)胞的dna修復(fù)；a6)誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡；a7)上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)量；a8)上調(diào)cleaved-caspase-9的表達(dá)量；a9)上調(diào)cleaved-caspase-3的表達(dá)量；a10)上調(diào)cleaved-parp的表達(dá)量；a11)抑制細(xì)胞存活通路；a12)抑制akt信號(hào)通路；a13)抑制nf-κb信號(hào)通路；a14)抑制食管鱗癌細(xì)胞引起的腫瘤的生長；a15)預(yù)防食管鱗癌；a16)治療食管鱗癌。

上述產(chǎn)品中，所述食管鱗癌細(xì)胞具體可為kyse30細(xì)胞。

上述產(chǎn)品中，所述食管鱗癌細(xì)胞具體可為kyse450細(xì)胞。

上述產(chǎn)品中，所述a3)或a4)中，所述細(xì)胞周期為g2/m期。

所述產(chǎn)品可為藥物。

上述任一所述cleaved-caspase-9的geneid為842。

上述任一所述cleaved-caspase-3的geneid為836。

上述任一所述cleaved-parp的geneid為142。

上述任一所述細(xì)錐香茶菜乙素可為式(ⅰ)的化合物。

上述任一所述細(xì)錐香茶菜乙素可為溪黃草提取物。

上述任一所述細(xì)錐香茶菜乙素可為溪黃草酮提物。所述酮具體可為丙酮。

所述溪黃草酮提物的制備方法可包括如下步驟：以溪黃草的地上部分為原料，依次進(jìn)行丙酮浸泡、乙酸乙酯萃取、硅膠色譜柱分析、薄層色譜法檢測、mci脫色、甲醇洗脫和重結(jié)晶。

所述“丙酮浸泡”具體可為采用丙酮水溶液進(jìn)行浸泡。所述丙酮水溶液具體可為70％(v/v)丙酮水溶液。所述“丙酮浸泡”中，丙酮水溶液與原料的配比可為6kg：20l。所述“丙酮浸泡”的時(shí)間具體可為3d。為了增加產(chǎn)率，可多次重復(fù)浸泡后再混合。

所述制備方法中，具體可將所述“丙酮浸泡”得到的浸泡液減壓蒸餾(目的為回收丙酮)，然后將得到的提取液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。

所述“乙酸乙酯萃取”中，所述提取液和乙酸乙酯的體積配比可為1:3。

所述“硅膠色譜柱分析”中，具體可使用填充有80-100目孔徑硅膠的硅膠色譜柱分析。

所述“薄層色譜法檢測”具體可為用薄層色譜法檢測，合并相同部分，得到7個(gè)餾分，然后將餾分二依次進(jìn)行mci脫色、甲醇洗脫和重結(jié)晶。

所述“甲醇洗脫”具體可為采用甲醇水溶液進(jìn)行洗脫。所述甲醇水溶液具體可為90％(v/v)甲醇水溶液。

所述“重結(jié)晶”具體可為甲醇溶解重結(jié)晶。

獲得細(xì)錐香茶菜乙素的步驟具體可如下：

(1)將溪黃草的地上部分進(jìn)行粉碎(篩網(wǎng)目數(shù)：8目)，得到粒度小于0.25cm的原料。

(2)完成步驟(1)后，取原料，加入70％(v/v)丙酮水溶液進(jìn)行浸泡，浸泡分別進(jìn)行三次，每次浸泡時(shí)間為3d，分別得到浸泡液1、浸泡液2和浸泡液3。

(3)完成步驟(2)后，分別將浸泡液1、浸泡液2和浸泡液3減壓蒸餾(目的為回收丙酮)，依次得到提取液1、提取液2和提取液3。

(4)完成步驟(3)后，分別向提取液1、提取液2和提取液3中按體積比為1：3加入乙酸乙酯，進(jìn)行萃取，依次得到乙酸乙酯提取物1、乙酸乙酯提取物2和乙酸乙酯提取物3。

(5)完成步驟(4)后，使用填充有80-100目孔徑硅膠的硅膠色譜柱分析乙酸乙酯提取物1、乙酸乙酯提取物2或乙酸乙酯提取物3。

(6)完成步驟(5)后，先用薄層色譜法檢測，合并相同部分，得到7個(gè)餾分；然后將餾分二依次進(jìn)行mci脫色、90％(v/v)甲醇水溶液洗脫和甲醇溶解重結(jié)晶，得到的固體物質(zhì)即為細(xì)錐香茶菜乙素。

實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)錐香茶菜乙素可抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖、抑制食管鱗癌細(xì)胞的克隆形成、影響食管鱗癌細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞周期阻滯、抑制食管鱗癌細(xì)胞的dna修復(fù)、誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡、上調(diào)cleaved-caspase-9的表達(dá)量、上調(diào)cleaved-caspase-3的表達(dá)量、上調(diào)cleaved-parp的表達(dá)量、抑制akt信號(hào)通路、抑制nf-κb信號(hào)通路和抑制食管鱗癌細(xì)胞引起的腫瘤的生長，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為細(xì)錐香茶菜乙素的¹h-nmr譜。

圖2為細(xì)錐香茶菜乙素的¹³c-nmr譜。

圖3為細(xì)錐香茶菜乙素的hr-esims譜。

圖4為實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖5為實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖6為實(shí)施例4步驟一的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖7為實(shí)施例4步驟二的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖8為實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖9為實(shí)施例6步驟2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖10為實(shí)施例6步驟3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖11為實(shí)施例6步驟4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖12為實(shí)施例6步驟5和6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

kyse30細(xì)胞和kyse450細(xì)胞均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供。經(jīng)過str鑒定，kyse30細(xì)胞和kyse450細(xì)胞均符合日本細(xì)胞庫(jcrb)提供的str位點(diǎn)譜。

結(jié)晶紫為碧云天公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為c0121。細(xì)胞周期檢測試劑盒為江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為kga512。cck8為同仁化學(xué)研究所的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為ck04。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(商品名稱為：annexinv，fitcapoptosisdetectionkit)為同仁化學(xué)研究所的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為556547。無胸腺裸鼠為華阜康公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為no.11401300035372。dnadamageantibodysamplerkit、cdc25cantibodysamplerkit、cdc2antibody、phospho-cdc2antibody、cyclinb1antibody、gapdhantibody、apoptosisantibodysamplerkit、caspase8antibody、baxantibody、bcl-2antibody、phospho-aktpathwayantibodysamplerkit和nf-κbpathwayantibodysamplerkit均為cellsignalingtechnology公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為#9947、#9555、#9112、#4539、#4138、#5174、#9915、#9746、#2772、#2870、#9916和#9936。

使用dmso配制濃度分別為0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、4mm、6mm、8mm和10mm的細(xì)錐香茶菜乙素母液，用1640完全培養(yǎng)液將上述濃度的細(xì)錐香茶菜乙素母液分別稀釋1000倍，得到dmso含量均為0.1％(v/v)、細(xì)錐香茶菜乙素濃度為0.5μm的細(xì)錐香茶菜乙素溶液1、濃度為1μm的細(xì)錐香茶菜乙素溶液2、濃度為1.5μm的細(xì)錐香茶菜乙素溶液3、濃度為2μm的細(xì)錐香茶菜乙素溶液4、濃度為2.5μm的細(xì)錐香茶菜乙素溶液5、濃度為3μm的細(xì)錐香茶菜乙素溶液6、濃度為4μm的細(xì)錐香茶菜乙素溶液7、濃度為6μm的細(xì)錐香茶菜乙素溶液8、濃度為8μm的細(xì)錐香茶菜乙素溶液9和濃度為10μm的細(xì)錐香茶菜乙素溶液10。

實(shí)施例1、制備細(xì)錐香茶菜乙素(rabdocoestinb)

細(xì)錐香茶菜乙素的結(jié)構(gòu)式如式(ⅰ)所示，制備細(xì)錐香茶菜乙素的步驟如下：

1、將6kg市售的溪黃草的地上部分進(jìn)行粉碎(篩網(wǎng)目數(shù)：8目)，得到粒度小于0.25cm的原料。

2、完成步驟1后，取原料，加入20l70％(v/v)丙酮水溶液進(jìn)行浸泡，浸泡分別進(jìn)行三次，每次浸泡時(shí)間為3d，分別得到浸泡液1、浸泡液2和浸泡液3。

3、完成步驟2后，分別將浸泡液1、浸泡液2和浸泡液3減壓蒸餾(目的為回收丙酮)，依次得到提取液1、提取液2和提取液3。

4、完成步驟3后，分別向提取液1、提取液2和提取液3中按體積比為1：3加入乙酸乙酯，進(jìn)行萃取，依次得到乙酸乙酯提取物1、乙酸乙酯提取物2和乙酸乙酯提取物3。

5、完成步驟4后，使用填充有80-100目孔徑硅膠的硅膠色譜柱分離乙酸乙酯提取物1、乙酸乙酯提取物2或乙酸乙酯提取物3。流動(dòng)相由氯仿(a)和丙酮(b)組成，流速為1000ml/min，使用以下梯度洗脫條件：在0～1h內(nèi)，流動(dòng)相為純氯仿洗脫；在1h～3h內(nèi)，用由氯仿和丙酮按照9:1的體積比混合得到的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫；在3h～10h內(nèi)，用由氯仿和丙酮按照8:2的體積比混合得到的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫；在10h～15h內(nèi)，用由氯仿和丙酮按照7:3的體積比混合得到的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫；在15h～18h內(nèi)，用由氯仿和丙酮按照6:4的體積比混合得到的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫；在18h～19h內(nèi)，用由氯仿和丙酮按照5:5的體積比混合得到的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫；在19h～20h內(nèi)，流動(dòng)相為純丙酮洗脫。進(jìn)行線性梯度洗脫檢測波長為254nm。

6、完成步驟5后，先用薄層色譜法檢測，合并相同部分，得到7個(gè)餾分；然后將餾分二依次進(jìn)行mci脫色、90％(v/v)甲醇水溶液洗脫和甲醇溶解重結(jié)晶，得到固體物質(zhì)。

將該固體物質(zhì)分別進(jìn)行¹h-nmr譜、¹³c-nmr譜和hr-esims譜檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果依次見圖1、圖2和圖3。

該固體物質(zhì)的的核磁數(shù)據(jù)如下：

白色無定形粉末；

c22h30o6；

positivehresims[m+na]⁺m/z413.1934(calcdforc22h30o6na，413.1935)；

¹hnmr(c5d5n，600mhz)：δh6.29and5.43(each1h，brs，h2-17)，5.31(1h，brs，h-14α)，4.78(1h，dd，11.4，5.2，h-1β)，4.57and4.48(each1h，d，10.1，h2-20)，2.02(3h，s，oac)，1.08and0.70(each3h，s，me-18，19)；

¹³cnmr(c5d5n，600mhz)，δc73.7(d,c-1)，25.9(t，c-2)，38.4(t，c-3)，34.2(s，c-4)，49.1(d，c-5)，31.39(t，c-6)，98.6(s，c-7)，59.7(s，c-8)，53.0(d，c-9)，39.9(s，c-10)，18.9(t，c-11)，33.0(t，c-12)，43.6(d，c-13)，76.5(d，c-14)，204.4(s，c-15)，154.0(s，c-16)，117.4(t，c-17)，31.8(q，c-18)，21.8(q，c-19)，64.2(t，c-20)，170.5(s，aco-1)，21.8(q，aco-1)

上述結(jié)果表明，通過上述步驟制備的固體物質(zhì)為細(xì)錐香茶菜乙素。獲得的細(xì)錐香茶菜乙素為8.0g，得率約為0.133％。

實(shí)施例2、細(xì)錐香茶菜乙素對食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性

一、細(xì)錐香茶菜乙素抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖

1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100u/ml)青霉素和1％(100μg/ml)鏈霉素的改良型rpmi-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞(kyse30細(xì)胞或kyse450細(xì)胞)至對數(shù)增殖期，然后消化重懸，得到濃度為2×10⁴個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液。

2、取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100μl步驟1獲得的細(xì)胞懸浮液(每孔約2000個(gè)細(xì)胞)，細(xì)胞貼壁后換液為100μl細(xì)錐香茶菜乙素溶液(細(xì)錐香茶菜乙素溶液1、細(xì)錐香茶菜乙素溶液2、細(xì)錐香茶菜乙素溶液3、細(xì)錐香茶菜乙素溶液4、細(xì)錐香茶菜乙素溶液5、細(xì)錐香茶菜乙素溶液6、細(xì)錐香茶菜乙素溶液7、細(xì)錐香茶菜乙素溶液8或細(xì)錐香茶菜乙素溶液9)，5％co2、37℃培養(yǎng)12h、24h、48h或72h；然后每孔加入100μl含10％(10μl/1ml)cck8的1640完全培養(yǎng)液，采用酶標(biāo)儀檢測在450nm處的吸光值。

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中設(shè)置陰性對照孔，每個(gè)陰性對照孔加入100μl步驟1所得細(xì)胞懸液，即每孔約2000細(xì)胞。陰性對照組待細(xì)胞貼壁后換液為100μl含0.1％dmso(v/v)的1640完全培養(yǎng)液(與細(xì)錐香茶菜乙素溶液同一時(shí)間點(diǎn)換液)，5％co2、37℃培養(yǎng)12h、24h、48h或72h；然后每孔加入100μl含10％(10μl/1ml)cck8的1640完全培養(yǎng)液，采用酶標(biāo)儀檢測陰性對照孔在450nm處的吸光值。

以細(xì)錐香茶菜乙素在孔中的濃度為橫坐標(biāo)，相對活性為縱坐標(biāo)，比較細(xì)錐香茶菜乙素處理后待測細(xì)胞的增殖程度。相對活性根據(jù)下述公式計(jì)算：

相對活性(％)＝(細(xì)錐香茶菜乙素溶液處理組在450nm處的吸光值-無細(xì)胞空白對照組在450nm處的吸光值)/(陰性對照組在450nm處的吸光值-無細(xì)胞空白對照組在450nm處的吸光值)×100％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)錐香茶菜乙素可顯著抑制kyse30細(xì)胞和kyse450細(xì)胞的增殖，ic50分別為1.56μm和1.94μm(圖4中a，左圖為kyse30細(xì)胞，右圖為kyse450細(xì)胞)；細(xì)錐香茶菜乙素對kyse30細(xì)胞和kyse450細(xì)胞的生長抑制呈劑量和時(shí)間依賴性(圖4中b為kyse30細(xì)胞，左圖為線性圖，右圖為柱狀圖；圖4中c為kyse450細(xì)胞，左圖為線性圖，右圖為柱狀圖)。

二、細(xì)錐香茶菜乙素抑制食管鱗癌細(xì)胞的克隆形成

1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100u/ml)青霉素和1％(100μg/ml)鏈霉素的改良型rpmi-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞(kyse30細(xì)胞或kyse450細(xì)胞)至對數(shù)增殖期，然后消化重懸，得到濃度為1×10⁴個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液。

2、取6孔板，每孔加入1950μl1640完全培養(yǎng)液和50μl步驟1獲得的細(xì)胞懸浮液(每孔約500個(gè)細(xì)胞)，5％co2、37℃培養(yǎng)12h。

3、完成步驟2后，取所述6孔板，棄液相，加入2ml細(xì)錐香茶菜乙素溶液(細(xì)錐香茶菜乙素溶液1或細(xì)錐香茶菜乙素溶液2)，5％co2、37℃培養(yǎng)24h。

4、完成步驟3后，取所述6孔板，棄液相，加入2ml1640完全培養(yǎng)液，5％co2、37℃培養(yǎng)7d。

5、完成步驟4后，將采用結(jié)晶紫染色，觀察集落數(shù)目及大小。

按照上述步驟，將步驟3中的“細(xì)錐香茶菜乙素溶液”替換為含0.1％(v/v)dmso的1640完全培養(yǎng)液，其它步驟均不變中，作為對照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4中d(左圖為生長狀態(tài)，右圖為集落數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果，control為對照)。結(jié)果表明，與對照相比，細(xì)錐香茶菜乙素溫育24h后，kyse30細(xì)胞和kyse450細(xì)胞形成的集落數(shù)目明顯減少，面積也較??；細(xì)錐香茶菜乙素的濃度越高，kyse30細(xì)胞和kyse450細(xì)胞形成的集落數(shù)目越少。

上述結(jié)果表明，細(xì)錐香茶菜乙素對食管鱗癌細(xì)胞(如kyse30細(xì)胞、kyse450細(xì)胞)具有顯著的細(xì)胞毒性。

實(shí)施例3、細(xì)錐香茶菜乙素抑制食管鱗癌細(xì)胞的dna修復(fù)

一、細(xì)錐香茶菜乙素影響食管鱗癌細(xì)胞周期進(jìn)程

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值，每次重復(fù)的步驟如下：

1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100u/ml)青霉素和1％(100μg/ml)鏈霉素的改良型rpmi-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞(kyse30細(xì)胞或kyse450細(xì)胞)至對數(shù)增殖期，然后消化重懸，得到濃度為5×10⁴個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液。取培養(yǎng)皿(規(guī)格為6cm)，加入4ml細(xì)胞懸浮液(即每培養(yǎng)皿鋪有2×10⁵個(gè)細(xì)胞)，5％co2、37℃培養(yǎng)12h。

2、完成步驟1后，取所述培養(yǎng)皿，棄液相，加入4ml無血清培養(yǎng)液1640，5％co2、37℃培養(yǎng)12h(饑餓培養(yǎng)，目的為使細(xì)胞同步化)。

3、取完成步驟2的細(xì)胞，棄液相，加入4ml細(xì)錐香茶菜乙素溶液(細(xì)錐香茶菜乙素溶液6或細(xì)錐香茶菜乙素溶液8)，5％co2、37℃培養(yǎng)24h。

4、完成步驟3后，離心，收集沉淀。

5、取步驟4收集的沉淀，加入70％(v/v)乙醇水溶液，置于4℃固定12h；然后采用細(xì)胞周期檢測試劑盒染色，最后用流式細(xì)胞儀檢測g2/m期細(xì)胞、s期細(xì)胞、g0/g1期細(xì)胞的百分比。

按照上述步驟，將步驟3中的“細(xì)錐香茶菜乙素溶液”替換為含0.1％(v/v)dmso的1640完全培養(yǎng)液，其它步驟均不變中，作為對照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5中a(control為對照)。結(jié)果表明，與對照相比，細(xì)錐香茶菜乙素處理的g2/m期食管鱗癌細(xì)胞(如kyse30細(xì)胞、kyse450細(xì)胞)的百分比顯著增加，且細(xì)錐香茶菜乙素濃度越高，則百分比越高。因此，細(xì)錐香茶菜乙素可影響食管鱗癌細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯。

二、細(xì)錐香茶菜乙素抑制食管鱗癌細(xì)胞的dna修復(fù)

1、同步驟一中1。

2、取完成步驟1的細(xì)胞，棄液相，加入4ml細(xì)錐香茶菜乙素溶液(細(xì)錐香茶菜乙素溶液4、細(xì)錐香茶菜乙素溶液7、細(xì)錐香茶菜乙素溶液8、細(xì)錐香茶菜乙素溶液9或細(xì)錐香茶菜乙素溶液10)，5％co2、37℃培養(yǎng)24h。

3、完成步驟2后，提取細(xì)胞總蛋白并檢測蛋白濃度。

4、完成步驟3后，將細(xì)胞總蛋白進(jìn)行westernblot(采用dnadamageantibodysamplerkit檢測γh2ax、p-chk2、p-chk1、p-atm、p-atr和p-brca1，采用cdc25cantibodysamplerkit檢測cdc25c和p-cdc25c，采用cdc2antibody檢測cdc2，采用phospho-cdc2antibody檢測p-cdc2，采用cyclinb1antibody檢測cyclinb1，采用gapdhantibody檢測gapdh)。

按照上述步驟，將步驟2中的“細(xì)錐香茶菜乙素溶液”替換為含0.1％(v/v)dmso的1640完全培養(yǎng)液，其它步驟均不變中，作為對照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5中b(control為對照)：隨著細(xì)錐香茶菜乙素濃度的增加，磷酸化組蛋白γh2ax也顯著增加，γh2ax在dna雙鏈斷裂造成的損傷反應(yīng)中起重要作用，是一種dna損傷標(biāo)志物，γh2ax的升高表明細(xì)錐香茶菜乙素作用后造成了細(xì)胞dna的損傷；g2/m期檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白p-chk2的表達(dá)量隨細(xì)錐香茶菜乙素濃度增加而增加，p-chk1先升高而后降低；細(xì)胞周期蛋白cdc25c和p-cdc25c的表達(dá)隨著chk1/2激活的增加而減少；cdc2的總量、p-cdc2以及cyclinb1的表達(dá)量，均隨細(xì)錐香茶菜乙素的濃度增加而遞降。結(jié)果表明細(xì)錐香茶菜乙素造成的dna損傷激活了chk1/2，而活化的chk1/2抑制了cdc25c的功能；由于cdc2是cdc25c的作用靶點(diǎn)，cdc25c的失活抑制了cdc2功能，從而防止不成熟有絲分裂的發(fā)生。此外，cyclinb1的表達(dá)同樣受到細(xì)錐香茶菜乙素抑制，加強(qiáng)了g2/m期停滯作用。因此，細(xì)錐香茶菜乙素導(dǎo)致食管鱗癌細(xì)胞dna損傷，誘導(dǎo)了g2/m期阻滯，并且抑制食管鱗癌細(xì)胞dna修復(fù)。

實(shí)施例4、細(xì)錐香茶菜乙素誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡

一、細(xì)錐香茶菜乙素誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡

1、同實(shí)施例3步驟一中1。

2、取完成步驟1的細(xì)胞，棄液相，加入4ml細(xì)錐香茶菜乙素溶液(細(xì)錐香茶菜乙素溶液7或細(xì)錐香茶菜乙素溶液9)，5％co2、37℃培養(yǎng)24h或48h。

3、完成步驟2后，離心，收集沉淀。

4、完成步驟3后，取沉淀，先用ph7.4、10mm的pbs緩沖液清洗兩遍，然后用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒染色，最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。

按照上述步驟，將步驟2中的“細(xì)錐香茶菜乙素溶液”替換為含0.1％(v/v)dmso的1640完全培養(yǎng)液，其它步驟均不變中，作為對照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6(control和dmso均為對照)。結(jié)果表明，與對照相比，細(xì)錐香茶菜乙素處理的食管鱗癌細(xì)胞(如kyse30細(xì)胞、kyse450細(xì)胞)發(fā)生凋亡的比例顯著增加，且細(xì)錐香茶菜乙素濃度越高，則發(fā)生凋亡的比例越高。因此，細(xì)錐香茶菜乙素可誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡。

二、檢測凋亡相關(guān)蛋白的變化

已有研究表明，cleaved-caspase-9(geneid：842；以下簡稱c-cas9)、cleaved-caspase-3(geneid：836；以下簡稱c-cas3)、cleaved-caspase-8(geneid：841；以下簡稱c-cas8)、cleaved-parp(geneid：142；以下簡稱parp)和bax(geneid：581)均為促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白；bcl-2(geneid：596)為抑制細(xì)胞凋亡蛋白。

1、同實(shí)施例3步驟二中1。

2、同實(shí)施例3步驟二中2。

3、同實(shí)施例3步驟二中3。

4、完成步驟3后，將細(xì)胞總蛋白進(jìn)行westernblot(采用apoptosisantibodysamplerkit檢測parp、c-cas9和c-cas3，采用caspase8antibody檢測c-cas8，采用baxantibody檢測bax，采用bcl-2antibody檢測bcl-2，采用gapdhantibody檢測gapdh)。

按照上述步驟，將步驟2中的“細(xì)錐香茶菜乙素溶液”替換為含0.1％(v/v)dmso的1640完全培養(yǎng)液，其它步驟均不變中，作為對照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7(dmso為對照)。結(jié)果表明，隨著細(xì)錐香茶菜乙素濃度的不斷提高，cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-parp的表達(dá)量均不斷上升，cleaved-caspase-8和bcl-2幾乎不表達(dá)，bax的表達(dá)量無明顯變化。因此，細(xì)錐香茶菜乙素通過caspase-9依賴性內(nèi)源性凋亡通路導(dǎo)致食管鱗癌細(xì)胞凋亡，并且是bax和bcl-2非依賴性的。

實(shí)施例5、細(xì)錐香茶菜乙素抑制akt信號(hào)通路和nf-κb信號(hào)通路

akt信號(hào)通路和nf-κb信號(hào)通路是細(xì)胞存活的兩個(gè)關(guān)鍵通路。因此，需要檢測細(xì)錐香茶菜乙素對akt信號(hào)通路和nf-κb信號(hào)通路的影響。

1、同實(shí)施例3步驟二中1。

2、同實(shí)施例3步驟二中2。

3、同實(shí)施例3步驟二中3。

4、完成步驟3后，將細(xì)胞總蛋白進(jìn)行westernblot(采用phospho-aktpathwayantibodysamplerkit檢測akt和p-akt，采用nf-κbpathwayantibodysamplerkit檢測ikkα、ikkβ、p-ikkα/β、iκbα、p-iκbα、nf-κb、p-nf-κb，采用gapdhantibody檢測gapdh)。

按照上述步驟，將步驟2中的“細(xì)錐香茶菜乙素溶液”替換為含0.1％(v/v)dmso的1640完全培養(yǎng)液，其它步驟均不變中，作為對照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8(control為對照)。結(jié)果表明，細(xì)錐香茶菜乙素可以抑制akt信號(hào)通路和nf-κb信號(hào)通路：細(xì)錐香茶菜乙素抑制akt信號(hào)通路主要通過抑制位點(diǎn)ser473的磷酸化發(fā)揮作用的，其使akt磷酸化水平(ser473位點(diǎn))明顯減少而總akt量出現(xiàn)輕度下降；細(xì)錐香茶菜乙素顯著抑制nf-κb通路主要是引起作為nf-κb信號(hào)激活子的ikkα和ikkβ表達(dá)量減少，而作為nf-κb信號(hào)抑制子的iκbα隨著細(xì)錐香茶菜乙素濃度的增加而增加(其它分子(如p-ikkα/β、p-iκbα、nf-κb、p-nf-κb)的表達(dá)水平保持不變)。因此，細(xì)錐香茶菜乙素抑制可抑制akt信號(hào)通路和nf-κb信號(hào)通路，驅(qū)動(dòng)食管鱗癌細(xì)胞(如kyse30細(xì)胞、kyse450細(xì)胞)跨越凋亡閾值，導(dǎo)致食管鱗癌細(xì)胞凋亡。

實(shí)施例6、細(xì)錐香茶菜乙素抑制食管鱗癌小鼠異種移植物模型中的腫瘤生長

1、將30只3-4周齡體重為13～17g的健康無胸腺裸鼠隨機(jī)分成細(xì)錐香茶菜乙素組、順鉑(ddp)組和對照組(每組10只)，分別進(jìn)行如下處理：

細(xì)錐香茶菜乙素組：首先每只無胸腺裸鼠皮下移植1.2×10⁶個(gè)kyse30細(xì)胞，移植后第9天開始腹腔注射細(xì)錐香茶菜乙素，以后隔天繼續(xù)腹腔注射細(xì)錐香茶菜乙素，直至上述三組中任一只無胸腺裸鼠的腫瘤生長至2000mm³停止注射。注射劑量均為12mg細(xì)錐香茶菜乙素/kg無胸腺裸鼠。

順鉑組：首先每只無胸腺裸鼠皮下移植1.2×10⁶個(gè)kyse30細(xì)胞，移植后第9天開始腹腔注射順鉑，以后隔天繼續(xù)腹腔注射順鉑，直至上述三組中任一只無胸腺裸鼠的腫瘤生長至2000mm³停止注射(討論：同上)。注射劑量均為2mg順鉑/kg無胸腺裸鼠。

對照組：首先每只無胸腺裸鼠皮下移植1.2×10⁶個(gè)kyse30細(xì)胞，移植后第9天開始，腹腔注射0.1％的pluronicf68溶劑(0.1％的pluronicf68溶劑為f-68原液使用無菌超純水稀釋100倍得到的；f-68，10％(100x)，貨號(hào)：24040032，thermo)，以后隔天繼續(xù)腹腔注射pluronicf68溶劑，直至上述三組中任一只無胸腺裸鼠的腫瘤生長至2000mm³停止注射。注射劑量均為200μl。

2、完成步驟1后，測量各小鼠的腫瘤體積并按組取平均值；稱量各小鼠的腫瘤重量并按組取平均值；以注射時(shí)間為橫坐標(biāo)，平均腫瘤體積為縱坐標(biāo)，繪制腫瘤生長曲線。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9(a為各組小鼠處死時(shí)的狀態(tài)，b為各組小鼠的腫瘤組織，c為各組小鼠的腫瘤生長曲線，d為各組小鼠的平均腫瘤重量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；control為對照組，ddp為順鉑組，rabd-b為細(xì)錐香茶菜乙素組)：對照組的平均腫瘤體積從28.02±9.63mm³增加到1368.61±323.07mm³，細(xì)錐香茶菜乙素組的平均腫瘤體積從31.92±17.96mm³增加到564.44±115.84mm³，順鉑組的平均腫瘤體積從34.65±23.60mm³增加到595.54±141.33mm³；對照組的平均腫瘤重量為1.011±0.369g，細(xì)錐香茶菜乙素組的平均腫瘤重量為0.423±0.174g，順鉑組的平均腫瘤重量為0.376±0.119g。因此，細(xì)錐香茶菜乙素和順鉑均可有效抑制腫瘤生長，具有明顯腫瘤抑制活性。

3、完成步驟1后，測量各小鼠的體重并按組取平均值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10(control為對照組，ddp為順鉑組，rabd-b為細(xì)錐香茶菜乙素組)。結(jié)果表明，各組小鼠的體重沒有顯著的減少，各組無顯著差異。

4、完成步驟1后，對各小鼠的肝組織、腎組織和腫瘤組織進(jìn)行he染色。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11(control為對照組，ddp為順鉑組，rabd-b為細(xì)錐香茶菜乙素組)。結(jié)果表明，各組小鼠的肝組織和腎組織均無明顯損傷；細(xì)錐香茶菜乙素組和順鉑組的腫瘤組織中出現(xiàn)明顯的損傷性病理改變，如大空泡化，細(xì)胞碎片和壞死巢；對照組的腫瘤組織中彌漫活腫瘤細(xì)胞巢，沒有看到明顯細(xì)胞死亡現(xiàn)象。

5、完成步驟1后，按照deadendtmfluorometrictunelsystem(promega公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為g3250)的說明書的步驟對各小鼠的腫瘤組織進(jìn)行tunel信號(hào)檢測。tunel(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dutp末端標(biāo)記)用于標(biāo)記dna被切割的凋亡細(xì)胞，是固定組織中的細(xì)胞凋亡原位信號(hào)。

6、完成步驟1后，對各小鼠的腫瘤組織進(jìn)行ki67ihc檢測(ki-67是在增殖細(xì)胞中普遍表達(dá)的核非組蛋白，與腫瘤細(xì)胞增殖和生長密切相關(guān)，是一種常用的增殖標(biāo)志物)。具體步驟如下：取腫瘤組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，先經(jīng)0.01mol/l枸櫞酸緩沖液微波抗原修復(fù)15min；再加入3％(v/v)h2o2水溶液室溫孵育10min(目的為消除內(nèi)源性過氧化氫酶)，加入山羊血清室溫封閉30min，然后加入ki67特異性抗體(cellsignalingtechnology公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為#9027)孵育12h，最后采用通用型二步法檢測系統(tǒng)(中杉金橋，pv-9000)識(shí)別抗體并進(jìn)行信號(hào)放大，dab顯色。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖12(control為對照組，ddp為順鉑組，rabd-b為細(xì)錐香茶菜乙素組，fluo-12-dutp為凋亡信號(hào)標(biāo)志，dapi為細(xì)胞核染色，merge為凋亡信號(hào)與細(xì)胞核染色疊加合成的信號(hào))。結(jié)果表明，對照組中顯示出彌漫ki-67表達(dá)，并且無明顯tunel信號(hào)；細(xì)錐香茶菜乙素組和順鉑組中ki-67幾乎不表達(dá)，而呈現(xiàn)明顯的凋亡信號(hào)。